Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

En robust opdagelsesplatform til identifikation af nye mediatorer af melanommetastase

Published: March 8, 2022 doi: 10.3791/63186
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3,4, 2,5, 3,4, 1,2
1Department of Pathology, NYU Grossman School of Medicine, 2Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group, Perlmutter Cancer Center, 3Department of Radiology, NYU Grossman School of Medicine, 4Preclinical Imaging Core, NYU Grossman School of Medicine, 5Ronald Perelman Department of Dermatology, NYU Grossman School of Medicine

Summary

Denne artikel beskriver en arbejdsgang af teknikker, der anvendes til test af nye kandidatmediatorer af melanommetastase og deres virkningsmekanisme(r).

Abstract

Metastase er en kompleks proces, der kræver, at celler overvinder barrierer, der kun er ufuldstændigt modelleret af in vitro-assays . En systematisk arbejdsgang blev etableret ved hjælp af robuste, reproducerbare in vivo-modeller og standardiserede metoder til at identificere nye aktører i melanommetastase. Denne tilgang gør det muligt for dataslutning på specifikke eksperimentelle stadier præcist at karakterisere et gens rolle i metastase. Modeller etableres ved at indføre genetisk modificerede melanomceller via intrakardiale, intradermale eller subkutane injektioner i mus efterfulgt af overvågning med seriel in vivo-billeddannelse . Når forudbestemte endepunkter er nået, høstes og behandles primære tumorer og/eller metastasebærende organer til forskellige analyser. Tumorceller kan sorteres og udsættes for en hvilken som helst af flere 'omics' platforme, herunder enkeltcellet RNA-sekventering. Organer gennemgår billeddannelse og immunhistopatologiske analyser for at kvantificere den samlede byrde af metastaser og kortlægge deres specifikke anatomiske placering. Denne optimerede pipeline, herunder standardiserede protokoller til engraftment, overvågning, vævshøstning, behandling og analyse, kan vedtages til patientafledte, kortsigtede kulturer og etablerede humane og murine cellelinjer af forskellige faste kræfttyper.

Introduction

Den høje dødelighed forbundet med metastatisk melanom kombineret med en stigende forekomst af melanom på verdensplan1 (en anslået stigning på 7,86% inden 2025) kræver nye behandlingsmetoder. Fremskridt inden for målopdagelse afhænger af reproducerbare modeller af metastase, en meget kompleks proces. Gennem trinnene i den metastatiske kaskade skal melanomceller overvinde utallige barrierer for at opnå immunsystemets unddragelse og kolonisering af fjerne væv2. Melanomcellernes modstandsdygtighed og tilpasningsevne stammer fra en lang række faktorer, herunder deres høje genetiske mutationsbyrde3 og deres neurale kamoprindelse, som giver afgørende fænotypisk plasticitet 3,4,5. På hvert trin tillader transkriptionsprogrammer metastaserende melanomceller at skifte fra en tilstand til en anden baseret på signaler fra krydstale med mikromiljøet, der omfatter immunsystemet6, det ekstracellulære miljø 7,8 og den cellulære arkitektur af fysiske barrierer9, som de kommer i kontakt med. For eksempel undslipper melanomceller immunovervågning ved at nedregulere ekspressionen af vigtige immunprimende tumorudskilte faktorer6.

Undersøgelser beskriver en "præmetastatisk niche", hvor melanomceller udskiller kemokiner og cytokiner for at prime det fjerne "mål" organ til metastase10. Disse resultater rejser vigtige spørgsmål om organtropismen af metastatiske melanomceller og den anatomiske rute, de tager for at få adgang til fjerne væv. Efter intravasation er melanomceller kendt for at metastasere gennem lymfeknuder (lymfatisk spredning) og blodkar (hæmatogen spredning)2,11. Mens de fleste patienter er til stede med lokaliseret sygdom, præsenterer en lille delmængde af tilfælde med fjern metastatisk sygdom og ingen lymfatisk formidling (negativ lymfeknudeinddragelse)11, hvilket tyder på eksistensen af alternative metastatiske veje for melanom.

Når de koloniserer et metastatisk sted, gennemgår melanomceller epigenetiske og metaboliske tilpasninger12,13. For at få adgang til og invadere nye rum anvender melanomceller proteaser14 og cytoskeletale modifikationer 11,15, som gør det muligt for dem at krydse til og vokse på deres nye placering. Vanskeligheden ved at målrette mod melanomceller ligger i kompleksiteten og antallet af sådanne tilpasninger; feltet bør således gøre en indsats for eksperimentelt at genskabe så mange trin og tilpasninger som muligt. På trods af talrige fremskridt inden for in vitro-assays såsom organoider og 3D-kulturer 16,17 rekapitulerer disse modeller kun ufuldstændigt den metastatiske kaskade in vivo.

Murine-modeller har vist værdi ved at finde en balance mellem reproducerbarhed, teknisk gennemførlighed og simulering af sygdomme hos mennesker. Intravaskulært, ortotopisk og heterotopisk implanterede melanomceller fra patientafledte xenografter eller kortvarige kulturer til immunkompromitterede eller humaniserede mus repræsenterer rygraden i målopdagelsen i metastatisk melanom. Imidlertid mangler disse systemer ofte en afgørende biologisk begrænsning på metastase: immunsystemet. Syngeneiske melanommetastasemodeller, der besidder denne begrænsning, er relativt knappe på området. Disse systemer, der er udviklet i immunkompetente mus, herunder B16-F1018, YUMM-familien af cellelinjer19, SM120, D4M321, RIM322 eller for nylig RMS23 og M1 (Mel114433), M3 (HCmel1274), M4 (B2905)24 melanomcellelinjer, letter undersøgelsen af værtsimmunresponsets komplekse rolle i melanomprogression.

Her præsenteres en pipeline til identifikation af melanommetastasemål. Med stigende og større 'omics' datasæt, der genereres fra melanom patientkohorter, postulerer vi, at undersøgelser, der har det mest kliniske løfte, er dem, der stammer fra big data-integration, hvilket fører til omhyggelig funktionel og mekanistisk forhør 25,26,27,28. Ved at bruge musemodeller til at studere potentielle mål i den metastatiske proces kan man tage højde for in vivo-specifikke hændelser og vævsinteraktioner og dermed øge sandsynligheden for klinisk oversættelse. Flere metoder til at kvantificere metastatisk byrde er skitseret, hvilket giver supplerende data om resultaterne af et givet eksperiment. En protokol til enkeltcelleisolering fra tumorer i forskellige organer er beskrevet for at hjælpe den upartiske karakterisering af genekspression i metastatiske celler, som kan gå forud for enkeltcelle- eller bulk-RNA-sekventering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: De dyreforsøg, der er involveret i følgende protokol, blev godkendt af New York University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Alle procedurer udføres i faciliteter, der er godkendt af Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). Figur 1 viser den generelle eksperimentelle tilgang.

1. Patientafledt melanom kortvarige kulturer (STC'er)

  1. Vævet anbringes i en 60 mm petriskål med 1 ml komplet RPMI (RPMI 1640 suppleret med 10 % føtalt kvægserum (FBS), 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 1x MEM ikke-essentielle aminosyrer og penicillin (100 IE/ml)/streptomycin (100 μg/ml)).
    BEMÆRK: For at øge forholdet mellem tumorceller, om nødvendigt, dissekeres og fjernes vævet omkring tumoren i petriskålen under et mikroskop ved hjælp af sterile kirurgiske instrumenter.
  2. Skær det friske væv fint ved hjælp af steriliserede barberblade i 1-2 mm terninger. Tilsæt 4 ml komplet RPMI og pipetter pladens indhold op og ned 5-10 gange med en 10 ml serologisk pipette.
  3. Overfør cellesuspensionen til et 15 ml polypropylen konisk rør og drej cellerne ned (180 × g i 5 minutter ved 4 °C). Aspirer supernatanten, resuspend cellepillen i 1 ml frisk medium, og overfør suspensionen til en 25 cm2 vævskulturkolbe.
  4. For at hjælpe vævsfragmenterne med at fastgøre sig til bunden indstilles kolben vippet i en vinkel på 20-30° i en vævskulturinkubator ved 37 °C og 5 % CO2 i 20 minutter.
  5. Kolben lægges fladt ned, så mediet kan dække vævet, og kontrollér dagligt kulturens status. Opdel cellerne, når de når 90-100% sammenløb. Oprethold kortsigtede kulturer ved et "lavt" passagenummer.
    BEMÆRK: STC'er vil blive etableret ca. 2 måneder efter celleisolering og dyrkning, selvom den faktiske tidslinje varierer mellem prøver og tumortyper. Efter 10 til 14 passager når cellelinjerne 100% renhed, der kun indeholder melanomceller29. Passagetaltærsklen bestemmes empirisk ved at observere ændringer i cellemorfologi, fordobling af tid og adfærd in vivo. For at bevare heterogenitet og andre egenskaber ved modertumoren må du ikke opdele cellerne mere end 1:5.
  6. Ved etablering af en STC og med en hvilken som helst cellelinjemodel, der skal injiceres i dyr som beskrevet i efterfølgende trin, transduceres celler med en indberetter.
    BEMÆRK: Et fluorescerende mærke (f.eks. Rødt fluorescerende protein (RFP), grønt fluorescerende protein (GFP)) giver for eksempel mulighed for ex-vivo immunofluorescensbilleddannelse og sortering af tumorceller ved fluorescensaktiveret cellesortering (FACS). Luciferase muliggør in vivo bioluminescensbilleddannelse, et nyttigt værktøj til overvågning af eksperimentel progression (afsnit 4).

Figure 1
Figur 1: Skematisk illustration af den beskrevne arbejdsgang, fra integration af patientdata til generering og analyse af in vivo-data fra mus. Forkortelser: LOF = tab af funktion; GOF = gevinst af funktion. Klik her for at se en større version af denne figur.

2. Xenograft implantation

BEMÆRK: De eksperimentelle procedurer, der er beskrevet her, udføres hos mus, der har nedsat adaptivt og medfødt immunsystem, NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl / SzJ (NSG) mus; eller hos mus, der kun mangler adaptiv immunitet, såsom T-cellemangelfulde athymiske/nøgne (NU/J) mus. Dyrene er af mandligt køn, 8 til 10 uger. Kvinder udviser ofte en høj forekomst af gonadale metastaser ved intrakardiel injektion af tumorceller, hvilket reducerer deres overlevelse.

  1. Til subkutane og intradermale injektioner fremstilles en 1:1-cellesuspension ved at blande en del af cellerne suspenderet i 1x Dulbeccos fosfatbufrede saltvand (DPBS) med en del optøet ekstracellulært matrixsubstrat (EMS) og opbevares på is ved 4 °C. For intravaskulære (intrakardiale, intracarotid, retro-orbitale, halevene eller milt) injektioner suspenderes cellerne kun i DPBS.
    BEMÆRK: Det passende volumen til intradermale injektioner skal holdes så lavt som muligt (30 μL). Til subkutane injektioner kan det injicerede volumen gå op til 150 μL og til intravaskulære injektioner op til 250 μL (baseret på dyrets vægt). Tilsæt til den endelige cellesuspension 10-30% ekstra volumen injektor, baseret på den injicerede mængde og sprøjten, der bruges til at redegøre for det døde volumen inde i glidespidsen og nålens (f.eks. En 1 ml tuberkulinsprøjte med en 30 G, 25 mm nål har et dødt volumen på 100 μL).
  2. Gennemfør en pilot for at karakterisere opførelsen af de anvendte cellelinjer og tidslinjen for tumorprogression in vivo. For intradermale injektioner skal du starte med at injicere 1.000 op til 50.000 celler / 30 μL. Ved subkutane injektioner skal du starte med at injicere 10.000 op til 2 × 106 celler/150 μL. For intravaskulære (intrakardiale, intracarotid, retro-orbitale og milt) injektioner skal du starte med at injicere 50.000 celler / 150 μL.
    BEMÆRK: Intravaskulære injektioner prædisponerer dyrene for emoliske hændelser, enten ved at indføre luft i kredsløbssystemet eller ved at anvende et for stort antal celler, der okkluderer de små kar. Bland cellesuspensionen godt for at undgå klumpning. Prim sprøjten, inden du lægger cellesuspensionen. Fjern eventuelle luftbobler inde i sprøjten. Opbevar cellesuspensionen/sprøjterne på is indtil påfyldnings- og injektionstidspunktet.
  3. Administrer anæstesi ved indånding. Indstil iltniveauregulatoren mellem 1-2 L/min. Placer dyret i induktionskammeret med isofluranfordamperen indstillet til 2,5-5% til induktion og 1,5-3% til vedligeholdelse.
    BEMÆRK: Overvåg dyrets vejrtrækning og puls, mens du er i anæstesiinduktionsfasen. Forlad ikke dyret uden opsyn. Overvåg ikke mere end et dyr samtidigt. Titer mængden af anæstesi til dyrets vægt.
  4. Flyt dyret fra induktionskammeret ind i næsekeglen. Påfør steril petrolatum oftalmisk salve på dyrets øjne for at forhindre hornhindetørhed under proceduren.
  5. Barber procedurestedet med et lige barberblad vippet i en 30 ° vinkel. Rengør huden på procedureområdet med 70% isopropylalkoholpinde. Før yderligere trin skal du vurdere for et tilstrækkeligt niveau af anæstesi ved pedalrefleks.
  6. Ved intradermale injektioner skal du udføre hele proceduren inde i et biosikkerhedsskab for at opretholde aseptiske forhold.
    1. Anæstesi og barbere dyret som beskrevet i trin 2.3-2.5.
    2. Tag fat i og træk huden bagud mod nålestikkets bane. Ved hjælp af en 31 G insulinsprøjtenål, 6 mm lang, der holdes i en spids vinkel, punkteres forsigtigt huden med skråningen opad.
    3. Mærk trykfrigivelsen ved spidsen af nålen. Gå forsigtigt frem for at blive inde i det intradermale rum og ikke passere gennem hele huddybden ind i subcutis. Afgørende: Hvis man glider ind i det subkutane rum, skal du fjerne nålen, ændre injektionsområdet og indsætte nålen igen. Injicer hele volumenet (30 μL) af cellesuspension langsomt, indtil der observeres en kuppelformet wheal.
      BEMÆRK: Lave injektionsvolumener vil fremkalde mindre dissektion af hudlagene og mindre arkitektonisk forvrængning.
    4. Hold nålen inde og tæl til 5.
      BEMÆRK: EMS bliver tyktflydende ved kropstemperatur, hvilket hjælper med at undgå tilbageløb gennem nålepunkteringssåret.
    5. Fjern nålen og single-house dyret i et bur på en varm pude for at komme sig. Returner dyret til vivariumburet efter at have genvundet bevidstheden, når det er strengt og ambulant.
      BEMÆRK: Overvåg dyret kontinuerligt under alle de forsøg, der er beskrevet i denne protokol. Lad ikke dyret være uden opsyn eller overvåg mere end et dyr samtidigt.
    6. Overvåg udviklingen af tumorvækst, vægttab og generel sundhedsstatus i samarbejde med veterinærpersonale dagligt i den indledende vækstfase og mere intenst, hvis det er nødvendigt, efter at dyrene begynder at tabe sig. Under disse overvågningssessioner: veje dyrene og plotte et diagram for at overvåge vægttab og kontrollere tegn på tumorsårdannelse, neurologiske, lokomotoriske og / eller adfærdsmæssige tegn (sløvhed, manglende pleje, lavt føde- eller vandindtag).
      BEMÆRK: Afliv dyrene umiddelbart efter at have observeret tegn på avanceret sygdom (mere end 20% vægttab, en kropstilstandsscore på <2, ekstremt reducerede aktivitetsniveauer, lammelse eller anfald). Brug den eutanasimetode, der er godkendt af institutionens IACUC (f.eks. anvendes et automatiseret CO2 - kammer på bordpladen til at udsætte dyrene for CO2 i 15 minutter efterfulgt af en sekundær metode til eutanasi, enten cervikal dislokation, halshugning eller pneumothorax induceret bilateralt ved at skære brystkassen).
    7. Tag målinger med kalipre og brug tumorens længde (L) og bredde (W) dimensioner til at beregne volumenet (V) med formlen:
      Equation 1
  7. Til subkutane injektioner:
    1. Udfør hele proceduren inde i et biosikkerhedsskab for at opretholde aseptiske forhold26,27.
    2. Anæstesi og barbere dyret som beskrevet i trin 2.3-2.5.
    3. Ved hjælp af en 28 G til 31 G insulinsprøjtenål, 6 mm lang, holdt i en spids vinkel, punkteres forsigtigt huden med skråningen opad. Føl trykfrigivelsen ved spidsen af nålen to gange, mens du passerer gennem epidermis, dermis og hypodermis.
      BEMÆRK: Anden gang en trykudløsning mærkes ved spidsen af nålen, indikerer det, at det subkutane rum er nået.
    4. Injicer hele volumenet (30-150 μL) af cellesuspension langsomt, indtil der observeres en langstrakt ellipseformet wheal. Hold nålen inde og tæl til 5. Tæl til 10 for større mængder (mere end 50 μL).
      BEMÆRK: EMS bliver tyktflydende ved kropstemperatur, hvilket hjælper med at undgå tilbageløb gennem nålepunkteringssåret.
    5. Fjern nålen og single-house dyret i et bur på en varm pude for at komme sig. Returner dyret til sit vivariumbur efter at have genvundet bevidstheden, når det er strengt og ambulant.
      BEMÆRK: Under postproduktural overvågning skal du observere tegn på komplikationer (lav respirationsfrekvens, blødning, langsom genopretning) og adressere dem korrekt. Hvis der ikke observeres nogen forbedring, skal du fortsætte med humane eutanasiprocedurer, der er beskrevet i NOTE i trin 2.6.6.
    6. Overvåg dyret for tumorvækst, vægttab og generel sundhedsstatus som beskrevet i trin 2.6.6-2.6.7.
  8. Til intrakardiale injektioner:
    1. Udfør hele proceduren inde i et biosikkerhedsskab for at opretholde aseptiske forhold26,30.
    2. Anæstesi dyret som beskrevet i trin 2.3-2.4.
    3. Overfør dyret til ultralydsmaskinens opvarmede platform og fastgør det med allergivenligt tape til næsekeglen.
    4. Barber brystkassen med et lige barberblad vippet i en 30° vinkel. Rengør huden i procedureområdet med 3 anvendelser af 10% povidon-jod skiftevis med 3 anvendelser af isopropylalkohol.
    5. Før yderligere trin skal du vurdere for et tilstrækkeligt niveau af anæstesi ved pedalrefleks. Påfør ultralydgel på procedurestedet.
    6. Fang hjertevinduet med ultralydssonden. Placer ultralydssonden midt i brystkassen på venstre side af dyret for at fange et vandret vindue orienteret for at opnå et tværsnitsbillede (kort akse) af venstre ventrikel. For at sikre, at sondens lange akse vender opad, skal du fastgøre sonden i en 50 ° vinkel og den opvarmede platform i en 20 ° vinkel. Lås sonden og støtterammen på plads.
    7. Træk cellesuspensionen op, mens du arbejder inde i biosikkerhedsskabet i en tuberkulin 1 ml sprøjte med en 30 G, 25 mm nål. Fjern eventuelle luftbobler i sprøjten.
      BEMÆRK: Det er vigtigt at oprette og vedligeholde en enkeltcellesuspension, mens celler behandles og injiceres. Fjernelse af luftbobler er et vigtigt skridt for at undgå luftemboli. Et velprimet sprøjte-nålesystem forhindrer undgåelige dødsfald i den eksperimentelle gruppe. Træk altid mere volumen ind i sprøjten, end der vil blive injiceret. Det ekstra volumen hjælper med at fjerne luften ved at injicere noget af cellesuspensionen tilbage i et 1,5 ml rør.
    8. Lås sprøjten i den stereotaktiske injektor. Under ultralydsvejledning skal du fremme nålen gennem brystvæggen ind i hjertets venstre ventrikel. Injicer hele volumenet (100-250 μL) af cellesuspension langsomt.
    9. Fjern nålen og single-house dyret i et bur på en varm pude for at komme sig. Returner dyret til sit vivariumbur efter at have genvundet bevidstheden, når det er strengt og ambulant. Overvåg dyret for tumorvækst, vægttab og generel sundhedsstatus som beskrevet i trin 2.6.6.
  9. Til intracarotisinjektioner:
    1. Udfør hele proceduren på en korrekt desinficeret overflade for at hjælpe med at opretholde aseptiske forhold30.
    2. Anetisere dyret med en ketamin (100 mg/kg) og xylazin (10 mg/kg) cocktail ved intraperitoneal injektion med en insulinsprøjte, 28 G nål. Påfør steril petrolatum oftalmisk salve på dyrets øjne for at forhindre hornhindetørhed under proceduren.
    3. Barber procedureområdet med et lige barberblad vippet i en 30 ° vinkel. Før yderligere trin skal du vurdere for et tilstrækkeligt niveau af anæstesi ved pedalrefleks.
    4. Placer dyret under et stereomikroskop på en opvarmningspude. Rengør huden i procedureområdet med 3 anvendelser af 10% povidon-jod skiftevis med 3 anvendelser af isopropylalkohol.
    5. Påtag sterilt personligt beskyttelsesudstyr (PPE) og sterile handsker. Forbered det sterile felt ved at lægge en steril drapering over dyrets krop.
      BEMÆRK: Hvis den sterile drapering ikke har et hul, der passer til snittets størrelse og placering, skal du folde draperingen i to og bruge Metzenbaum-saksen til at skære hullet i passende størrelse midt i det sterile drapering.
    6. Brug en skalpel eller Iris saks til at skære huden fra halvdelen af halsen ned til brystbenet. Med to mikrokirurgiske tang skal du direkte dissekere de 2 submandibulære spytkirtler i midterlinjeplanet. Brug en elektrisk cautery til hæmostase, hvis det er nødvendigt.
    7. Dissekere fasciaen omkring den fælles halspulsåre (CCA) fra manubrium mod bifurcationen og fortsæt medialt for at frigøre den bageste væg i den ydre carotid. Klip den eksterne halspulsåre (ECA) midlertidigt, før den injiceres.
      BEMÆRK: Ved dissekering omkring omkredsen af CCA skal man sørge for ikke at beskadige vagusnerven (ligger lateralt til arterien).
    8. Læg cellesuspensionen i en 1 ml sprøjte med en 33 G, 15 mm nål.
    9. Pass to 7-0 ligaturer under CCA, og udfør en løs instrumentknude for hver af de to ligaturer. Brug en 5 mm, 10 G trykbeholderclips og klip ECA midlertidigt. Bind den proksimale ligatur; Bind derefter den distale ligatur løst (ved siden af bifurcationen af CCA). Brug den distale sløjfe senere til at kontrollere blødningen efter injektionen.
    10. Brug sprøjten med en 33 G, 15 mm nål til forsigtigt at punktere CCA med nålens skråning opad og i en spids vinkel. Injicer hele volumenet (50-150 μL) af cellesuspension langsomt.
    11. Tag fat i den distale løkke med tangen og løft den, mens du fjerner nålen for at okkludere CCA'ens lumen og stoppe blødningen. Udskift sprøjten med en #7 Jewelers tang og bind den distale løkke ned.
    12. Kast en anden instrumentknude på den distale ligatur, og fjern karklemmen fra ECA. Kontroller det kirurgiske felt for blødning og cauterize eventuelle blødende kar før lukning. Brug en 9 mm hæfteanordning til at lukke dyrets hud og læg dyret på en varm pude for at komme sig.
      BEMÆRK: Fjern hæfteklammerne 7-10 dage efter operationen.
    13. Administrere smertestillende medicin subkutant-Buprenorphin (0,3 mg/ml) hver 12. time i 72 timer efter operationen i en koncentration på 0,1 mg/kg.
      BEMÆRK: Alternativt kan du overveje at bruge en smertestillende medicin med forlænget frigivelse, som kræver 1 dosis hver 72. time.
    14. Returner dyret til sit vivariumbur efter at have genvundet bevidstheden, når det er strengt og ambulant. Overvåg dyrene postoperativt dagligt for tegn på infektion eller smerte på operationsstedet, generel sundhedsstatus og komplikationer.
      BEMÆRK: Dyr, der ikke kommer sig godt efter overlevelseskirurgi, kan få yderligere doser smertestillende medicin og vil blive aflivet humant, hvis de ikke er fuldt ud genoprettet inden 72 timer efter operationen.
    15. Overvåg dyret for tumorvækst, vægttab og generel sundhedsstatus som beskrevet i trin 2.6.6.
  10. Til retro-orbitale injektioner:
    BEMÆRK: Brug denne teknik som et alternativ til haleveneinjektioner, når operatøren er uddannet og dygtig i denne teknik, og når der er en stærk videnskabelig begrundelse. Cellesuspensioner leveret via denne rute kan fremkalde tumorvækst i retro-orbitalrummet; Derfor bør der tages nøje hensyn til risici og fordele, når du vælger denne teknik. For eksempel for at drage fordel af den direkte kredsløbsforbindelse mellem den retro-orbitale venøse sinus og de intracerebrale vener via anastomoser, skal du vælge denne metode, når hjernetumordannelsen har mislykkedes ved hjælp af andre injektionsveje.
    1. Udfør hele proceduren inde i et biosikkerhedsskab for at opretholde aseptiske forhold. Don sterile PPE og handsker.
    2. Anæstesi dyret som beskrevet i trin 2.3-2.4.
      BEMÆRK: Til denne procedure må du ikke anvende steril petrolatum oftalmisk salve på dyrets øjne, da dette vil hindre injektion; Anvend kun lokalbedøvelsesdråber.
    3. Læg cellesuspensionen i en insulinsprøjte med en 28-31 G, 6 mm nål.
    4. Med dyret i udsat position skal du trække øjenlågene tilbage, indtil øjet stikker ud. Påfør 1 dråbe lokalbedøvelse i øjet på den side, der gennemgår proceduren.
    5. Indsæt nålen i en 30-45 ° vinkel mellem øjet og den mediale epicanthus med skråningen nedad. Injicer cellesuspensionen (10-150 μL) langsomt.
      BEMÆRK: Langsommere bevægelser forhindrer beskadigelse af øjet og tilbagestrømningen af injektatet.
    6. Udfør de trin, der er beskrevet i 2.7.5-2.7.6.
  11. Til miltinjektioner:
    1. Udfør hele proceduren inde i et biosikkerhedsskab for at opretholde aseptiske forhold31. Don sterile PPE og sterile handsker.
    2. Anæstesi og barbere dyret som beskrevet i trin 2.3-2.5.
    3. Placer dyret i en højre lateral liggende stilling. Rens huden i procedureområdet med 3 påskel af 10% povidon-jod skiftevis med 3 anvendelser af isopropylalkohol, og forbered det kirurgiske felt som beskrevet i trin 2.9.5.
    4. Brug Metzenbaum saks eller en skalpel, lav et 1 cm snit i venstre flanke af abdominalvæggen efterfulgt af et snit i bughinden.
      BEMÆRK: Milten vil blive set gennem den gennemskinnelige abdominalvæg efter at have lavet hudsnittet. Udfør peritoneal snittet nøjagtigt på dette websted.
    5. Udsæt milten og milten hilum gennem snittet. Ved hjælp af en 28-31 G insulinsprøjtenål, 6 mm lang, punkteres milten forsigtigt med nålens skråning opad og i en spids vinkel.
      BEMÆRK: Hvis punkteringssåret bløder, skal du cauterize stedet for at begrænse blødning og tilbagestrømning.
    6. Injicer hele volumenet (50-100 μL) af cellesuspension langsomt. Fjern nålen. Placer en lille gasbind på milten og påfør tryk med en tang. Klem milten let mellem gasbindet ved hjælp af fine myggetang og vent i 15 min.
    7. Udfør en splenektomi ved at binde milten hilum med en 3-0 eller 4-0 silke sutur, cauterizing karrene om nødvendigt. Luk bughinden med en 5-0 polydioxadon (PDS) eller polyglykolsyreabsorberbar sutur.
    8. Udfør de trin, der er beskrevet i trin 2.7.5-2.7.6.
      BEMÆRK: Dyr, der præsenterer blødningskomplikationer, eller som ikke er kommet sig fuldt ud 72 timer efter operationen, bør aflives humant. Husk, at musenes velbefindende til enhver tid er prioriteret.

3. Iscenesat overlevelseskirurgi (SSS)

  1. Baseret på de eksperimentelle konklusioner fra trin 2.2 skal du bestemme det rette tidspunkt for overlevelseskirurgi. Afhængigt af cellelinjen og eksperimentel hypotese skal du vælge et tidligere tidspunkt for tumorresektion (ved et tumorvolumen = 150 mm3) eller et senere tidspunkt (ved et tumorvolumen = 500 mm3)26.
    BEMÆRK: Tumorvolumengrænsen er 1.500 mm3 , når tumorbyrden er høj nok til at være skadelig for dyrets velbefindende og prædisponerer for komplikationer.
  2. Anæstesi og barbere dyret som beskrevet i trin 2.3-2.5.
    BEMÆRK: Hele proceduren udføres inde i et biosikkerhedsskab.
  3. Rens huden i procedureområdet med 3 påskel af 10% povidon-jod skiftevis med 3 anvendelser af isopropylalkohol, og forbered det kirurgiske felt som beskrevet i trin 2.9.5.
  4. Brug Iris saks eller en skalpel, skære huden og opretholde en 5-7 mm resektionsmargen fra kanten af tumoren.
    BEMÆRK: Margenen for resektion afhænger af tumorens evne til at sprede sig lokalt. For aggressive tumorer skal du øge resektionsmargenen, samtidig med at du sørger for, at der er nok hud tilbage til at udføre sårlukningen.
  5. I tilfælde af intradermale tumorer skal du resektere tumoren sammen med den omkredsede hud.
  6. For subkutane tumorer dissekeres og fjernes tumoren under huden.
    BEMÆRK: Hvis tumoren invaderer bughinden og / eller huden, skal du resektere den en bloc med tumoren og lukke bughinden med 5-0/4-0 PDS eller polyglykolsyreabsorberbare suturer.
  7. Luk såret med 9 mm hæftningsanordningen.
    BEMÆRK: Fjern hæfteklammerne 7-10 dage efter operationen. Administrer smertestillende medicin og læg dyret på en varm pude for at komme sig. Fortsæt med at administrere smertestillende medicin i 72 timer efter operationen, en gang hver 12. time i henhold til trin 2.9.13. Dyr med blødningskomplikationer, eller som ikke har genvundet fuld bevidsthed efter operationen, bør aflives humant.
  8. Single-house dyret i et bur, på en varm pude for at komme sig. Returner dyret til vivariumburet efter at have genvundet bevidstheden, når det er strengt og ambulant.
  9. Fortsæt med at overvåge dyret efter operationen for lokale tilbagefald, vægttab, neurologiske, lokomotoriske og / eller adfærdsmæssige tegn (sløvhed, manglende pleje, lavt mad- eller vandindtag) og generel sundhedsstatus.

4. In vivo-billeddannelse (figur 2A)

  1. D-luciferinsubstrat (150 mg/kg) administreres til dyr ved intraperitoneal injektion med en 1 ml insulinsprøjte, 28 G nål.
    BEMÆRK: Tumorceller skal være stabilt transduceret med luciferase cDNA.
  2. Inducere anæstesi som beskrevet i trin 2,3-2,4, 6 minutter efter D-luciferinsubstratinjektionen.
  3. Udfør billeddannelse ved hjælp af en BLI-scanner (bioluminescensbilleddannelse) (in vivo-billeddannelsessystem )26.
  4. Flyt dyret inde i billeddannelseskammeret og ind i næsekeglen. Billede op til 5 dyr samtidigt, afhængigt af billedbehandlingssystemets kapacitet.
  5. Start instrumentet ved at trykke på initialiser. Indstil indstillingen for eksponeringstid til auto (1-120 s).
  6. Tag et tomt billede for at trække en hvilken som helst baggrund fra, hvis det er nødvendigt. Klik på hent , og gem billedet, når anskaffelsessekvensen er afsluttet.
  7. Placer dyret tilbage i et bur, der sidder med 50% af basisoverfladen over en opvarmningspude for at komme sig efter anæstesi. Returner dyret til vivariumburet efter at have genvundet bevidstheden, når det er strengt og ambulant.
  8. For dataanalyse i den samme in vivo-billedbehandlingssoftware , som billederne blev taget med, skal du navigere til den mappe, hvor billederne gemmes, og åbne billederne af alle musene vedrørende eksperimentet på én gang.
    BEMÆRK: Analyse af et billede ad gangen tillader ikke normalisering på tværs af grupper.
  9. Indstil enhederne til udstråling ( tæller ikke). Sørg for, at afkrydsningsfeltet, der angiver individ , ikke er markeret, da dette forhindrer normalisering af signal på tværs af grupper.
  10. Brug tegneværktøjet Region of Interest (ROI) til at tegne cirkulære ROI'er til hjerneområdet og rektangulære ROI'er til kroppen. Vær forsigtig med at udelukke ørerne og næsen fra hjernens ROI, da de har tendens til at udsende uspecifik luminescens. For at minimere bias i denne proces skal du kun tegne ROI'er på fotografierne af musene, uden at det selvlysende signal er overlejret.
  11. Vælg Mål ROI'er for at kvantificere signalet og eksportere dataene til et regneark. Analyser forskelle mellem grupper ved at afbilde total selvlysende flux (p/sek/cm2/sr) i kropsområder af interesse.
    BEMÆRK: For at vurdere forskelle mellem grupper i hjernetropisme specifikt skal du beregne forholdet mellem hjernesignalet og kropssignalet for hver mus. Dette styrer for intermouse variation i den samlede tumorbyrde og forskelle i niveauer af luciferase ekspression mellem eksperimentelle grupper.

5. Ex vivo magnetisk resonansbilleddannelse

  1. Udfør ex vivo MR umiddelbart efter eutanasi. Alternativt kan du høste de organer, der er af interesse, rette dem i formalin i op til 72 timer og udføre billeddannelsen på et senere tidspunkt.
  2. Anskaf billederne med et 7-Tesla (7-T) (300 MHz) mikro-MR-system udstyret med en NMR-konsol og en nul-kogende, vandret boremagnet eller lignende udstyr.
    BEMÆRK: Behovet for en aktivt afskærmet gradientspoleindsats med den korrekte afvejning af ydeevne er afgørende. Den skal tilvejebringe gradientlinearitet på mindst 50 mm dynamisk sfærisk volumen (DSV) for at dække det sæt prøver, der undersøges samtidigt, uden geometrisk forvrængning. Kombinationen af gradientstyrke (fra 440 til 750 mT/m) og driftscyklus, der muliggør maksimale samtidige jævnstrømninger fra 3 x 30 A til 3 x 87 A, muliggør tilstrækkelig billedydelse. Den anvendte gradientspoleindsats (se tabellen over materialer) muliggør følgende ydeevne: 660 mT/m, 130 μs stigningstid, 3 x 87 A og en DSV = 80 mm.
  3. Udfør scanningerne med en kommerciel transmitt-modtage cirkulært polariseret hel musekrops radiofrekvensspole (OD = 59 mm, ID = 38 mm, L = 40 mm) indstillet til 300,16 MHz, 1H proton Larmorfrekvensen.
    BEMÆRK: Denne rf-sonde muliggør erhvervelse af 3D-datasæt med submillimetrisk isotrop opløsning (<150 μm) under scanninger natten over, der spænder over 8-12 timer.
  4. Opdag tumorbyrden ved hjælp af flere sekvenser30.
    BEMÆRK: Hyperintense-signal detekteret af enT2-vægtet, hurtig billeddannelse med refokuserede ekkoer (RARE) sekvens genkender ødem omkring tumorer.
  5. Udfør 3D RARE-sekvensen med følgende anskaffelsesparametre: [120 μm]3 isotrop opløsning; erhvervelsestid 5 timer, 27 minutter; gentagelsestid (TR) = 500 ms; ekkoafstand (ES) = 12,7 min; Turbofaktor TFx = 12; effektiv ekkotid (TEeff) = 76,2 ms; båndbredde (BW) = 75 KHz; Matrix størrelse = 2843; synsfelt (synsfelt) = [4,0 mm]3; antal gennemsnit (Nav) = 6.
  6. Registrer metastaser ved hjælp af følgende parametre.
    1. For pigmenterede metastaser med signallysning anvendes en T1-vægtet 3D Gradient ekkosekvens med følgende parametre: [120 μm]3 isotrop opløsning; erhvervelsestid 2 timer, 41 minutter; TR = 20 ms; ekkotid (TE) = 4,0 ms; flip vinkel (FA) = 18 °; BW = 75 KHz; Matrix størrelse = 2843; FOV = [34,0 mm]3; Nav = 6.
    2. For upigmenterede og/eller hæmoragiske metastaser skal du anvende et hypointensesignal, når det erhverves under enT2*-vægtet, multigradient ekkosekvens (MGE) (3D MGE, [120 μm]3 isotrop opløsning; anskaffelsestid 3 timer, 35 min; TR = 40 ms; TE = 3,6 ms; ES = 3,2 ms; 4 ekkoer; FA = 20°; BW = 100 kHz; Matrix størrelse = 2843; FOV = (34,0 mm)3; Nav = 4.
  7. Brug alle 3 sekvenser til at kvantificere tumorbyrden.
  8. Krydsreference de tumorområder, der er identificeret under analysen med histologiske sektioner for at sikre nøjagtighed. Se afsnit 7 og 8.

6. Vævsbehandling til enkeltcelle- eller bulk-RNA-sekventering

  1. Aflive dyret ved hjælp af en hvilken som helst metode, der er godkendt af institutionens IACUC. Se en af de procedurer, der er beskrevet i BEMÆRKNINGen i trin 2.6.6.
  2. Dissekere de organer, der er af interesse, og læg dem i separate brønde på en plade, der indeholder Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) på is. Arbejd hurtigt og hold vævet på is til enhver tid for at maksimere cellens levedygtighed.
    BEMÆRK: Følgende trin er specifikke for hjernebehandling. Juster kollagenasetypen til det specifikke væv, baseret på dine behov.
  3. Forbered en 6-brønds plade med 3 ml HBSS i hver brønd.
  4. For at visualisere og yderligere hjælpe med at guide dissektionen skal du bruge et fluorescensmikroskop og identificere de mærkede områder.
  5. Dissekere de fluorescerende områder og placere vævsfragmenterne i 6-brøndspladen (1 fragment pr. Brønd, hvis individuelle metastatiske foci skal analyseres eller flere fragmenter fra et organ, hvis flere metastaser i det samme organ skal analyseres). Brug sterile barberblade til at hakke vævet i så små fragmenter som muligt (uden at bruge mere end 1-2 minutter på dette trin for hver prøve).
    BEMÆRK: Begrænsning af tumorernes behandlingstid hjælper med at bevare cellens levedygtighed.
  6. Aspirer og overfør indholdet af hver brønd til et 15 ml konisk rør.
    BEMÆRK: Skær spidsen af en 1.000 μL pipettespids for at lette overførslen af større fragmenter.
  7. Der tilsættes 1 ml HBSS til brønden, og sørg for, at de resterende vævsfragmenter/celler overføres til 15 ml-røret, som vil indeholde et endeligt volumen på 4 ml. Tilsæt 50 μL collagenase type I (40 mg/ml) og 12,5 μL DNase I (2.000 enheder/ml) til hvert rør.
  8. Anbring de koniske rør i et vandbad opvarmet til 37 °C i 45 minutter. Kort hvirvel de koniske rør hvert 5. minut.
  9. Forvy en 70 μm sil med HBSS. Brug den lukkede ende af et steriliseret mikrocentrifugerør eller plastdelen af et sprøjtestempel og slib vævshomogenaterne gennem en 70 μm sil til et nyt 50 ml konisk rør.
    BEMÆRK: Forvædning af silene med HBSS- eller FACS-buffer letter belastningen.
  10. Vask silen med 1 ml HBSS. Forv en 40 μm sil med HBSS. Filtrer hver prøve igen gennem en 40 μm sil i et nyt 50 ml konisk rør. Tilsæt 1 ml FBS til 40 μm silen for at vaske den. Hold de koniske rør på is hele tiden.
  11. Fyld det koniske rør op til 50 ml med iskold DPBS. Spin ned cellerne (180 × g i 10 minutter ved 4 ° C). Kassér supernatanten, og pas på ikke at miste cellepillen.
    BEMÆRK: For hjerneprøver skal cellerne resuspenderes i 2,5 ml 38% densitetsseparationsopløsning (fortyndes i HBSS og opbevares ved stuetemperatur (RT)). Overfør til 5 ml FACS-rør. Spin i 20 min ved 800 × g. Skær spidsen af en 1.000 μL pipettespids og fjern det øverste fedtlag. Efterlad ikke fedt på rørets vægge. Hvis der er noget fedt tilbage, skal du dreje ned igen og gentage processen. Dette er et kritisk skridt. Fjern resten af væskefasen (pillen vil være gennemskinnelig og svær at visualisere).
  12. Resuspend cellerne i 1 ml røde blodlegemer (RBC) lysisbuffer og inkuber i 60 s ved RT. Sluk lysisopløsningen ved at tilsætte 20 ml DPBS.
  13. Spin ned cellerne ved 180 × g i 10 minutter ved 4 ° C. Fjern supernatanten og resuspend cellerne i 2 ml FACS-buffer (5% FBS i DPBS).
  14. Fortsæt med sortering af mærkede celler og / eller biblioteksforberedelse til enten bulk eller enkeltcelle RNA-sekventering.
    BEMÆRK: Celler kan spindes ned, snapfryses og opbevares ved -80 ° C før RNA-isolering for bulk RNA-seq.

7. Animalsk vævsperfusion og forberedelse til immunhistologiske analyser

  1. Anæstesi dyret med en overdosis ketamin (300 mg/kg) og xylazin (30 mg/kg) cocktail ved intraperitoneal injektion med en insulinsprøjte og en 28 G nål.
  2. Udsæt hjertet ved grov dissektion og lav et snit i højre atrium. Hold hjertet forsigtigt på plads med lange, buede tang vendt mod forreste.
    BEMÆRK: Formalin og paraformaldehyd (PFA) er kræftfremkaldende stoffer. Læs sikkerhedsdatabladet (SDS), undgå udsættelse for dampe, og brug det relevante PV.
  3. Brug en 10 ml sprøjte med en 22 G, 22 mm nål til at injicere 10 ml DPBS efterfulgt af 10 ml 4% PFA i venstre ventrikel.
  4. Fortsæt med at høste organerne og læg dem i formærkede histologiske kassetter. Anbring kassetterne i en beholder i passende størrelse, der rummer nok fikseringsmiddel (formalin) til at dække vævene.
    BEMÆRK: Ideelt set bør det fikserende volumen være 5-10 gange vævets volumen.
  5. Fastgør organerne inde i de histologiske kassetter i 10% formalin i 48-72 timer. Kassér 10% formalin og vask kassetterne to gange med 1x DPBS.
  6. Begynd dehydreringsprocessen ved at nedsænke kassetterne i 70% ethanol i 2 timer. Fortsæt med at nedsænke kassetterne successivt i stigende ethanolkoncentrationer: 80%, 95%, 100% for 1 time hver. Skift 100% opløsningen to gange efter 1,5 time. Dænk kassetterne i xylen i 1,5 time og udfør tre ændringer af opløsningen.
  7. Kassetterne indlejres i paraffinvoks ved 58-60 °C. Sektion paraffinblokkene. Fortsæt til hæmatoxylin og eosin (H & E) orimmunohistochemistry farvning.
  8. For at identificere melanomceller skal du bruge en af disse markører eller et panel: S100, Melan-A, HMB-45, Tyrosinase, MITF. Når det er muligt, skal du bruge Nuclear Mitotic Apparatus Protein (NuMA) farvning, da det er en meget specifik human cellemarkør.
    BEMÆRK: NuMA-farvning tilbyder en skarp afgrænsning mellem vært (mus) og indpodede celler (humane), der hjælper med billedbehandling og efterfølgende tumorkvantificeringsfaser.

Figure 2
Figur 2: Eksempler på BLI-, brightfield-, ex vivo-fluorescens - og H&E-farvningsbilleder, der illustrerer den flerstrengede tilgang til analyse af kandidatgeners virkninger i melanommetastase. (A) BLI, (B) BF, (C) ex vivo fluorescens og (D) H&E farvning billeder. De billeder, der anvendes til illustration, svarer til et eksperiment, hvor 131/6-4L melanomceller transduceret med et ikke-målretningskontrol-shRNA (shNTC) eller et shRNA rettet mod FUT8 blev injiceret i immundefekte (NSG) mus. FUT8-hæmning forringede den metastatiske spredning af melanomceller. Skalabjælker og farvebjælke = p/sek/cm2/sr × 106 (A), 100 mm (B, C), 100 μm (D). Forkortelser: BLI = bioluminescensbilleddannelse; H&E = hæmatoxylin og eosin; shRNA = kort hårnål RNA; shNTC = ikke-målretningskontrol shRNA; NSG = ikke-overvægtig diabetiker svær kombineret immundefekt gamma; FUT8 = fucosyltransferase 8; BF = lysfelt. Klik her for at se en større version af denne figur.

8. Nuklear mitotisk apparatprotein (NuMA) farvning (figur 3)

  1. Brug et anti-NuMA-antistof som en meget humanspecifik mitotisk spindelmarkør til identifikation og kvantificering af metastatisk byrde i vævssektioner. 8.1. Der opnås meget specifik og følsom identifikation af melanomceller.
  2. Hvis kromogen immunohistokemi for NuMA udføres på et automatisk immunstainerende instrument, skal du følge disse trin som beskrevet32:
  3. Deparaffiniser sektionerne i xylen og rehydrer dem i sekventielt faldende ethanolkoncentrationer. Hold diasene nedsænket i 15 minutter i xylen og overfør dem til 100% ethanol i yderligere 15 minutter.
    BEMÆRK: Resten af ethanol-rehydreringstrinnene (95%, 80%, 75%) varer i 3 til 5 minutter hver.
  4. Skyl diasene i deioniseret vand.
  5. Udfør epitophentning ved at nedsænke diasene i en beholder (f.eks . Coplin-farvningsbeholder) i 10 mM natriumcitratbuffer, pH 6,0, i en 1200 Watt mikrobølgeovn ved 100% effekt i 10 minutter.
  6. Brug ukonjugeret, polyklonalt kanin-anti-humant NuMA-antistof til mærkning, fortyndet 1:7.000 i Tris-Bovine serumalbumin (BSA) (25 mM Tris, 15 mM NaCl, 1% BSA, pH 7,2). Kør de relevante positive og negative kontroller parallelt med undersøgelsesafsnittene.
  7. Inkuber diasene med det primære antistof i 12 timer. Påvis det primære antistof med gede-anti-kanin HRP konjugeret multimer og visualiser komplekset med 3,3-diaminobenzidin og en kobbersulfatforstærker.
  8. Vask diasene i destilleret vand, modplet med hæmatoxylin, dehydrer og monter med permanent medium.
    BEMÆRK: Dehydreringstrinnene er bagsiden af de rehydreringstrin, der er beskrevet i trin 8.3. Scan diasene med den tilgængelige scanner ved 20x eller 40x forstørrelse, og upload dem til en database.
  9. Brug software til at tegne ROI'er for at inkludere alle NuMA-farvede celler i organvævet, undtagen andre organparenkym og tomme rum.
  10. Juster indstillingerne for at kategorisere de NuMA-positive og NuMA-negative celler, mens du bruger passende positive og negative kontroller for hvert organ. Brug en etableret softwarealgoritme til at kvantificere det samlede antal/procentdel af NuMA-positive celler for hver prøve.

9. Vævsskive immunofluorescens

For at identificere det metastatiske stadium, hvor en bestemt genkandidat er påkrævet (f.eks . Ekstravasation vs. overlevelse efter såning), kan man bestemme vævsskiveimmunfluorescens på forskellige tidspunkter for at spore tumorcelleprogression fra injektion til fjern organinvasion, såning og vækst. Denne tilgang gør det muligt at tilføje markører til naboceller for at fange ekstravasationshændelsen, og det omgivende tumormikromiljø ændres33.

  1. Anæstesi dyret som beskrevet i trin 7.1.
  2. Injektion 100 μg fluorophore konjugeret Lycopersicon Esculentum (Tomat) Lectin i venstre ventrikel af hvert dyr, 3 minutter før perfusion, for at afgrænse det vaskulære endotel.
    BEMÆRK: Giv tomatolektin tid til at recirculere i hele systemet.
  3. Perfuse dyret som beskrevet i trin 7.2-7.3. Høst de organer af interesse og overfør dem til formærkede beholdere fyldt med 4% PFA. Fastgør vævet i 24 til 48 timer. Sektion vævet ved hjælp af et vibratom i 30-50 μm tykke skiver.
    BEMÆRK: Tykkelsen skal optimeres. Skiver mellem 30 μm og 50 μm tykkelse anbefales, især når du udfører z-stack-billeddannelse.
  4. Inkuber skiverne i blokerende buffer (10% Normal Goat Serum, 2% BSA, 0,25% Triton X-100 i DPBS) i 2 timer ved RT.
  5. Udfør et farvningsoptimeringseksperiment.
    BEMÆRK: Som antigenhentningstid, buffere, der anvendes til antigenhentning, temperatur, forskellige antistoffer / forskellige partier og vævstypen påvirker farvningen, er optimeringseksperimenter nødvendige.
  6. Tilsæt primære antistoffer ved en optimeret fortynding og inkuber for en optimeret tid ved en optimeret temperatur (se eksempler i tabel 1).
    BEMÆRK: Brug passende kontroller for primære/sekundære antistoffer og ikke-tilbageholdte vævsprøver.
  7. Vask vævsskiverne 3 gange i 5 min med 0,25% Triton X-100 i DPBS.
  8. Inkuber vævsskiverne i sekundært antistof fortyndet i blokerende opløsning i den ønskede tid (tabel 1).
  9. Vask vævsskiverne 3 gange i 5 min med 0,25% Triton X-100 i DPBS.
  10. Pletter kernerne med 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) fortyndet 1:1.000 i DPBS eller blokerende buffer i 5 minutter.
  11. Tilsæt 2 dråber antifade fluorescensmonteringsmedium til et dækslip og monter vævet på glasrutschebaner, og sørg for, at skiverne er helt dækket af monteringsmedium.
    BEMÆRK: Sørg for, at der ikke er luftbobler direkte på skiverne, da dette forvrænger mikroskopi.
  12. Tag konfokale billeder med det tilgængelige mikroskop ved hjælp af et 60x olienedsænkningsmål.
    BEMÆRK: Når du henter konfokale billeder, skal du anvende de samme indstillingsparametre (spænding, luftige enheder og forstærkning) på tværs af alle billederne i eksperimentet.
  13. Tag ikke-konfokale billeder ved hjælp af mikroskopet ved 10x, 20x eller 40x.
  14. Upload billederne i en billedanalysesoftware, og analyser dem ved at sammenligne de valgte parametre (dvs. område, antal, intensitet af markører eller kontakt med tilstødende celler).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De følgende tal illustrerer, hvordan den beskrevne arbejdsgang er blevet anvendt til identifikation af nye drivkræfter for melanommetastase. Figur 2 opsummerer resultaterne af en offentliggjort undersøgelse, hvor virkningerne af at dæmpe fucosyltransferasen FUT8 in in vivo melanommetastase blev undersøgt26. Kort fortalt afslørede analyse af humane patientglykomiske data (opnået ved lektinarrays) og transkriptomisk profilering øgede niveauer af alfa-1,6-fucose forbundet med progression fra primært til metastatisk melanom, i overensstemmelse med en stigning i den tilsvarende fucosyltransferase (FUT8).

113/6-4L melanomceller transduceret med lentivirus, der bærer et FUT8 shRNA eller den tilsvarende ikke-målretningskontrol (shNTC), blev indført ved ultralydsstyret intrakardieinjektion i immundefekte mus (NSG) som beskrevet ovenfor (pkt. 2.9). Musene blev overvåget for metastatisk spredning af in vivo BLI. Musene blev aflivet i slutningen af forsøget, organerne blev undersøgt for ex vivo fluorescens og behandlet til histologiske analyser. Ud over H &E blev NuMA-farvning udført for specifikt at identificere humane celler i murinvæv. Som illustreret i figur 3 blev NuMA-farvede sektioner behandlet ved digital billeddannelse for at kvantificere den metastatiske byrde på tværs af flere sektioner og eksperimentelle grupper. En lignende arbejdsgang kan anvendes til at vurdere andre kandidatgeners bidrag til melanommetastase.

Figure 3
Figur 3: NuMA-farvede lungesektioner. (A) Venstre, repræsentative billeder af NuMA-farvede lungesektioner fra gruppe I (melanomceller inficeret med kontrol lentivirus) og gruppe II (melanomceller inficeret med en metastase-suppressor-ekspressionerende lentivirus). Skalastænger = 1.000 μm. Indsat viser metastatiske foci (midten), der kan kvantificeres ved hjælp af software. Højre, metastatiske melanomceller er mærket grønt, og organområdet er afgrænset af en grøn udklækket linje. NuMA-negative celler er mærket blå. Skalastænger = 100 μm. (B) Eksempel på en mikrometastase i NuMA-farvede lungesektioner illustrerer softwarens følsomhed ved påvisning af et lille antal celler. Skalastænger = 100 μm. Forkortelse: NuMA = Nukleart mitotisk apparatprotein. Klik her for at se en større version af denne figur.

Antistof Fabrikant Katalog Nej Værtsarter Reaktivitet Fluorofor Fortynding Inkubationstid Inkubationstemperatur
anti-GFP Abcam Svendborg, Svendborg, Kanin Mus ukonjugeret 1:1000 24 timer i døgnet 4°C
anti-GFAP Aves Labs GFAP Høne Mus ukonjugeret 1:2000 24 timer i døgnet 4°C
sekundær Invitrogen Svendborg, Der er gratis brug af en Ged Høne A568 1:500 2 timer Rumtemperatur
sekundær Invitrogen Svendborg, Svendborg , S Ged Kanin Svendborg, Svendborg 1:500 2 timer Rumtemperatur

Tabel 1: Eksempler på antistof- og inkubationsbetingelser for hjerneskiveimmunfluorescens.

Celle linje Slags Tid til aktiv dødshjælp Sex af mus Genetisk baggrund for mus Injektionsvej # Celler injiceret Websteder af metastase
12-273 BM+ Humant melanom STC 4-5 uger M NSG Intrakardie 100K Hjerneparenkym, leptomeninges, lever, nyre, binyrerne
131/4-5B1* Humant melanom 4-6 uger M Athymisk nøgen eller NSG Intrakardie 50-200K Hjerneparenkym, lever, lunge
113/6-4L* Humant melanom 5-7 uger M Athymisk nøgen eller NSG Intrakardie 50-100K Hjerneparenkym (få), lever, lunge
WM 4265-2** Humant melanom STC 11 uger M Athymisk nøgen eller NSG Intrakardie 200K Hjerne parenkym
WM 4257-1** Humant melanom STC 10-13 uger M Athymisk nøgen Intrakardie 100K Hjerneparenkym (få)
WM 4257-2** Humant melanom STC 10-13 uger M Athymisk nøgen Intrakardie 100K Hjerne parenkym
10-230 BM+ Humant melanom STC 8-9 uger M Athymisk nøgen Intrakardie 100K Hjerneparenkym, leptomeninger, lever (få)

Tabel 2: Opdeling af resultater fra repræsentative in vivo-eksperimenter med forskellige humane melanomcellelinjer og kortvarige kulturer efter den beskrevne protokol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Formålet med denne tekniske rapport er at tilbyde en standardiseret, top-til-bund arbejdsgang til undersøgelse af potentielle aktører i melanommetastase. Da in vivo-eksperimenter kan være dyre og tidskrævende, er strategier til at maksimere effektiviteten og øge værdien af de opnåede oplysninger altafgørende.

Det er bydende nødvendigt at anvende komplementære tilgange hele vejen igennem for at krydsvalidere resultater inden for det samme eksperiment. For eksempel er både NuMA immunohistokemisk farvning og BLI komplementære metoder til kvantitering af metastatisk byrde, fordi ingen af dem er omfattende. Mens BLI er en uvurderlig, ikke-invasiv metode til sporing af tumorprogression in vivo, er disse data i sagens natur af lav opløsning. NuMA-farvning muliggør omhyggelig analyse af metastatisk byrde i faste organer; omfattende sektionering gennem hele vævstykkelsen er imidlertid upraktisk. Som sådan kan kun en prøve af hvert organ farves. Faktisk er BLI-resultaterne ifølge forfatterne ikke altid direkte proportionale med tumorbyrden, der er tydelig i histopatologisk analyse. Dette skyldes til dels den begrænsede følsomhed af denne metode, især i hjernen, på grund af transkraniel dæmpning34. Desuden kan disse data påvirkes af ufuldstændig luciferinoptagelse og/eller variabel luciferaseekspression. Bli bør derfor fortolkes i sammenhæng med ex vivo-billeddannelse og histopatologiske undersøgelser.

Histologisk evaluering af vævsprøver behandlet med generiske pletter, såsom H & E, kræver specialiseret anatomopatologiuddannelse, er ofte lav gennemstrømning og er tilbøjelig til interobservere variationer. Forfatterne arbejder i øjeblikket med bioinformatikkolleger for at standardisere og fremskynde eksperimentel dataanalyse ved at udvikle en maskinlæringsalgoritme til automatiseret og pålidelig kvantation af metastatisk byrde som en procentdel af organvævsafsnittet i histopatologiske billeder. Disse og andre værktøjer vil være kritiske for feltet, især da det metastatiske mikromiljøs rolle kommer i fokus ved en finere opløsning (f.eks. Rumlig transkriptomik). Ikke desto mindre er ekspert histopatologisk evaluering af vævet afgørende, især i undertyper af hjernemetastase såsom leptomeningeal, en biologisk særskilt undertype, som let fejlfortolkes som parenkym hjernemetastase via BLI alene. NuMA-farvning (afsnit 8) fremskynder den histopatologiske vurdering af metastatisk byrde, hvilket muliggør upartisk identifikation og kvantvantation af humane celler i museorganer. Imidlertid er sondring mellem anatomiske rum på NuMA-farvede sektioner, såsom hjernens parenkym versus leptomeningerne, afgørende for at få yderligere biologisk indsigt.

De teknikker, der er beskrevet heri, kan anvendes til at undersøge den funktionelle relevans af gener af interesse for melanommetastatisk kaskade. Det er afgørende at vælge en model med en reproducerbar fænotype, der er passende for den pågældende undersøgelse. For eksempel kan et gen, der er opreguleret i humane patientprøver af metastase, "slås ned" for at vurdere, om dette reducerer metastatisk byrde sammenlignet med en kontrolgruppe. Denne fremgangsmåde udføres bedst i en modelcellelinje eller kortvarig kultur, der indeholder både a) høj ekspression af det gen, der er af interesse, og b) genererer en betydelig metastatisk byrde med pålidelig kinetik, når den injiceres i mus, således at et fald i metastatisk kapacitet vil være mærkbart og henføreligt til den genetiske forstyrrelse, der testes.

Også afgørende i eksperimentelt design er den valgte injektionsmåde, der er mest hensigtsmæssig for det stadium af metastase, der undersøges. Hvert trin i den metastatiske kaskade præsenterer forskellige biologiske og fysiske barrierer for melanomceller. Investigatorer, der søger at besvare spørgsmål om de indledende faser af metastase, nemlig invasion og intravasation, bør anvende de teknikker, der er beskrevet i afsnit 2, til henholdsvis intradermale og subkutane injektioner efterfulgt af overlevelseskirurgi (afsnit 3). Det er vigtigt, at disse procedurer efterligner den proces, hvorved primære melanomer resekteres hos mennesker, hvorefter en patient måske eller måske ikke præsenterer metastase. Selvom den teknisk set er mere delikat end subkutan injektion, planter den intradermale rute tumorceller i det anatomiske rum, hvor melanomer udvikler sig hos humane patienter. Dette er især vigtigt i undersøgelser af immunovervågning af melanom, da huden har et unikt økosystem af patruljerende immunpopulationer35.

Men hvis hypotesen, der testes, centrerer sig om senere stadier af metastase, såsom ekstravasation fra arteriel cirkulation, er metoder som intrakardiale, intracarotid og retro-orbital injektion fordelagtige. Disse teknikker giver metastase i større skala i et meget kortere tidsrum end dem, der involverer en "primær" tumor. Især til undersøgelser af hjernemetastase kan modeller, der pålideligt producerer tumorer i hjernens parenkym, være vanskelige at etablere. I disse tilfælde repræsenterer intracarotis og retro-orbital injektion metoder til at omgå organer med lavere "adgangsbarrierer", såsom lever og nyrer, hvilket kan forårsage for tidlig dødelighed hos mus injiceret via den intrakardiale rute.

Den valgte musegenetiske baggrund for xeno- eller allografttransplantation afhænger af kilden til celler (menneske, mus) og lejlighedsvis af genetiske modifikationer af de implanterede celler, der kan fremkalde immunafstødning. Eksperimenter, der involverer humane xenograftmodeller, udføres normalt hos mus med nedsat adaptivt og medfødt immunsystem, NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl / SzJ (NSG) mus; eller mus, der mangler adaptiv immunitet, såsom T-cellemangelfulde athymiske/nøgne (NU/J) mus. En anden immundefekt model, der ofte anvendes, er RAG2 knockout (KO) -modellen, som mangler B- og T-celler og bevarer en funktionel naturlig dræbercellepopulation. Disse immundefekte musemodeller skal implementeres strategisk, da hver har fordele på bekostning af nogle ulemper relateret til deres iboende immundefekter. Det er forfatternes erfaring, at den samme cellelinje- eller patientafledte STC udviser forskellig organtropisme baseret på injektionsvejen (f.eks. subkutan vs. intrakardial) og/eller recipientmusens stamme (f.eks. NSG vs. athymisk/nøgen) (se tabel 2).

For at afbøde den eksperimentelle variabilitet vedrørende den vært, hvor melanomceller implanteres (f.eks. immunrespons, mikrobiota) og maksimere 'på mål' og reproducerbare fund, anbefales følgende: i) at øge antallet af forsøgsdyr pr. gruppe (ved hjælp af effektberegninger for at nå et optimalt antal baseret på effektstørrelsen), ii) ved hjælp af ortogonale metoder til at manipulere genkandidater (dvs. CRISPR/Cas9, CRISPRi, shRNA) og 'add-back' eksperimenter (dvs. samtidig ektopisk ekspression af et Cas9- eller shRNA-resistent cDNA af det gen, der er af interesse). Disse komplementære teknikker reducerer muligheden for off-target-effekter og/eller biologisk og eksperimentel variation.

Selvom denne protokol helt sikkert kan anvendes til hypotesedrevet validering af kandidatdrivere eller undertrykkere af metastase, kan disse metoder også være nyttige til upartiske, sonderende undersøgelser. For eksempel giver poolede CRISPR/cas9-, CRISPR-KRAB-dCas9 (CRISPRi) og shRNA-baserede skærme mulighed for, at en proces med darwinistisk udvælgelse kan udspille sig in vivo36. Det konceptuelle grundlag for sådanne undersøgelser er som følger: En celle med et gen slået ud, der er afgørende for fænotypen af interesse (f.eks. Tumorvækst), vil dø eller undlade at sprede sig, således at dens repræsentation i det sekventerede bibliotek formindskes ved eksperimentets afslutning i forhold til basislinjen. De procedurer, der er beskrevet her, kan anvendes til en sådan tilgang med passende optimering37,38.

Med hensyn til kandidatgenselektion kan flere kilder udvindes. Melanom patient transkriptomik og proteomics datasæt er offentligt tilgængelige via NCBI Gene Expression Omnibus (GEO)39, European Genome-Phenome Archive40, cBioPortal41 (som er vært for The Cancer Genome Atlas, eller TCGA42) og andre hosting sites. Genanalyse af rådata anbefales, da kvalitetskontrolforanstaltninger kan variere meget mellem offentlige databaser, hvilket påvirker resultaterne. Ved forhør af rå datasæt omfatter spørgsmål, der er egnede til kandidatgenselektion, der er egnede til anvendelse på den arbejdsgang, der er beskrevet her: Hvilke gener er dysreguleret i metastatiske prøver sammenlignet med primære melanomprøver eller melanocytisk nevi?; hvilke gener er dysreguleret på bestemte metastasesteder?; er den dysregulerede ekspression af kandidatgenet forbundet med forbedret patientoverlevelse?; er dette gen en del af et større genekspressionsprogram, der generelt er dysreguleret?; er genproduktets interaktorer velkarakterikkede eller ukendte?; er genproduktet lægemiddelrettet, og er der i så fald målretningsværktøjer til rådighed?; og meget vigtigt, er genet afgørende for alle humane celler eller for mange væv, således at interferens med dets aktivitet i kliniske omgivelser kan vise sig at være giftigt?

Den passende strategi for manipulation af de gener, der er af interesse, afhænger af de hypoteser, der skal testes. For eksempel kan et gen, der er opreguleret i metastase, slås ned for at vurdere, om de tilsvarende mus ville udvise nedsat metastatisk byrde sammenlignet med en kontrolgruppe. Denne fremgangsmåde udføres bedst i en modelcellelinje eller kortvarig kultur, som indeholder både: a) høj ekspression af genet af interesse og b) genererer mærkbar metastatisk byrde, når den injiceres i mus med reproducerbar kinetik. Knockdown-tilgange omfatter shRNA- og CRISPR/Cas9-baserede metoder, som begge kan konstrueres via lentiviral infektion af melanomceller og implementeres på en inducerbar eller konstitutiv måde. En af fordelene ved inducerbart udtryk (se pLKO Tet-On i table of Materials) er den tidsmæssige regulering af knockdown, som kan udnyttes i et in vivo-eksperiment . Således kan inducerbare shRNA'er / sgRNA'er bruges til at modellere en "terapeutisk indstilling", hvor etablerede tumorceller udsættes for en kandidatgen knockdown. Eksponering for det inducerende middel, f.eks. doxycyclin, kan imidlertid have konsekvenser for visse melanomcellers opførsel; som sådan er inkluderingen af kontrolceller transduceret med et krypteret shRNA, der også oplever denne behandling, kritisk.

Mens shRNA'er ofte giver en delvis knockdown af genekspression, redigerer CRISPR / Cas9-baserede systemer et gen på DNA-niveau, hvilket teoretisk fremkalder en komplet "knockout" (KO). Deres anvendelse giver både fordele og ulemper. Hvis et gen er afgørende for melanomcellernes levedygtighed, vil celler med en komplet KO blive negativt udvalgt in vitro og senere in vivo. Selvom dette problem delvist kan afhjælpes ved at vælge enkeltcellekloner, kæmper melanomceller for at vokse fra enkeltceller, hvilket resulterer i uforudsigelige og ofte forskellige tilpasninger. Således skal flere KO-kloner testes for at kontrollere for interklonale fænotypiske variationer. Desuden kan antallet af lentivirale infektioner, som melanomceller udsættes for, i tilfælde af patientafledte STC'er især i høj grad påvirke in vitro-proliferation og in vivo-metastatisk adfærd. Derfor anbefales en enkeltvektor, enkeltinfektionsmetode, der inkorporerer Cas9 og et sgRNA (se lentiCRISPRv2 i materialetabellen). Andre systemer gør brug af en "rekombinase død" Cas9 til at fremkalde transkriptionel undertrykkelse (dCas9-KRAB i materialetabellen).

En gain-of-function-tilgang kan være hensigtsmæssig, hvis et gen af interesse antages at være et metastasefremmende gen. I dette tilfælde er udvælgelsen af en melanomlinje, der giver få metastaser ved injektion i mus og har lav basal ekspression af genet af interesse, nøglen. Overekspressionskonstruktioner (især dem, der drives af CMV-promotorer) fører ofte til suprafysiologiske ekspressionsniveauer, hvilket forårsager proteotoksisk stress. Derfor anbefales det at vælge lentivirale vektorer, der muliggør den fysiologiske ekspression af genet af interesse.

Når en tilgang er valgt, er det vigtigt at udføre følgende eksperimenter inden engraftment af celler. Lentivirale infektionsprocedurer varierer mellem laboratorier og vil kræve optimering for hver cellelinje og knockdown-system. Universelle overvejelser omfatter imidlertid en fuldstændig positiv eller negativ selektion af celler med gennedslag (f.eks. FACS/cellesortering for fluorescerende indberettere eller antibiotikaresistens, hvis det er relevant), efterfulgt af RT-qPCR og western blot med passende kontroller for at påvise reproducerbar og robust knockdown eller overekspression af det gen, der er af interesse. Et in vitro-proliferationsassay bør udføres for at afgøre, om interferens med genet af interesse påvirker cellens levedygtighed. Dette trin er vigtigt for pålidelig cellekarakterisering og for den korrekte fortolkning af in vivo-resultater . Her er et eksempel på en faldgrube, hvis de beskrevne eksperimenter ikke udføres: Hvis en gennedslag resulterer i en drastisk proliferationsdefekt in vitro, vil dette forvirre fortolkningen af nedsat metastatisk byrde, da dette gens specifikke bidrag til den metastatiske kaskade ikke kan vurderes nøjagtigt. Forskellige modaliteter af proliferationsassays omfatter kommercielt tilgængelige kits, levende cellebilleddannelsessystemer eller traditionelle cellekulturbaserede assays, f.eks. Krystalviolet, trypanblå udelukkelse.

Blandt de største begrænsninger for denne platform i opdagelsen af mediatorer i melanom er, at den foreslåede arbejdsgang kun undersøger tumorcelle-iboende genkandidater, ikke gener udtrykt af cellerne i det omgivende mikromiljø på forskellige metastatiske stadier, som er nøglemodulatorer for tumorcelletilpasning og såning af distale organer. En anden vigtig faktor at overveje er differentiel metastatisk adfærd baseret på engraftmentruten. Den interlaboratoriske og interoperatoriske variabilitet, der er iboende for nogle af de præsenterede teknikker, kan løses ved standardisering på tværs af metastaseforskningsfeltet. I øjeblikket er den mest egnede protokol til standardisering den intrakardiale injektion på grund af ultralydsvejledningen og statiske injektionsanordninger, hvilket reducerer interoperatorvariabiliteten. Denne protokol repræsenterer et af de mange skridt i retning af ensartethed, reproducerbarhed og grundig dokumentation af metoder, der anvendes på tværs af laboratorier, der arbejder med identifikation af nye mediatorer af melanommetastase.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.

Acknowledgments

Vi takker Division of Advanced Research Technologies (DART) ved NYU Langone Health, og især Experimental Pathology Research Laboratory, Genome Technology Center, Cytometry and Cell Sorting Laboratory, Pre-Clinical Imaging Core, som delvist støttes af Perlmutter Cancer Center Support Grant NIH / NCI 5P30CA016087. Vi takker NYU Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group (PI: Dr. Iman Osman) for at give adgang til patientafledte melanom kortsigtede kulturer + (10-230BM og 12-273BM), som blev opnået gennem IRB-godkendte protokoller (Universal Consent study #s16-00122 og Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group study #10362). Vi takker Dr. Robert Kerbel (University of Toronto) for at have leveret 113/6-4L og 131/4-5B1 melanomcellelinjer* og Dr. Meenhard Herlyn (Wistar Institute) for at levere WM 4265-2, WM 4257s-1, WM 4257-2 melanom kortsigtede kulturer **. E.H. er støttet af NIH/NCI R01CA243446, P01CA206980, en American Cancer Society-Melanoma Research Alliance Team Science Award og en NIH Melanoma SPORE (NCI P50 CA225450; PI: I.O.). Figur 1 blev oprettet med Biorender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#15 Scapel Blade  WPI 500242 For surgical procedures
#3 Scapel Handle WPI 500236 For surgical procedures
1 mL Tuberculin syringe, slip tip  BD 309626 Injections
10 mL syringe, slip tip  BD 301029 Perfusion
10% Formalin Sodium Buffered EK Industries 4499-20L For perfusion/tissue fixative
15 mL Conical Corning  430052 Cell culture
15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes Falcon 352196 Cell culture
200 Proof Ethanol Deacon Labs 04-355-223 Histology
22G – 22mm needle BD 305156 Perfusion
4-0 Vicryl Suture Ethicon J464G Suture
4% Carson's phosphate buffered paraformaldehyde  EMS 15733-10 For perfusion/tissue fixative
40µm Corning 431750 Tissue processing
5-0 Absorbable Suture  Ethicon 6542000 Closure
50 mL Conical  Corning  430828 Cell culture
50mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes Falcon 352070 Cell culture
7-0 Silk suture  FST 18020-70 Ligature
70µm Corning 431751 Tissue processing
Anti-fade mounting media   Vector Labs H-1000-10 Immunofluorescence
Approximator applying Forceps, 10cm  WPI 14189 For microsurgical procedures
Avance Bruker 3 HD NMR Console 
Biospec 7030  Bruker 7030 Micro MRI
BSA Bioreg A941 NuMA Staining
Castroviejo suturing forceps, straight tips 5.5mm tying platform, 11cm  WPI WP5025501 For microsurgical procedures
Coplin Staining Jar Bel-Art  F44208-1000 Histology
DAPI Sigma-Aldrich D9542-1MG Immunofluorescence
dCas9-KRAB Addgene 110820 Genetic manipulation
DNase I NEB M0303L Tissue processing
DPBS Corning 21-030-CM Tissue processing
Extra Sharp Uncoated Single Edge Blade GEM 62-0167 Tissue processing
Extracellular Matrix Substrate  Corning 354234 Consider the Growth Factor Reduced ( as alternative 
FBS Cytiva SH30910.03 Cell culture
Fiji Image J Fiji Image J Software Immunofluorescence
Goat anti-rabbit HRP conjugated multimer  Thermo Fisher A16104 NuMA Staining
Goat Serum Gibco PCN5000 Immunofluorescence
HBSS Corning 21-020-CV Tissue processing
Hematoxylin  Richard-Allan Scientific  7231 Histology
Illumina III  PerkinElmer CLS136334 BLI Instrument
Insulin syringe 28G - 8mm needle BD 329424 Injections
Insulin syringe 31G - 6mm needle  BD 326730 Injections
Iris Forceps, 10.2cm, Full Curve, serrated WPI 504478 For perfusion and surgical procedures
Isoflurane USP Covetrus 11695067772 Anesthesia
Jewelers #7 Forceps Titanium 11 cm 0.07 x 0.01 mm Tip WPI WP6570 For microsurgical procedures
Ketamine HCl 100mg/mL Mylan Ind. 1049007 Anesthesia
lentiCRISPRv2 Addgene 98290 Genetic manipulation
Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin, DyLight 649 Invitrogen L32472 Vascular endothelial cells marker
MEM non-essential amino acids X 100 Corning 25-025-CI Cell culture
Metzenbaum Scissors WPI 503269 For surgical procedures
Microinjection Unit KOPF 5000 Intracardiac injections
NaCl Fisher S25877  NuMA Staining
Needle 30G x 25mm BD 305128 Intracardiac Injection
Needle 33G x 15mm Hamilton 7747-01 Intracarotid Injection
Needle holder, Castroviejo, 14cm, with lock, 1.2mm Serrated Jaws WPI 14137-G For microsurgical procedures
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice The Jackson Laboratory 005557 Murine model
NU/J mice The Jackson Laboratory 002019 Murine model
Nuclear Mitotic Apparatus Protein polyclonal rabbit anti-human  Abcam 97585 NuMA Staining
Penicillin-Streptomycin 10000U/mL Gibco 15140122 Cell culture
Percoll GE 0891-01 density separation solution 
PI Classic Surgical Gloves Cardinal Health 2D72PT75X Surgery
pLKO Tet-On Addgene 21915 Genetic manipulation
Povidone-Iodine 10% Solution Medline MDS093943 Surgery
Proparacaine Drops 0.5% Akorn Pharma AX0501 Opthalmic local anesthetic
Puralube Petrolatum Opthalmic Ointment Dechra 83592 Anesthesia
Razor Blade Double Edge Blades  EMS 72000 Shaving and Vibrotome Brain Slicing 
Reflex 9mm EZ Clip  Braintree EZC- KIT Wound closure
RPMI 1640  Corning 10-040-CM Cell culture
Scissors, Spring 10.5cm Str, 8mm Blades WPI 501235 For microsurgical procedures
Semi-Automatic Vibrating Blade Microtome Leica VT1200 Brain Slice Immunofluorescence
Single Channel Anesthesia Vaporizer System Kent Scientific VetFlo-1210S  Anesthesia
Smartbox Tabletop Chamber System and Exhaust Blower EZ Systems TT4000 CO2 Euthanasia
Sterile Fenestrated Disposable Drape Medline NON21002 Surgery
Sterile Non-Reinforced Aurora Surgical Gowns with Set-In Sleeves Medline DYNJP2715 Surgery
T25 Flask Corning  430639 Cell culture
Tris Corning 46-031-CM NuMA Staining
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-500ML Immunofluorescence
Troutman tying forceps, 10cm, Curved G pattern, 0.52mm tip with tying platform WPI WP505210 For microsurgical procedures
Vessel clips 10G Pressure 5x 0.8mm Jaws, 5/pkg WPI 15911 For microsurgical procedures
Visiopharm Visiopharm Visiopharm NuMA Staining Quantification Software
Xylasine 100mg/mL Akorn Pharma 59399-111-50 Anesthesia
Xylene Fisher X3P-1GAL Histology

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Adler, N. R., Haydon, A., McLean, C. A., Kelly, J. W., Mar, V. J. Metastatic pathways in patients with cutaneous melanoma. Pigment Cell Melanoma Research. 30 (1), 13-27 (2017).
  3. Platz, A., Egyhazi, S., Ringborg, U., Hansson, J. Human cutaneous melanoma; a review of NRAS and BRAF mutation frequencies in relation to histogenetic subclass and body site. Molecular Oncology. 1 (4), 395-405 (2008).
  4. Alonso, S. R., et al. A high-throughput study in melanoma identifies epithelial-mesenchymal transition as a major determinant of metastasis. Cancer Research. 67 (7), 3450-3460 (2007).
  5. Rowe, C. J., Khosrotehrani, K. Clinical and biological determinants of melanoma progression: Should all be considered for clinical management. Australasian Journal of Dermatology. 57 (3), 175-181 (2016).
  6. Plebanek, M. P., et al. Pre-metastatic cancer exosomes induce immune surveillance by patrolling monocytes at the metastatic niche. Nature Communications. 8 (1), 1319 (2017).
  7. Orgaz, J. L., et al. Loss of pigment epithelium-derived factor enables migration, invasion and metastatic spread of human melanoma. Oncogene. 28 (47), 4147-4161 (2009).
  8. Ladhani, O., Sanchez-Martinez, C., Orgaz, J. L., Jimenez, B., Volpert, O. V. Pigment epithelium-derived factor blocks tumor extravasation by suppressing amoeboid morphology and mesenchymal proteolysis. Neoplasia. 13 (7), 633-642 (2011).
  9. Ju, R. J., Stehbens, S. J., Haass, N. K. The role of melanoma cell-stroma interaction in cell motility, invasion, and metastasis. Frontiers in Medicine - Dermatology. 5, 307 (2018).
  10. Wiley, H. E., Gonzalez, E. B., Maki, W., Wu, M. T., Hwang, S. T. Expression of CC chemokine receptor-7 and regional lymph node metastasis of B16 murine melanoma. Journal of the National Cancer Institute. 93 (21), 1638-1643 (2001).
  11. Meier, F., et al. Metastatic pathways and time courses in the orderly progression of cutaneous melanoma. British Journal of Dermatology. 147 (1), 62-70 (2002).
  12. Turner, N., Ware, O., Bosenberg, M. Genetics of metastasis: melanoma and other cancers. Clinical & Experimental Metastasis. 35 (5-6), 379-391 (2018).
  13. Ubellacker, J. M., et al. Lymph protects metastasizing melanoma cells from ferroptosis. Nature. 585 (7823), 113-118 (2020).
  14. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
  15. Cunningham, C. C., et al. Actin-binding protein requirement for cortical stability and efficient locomotion. Science. 255 (5042), 325-327 (1992).
  16. Unger, C., et al. Modeling human carcinomas: physiologically relevant 3D models to improve anti-cancer drug development. Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 50-67 (2014).
  17. Fong, E. L., Harrington, D. A., Farach-Carson, M. C., Yu, H. Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling. Biomaterials. 108, 197-213 (2016).
  18. Nakamura, K., et al. Characterization of mouse melanoma cell lines by their mortal malignancy using an experimental metastatic model. Life Science. 70 (7), 791-798 (2002).
  19. Meeth, K., Wang, J. X., Micevic, G., Damsky, W., Bosenberg, M. W. The YUMM lines: a series of congenic mouse melanoma cell lines with defined genetic alterations. Pigment Cell Melanoma Research. 29 (5), 590-597 (2016).
  20. Koya, R. C., et al. BRAF inhibitor vemurafenib improves the antitumor activity of adoptive cell immunotherapy. Cancer Research. 72 (16), 3928-3937 (2012).
  21. Jenkins, M. H. Multiple murine BRaf(V600E) melanoma cell lines with sensitivity to PLX4032. Pigment Cell Melanoma Research. 27 (3), 495-501 (2014).
  22. Tuncer, E., et al. SMAD signaling promotes melanoma metastasis independently of phenotype switching. The Journal of Clinical Investigation. 129 (7), 2702-2716 (2019).
  23. Schwartz, H., et al. Incipient Melanoma Brain Metastases Instigate Astrogliosis and Neuroinflammation. Cancer Research. 76 (15), 4359-4371 (2016).
  24. Perez-Guijarro, E., et al. Multimodel preclinical platform predicts clinical response of melanoma to immunotherapy. Nature Medicine. 26 (5), 781-791 (2020).
  25. Krepler, C., et al. A Comprehensive Patient-Derived Xenograft Collection Representing the Heterogeneity of Melanoma. Cell Reports. 21 (7), 1953-1967 (2017).
  26. Agrawal, P., et al. A systems biology approach identifies FUT8 as a driver of melanoma metastasis. Cell. 31 (6), 804-819 (2017).
  27. Hanniford, D., et al. Epigenetic silencing of CDR1as drives IGF2BP3-mediated melanoma invasion and metastasis. Cancer Cell. 37 (1), 55-70 (2020).
  28. Kim, H., et al. PRMT5 control of cGAS/STING and NLRC5 pathways defines melanoma response to antitumor immunity. Science Translational Medicine. 12 (551), (2020).
  29. de Miera, E. V., Friedman, E. B., Greenwald, H. S., Perle, M. A., Osman, I. Development of five new melanoma low passage cell lines representing the clinical and genetic profile of their tumors of origin. Pigment Cell Melanoma Research. 25 (3), 395-397 (2012).
  30. Morsi, A., et al. Development and characterization of a clinically relevant mouse model of melanoma brain metastasis. Pigment Cell Melanoma Research. 26 (5), 743-745 (2013).
  31. Huynh, C., et al. Efficient in vivo microRNA targeting of liver metastasis. Oncogene. 30 (12), 1481-1488 (2011).
  32. Zou, C., et al. Experimental variables that affect human hepatocyte AAV transduction in liver chimeric mice. Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 18, 189-198 (2020).
  33. Kleffman, K., et al. Melanoma-secreted Amyloid Beta Suppresses Neuroinflammation and Promotes Brain Metastasis. bioRxiv. , 854885 (2019).
  34. Curtis, A., Calabro, K., Galarneau, J. R., Bigio, I. J., Krucker, T. Temporal variations of skin pigmentation in C57BL/6 mice affect optical bioluminescence quantitation. Molecular Imaging and Biology. 13 (6), 1114-1123 (2011).
  35. Sil, P., Wong, S. W., Martinez, J. More than skin deep: autophagy is vital for skin barrier function. Frontiers in Immunology. 9, 1376 (2018).
  36. Chen, S., et al. Genome-wide CRISPR screen in a mouse model of tumor growth and metastasis. Cell. 160 (6), 1246-1260 (2015).
  37. Hart, T., et al. High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities. Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).
  38. Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
  39. Edgar, R., Domrachev, M., Lash, A. E. Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository. Nucleic Acids Research. 30 (1), 207-210 (2002).
  40. Lappalainen, I., et al. The European Genome-phenome Archive of human data consented for biomedical research. Nature Genetics. 47 (7), 692-695 (2015).
  41. Cerami, E., et al. The cBio cancer genomics portal: an open platform for exploring multidimensional cancer genomics data. Cancer Discovery. 2 (5), 401-404 (2012).
  42. Grossman, R. L., et al. Toward a shared vision for cancer genomic data. New England Journal of Medicine. 375 (12), 1109-1112 (2016).

Tags

Kræftforskning udgave 181
En robust opdagelsesplatform til identifikation af nye mediatorer af melanommetastase
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shadaloey, A. A. S., Karz, A.,… More

Shadaloey, A. A. S., Karz, A., Moubarak, R. S., Agrawal, P., Levinson, G., Kleffman, K., Aristizabal, O., Osman, I., Wadghiri, Y. Z., Hernando, E. A Robust Discovery Platform for the Identification of Novel Mediators of Melanoma Metastasis. J. Vis. Exp. (181), e63186, doi:10.3791/63186 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter