Summary
Denne artikkelen beskriver en arbeidsflyt av teknikker som brukes til å teste nye kandidatmeglere av melanommetastase og deres virkningsmekanisme(er).
Abstract
Metastase er en kompleks prosess som krever at celler overvinner barrierer som bare er ufullstendig modellert av in vitro-analyser . En systematisk arbeidsflyt ble etablert ved hjelp av robuste, reproduserbare in vivo-modeller og standardiserte metoder for å identifisere nye aktører i melanommetastase. Denne tilnærmingen gjør det mulig for data inferens på spesifikke eksperimentelle stadier å nøyaktig karakterisere et gens rolle i metastase. Modeller etableres ved å introdusere genetisk modifiserte melanomceller via intrakariac, intradermale eller subkutane injeksjoner i mus, etterfulgt av overvåking med seriell in vivo-avbildning . Når preetablerte endepunkter er nådd, høstes primærtumorer og/eller metastaserbærende organer og bearbeides for ulike analyser. Tumorceller kan sorteres og utsettes for en av flere 'omics' plattformer, inkludert encellet RNA-sekvensering. Organer gjennomgår avbildnings- og immunohistopatologiske analyser for å kvantifisere den totale byrden av metastaser og kartlegge deres spesifikke anatomiske plassering. Denne optimaliserte rørledningen, inkludert standardiserte protokoller for engraftment, overvåking, vevshøsting, behandling og analyse, kan vedtas for pasientavledede, kortsiktige kulturer og etablerte menneskelige og murincellelinjer av ulike faste krefttyper.
Introduction
Den høye dødeligheten forbundet med metastatisk melanom kombinert med en økende forekomst av melanom over hele verden1 (anslagsvis 7,86% økning innen 2025) krever nye behandlingsmetoder. Fremskritt innen måloppdagelse avhenger av reproduserbare modeller av metastase, en svært kompleks prosess. Gjennom trinnene i den metastatiske kaskaden må melanomceller overvinne utallige barrierer for å oppnå immunsystemunndragelse og kolonisering av fjernt vev2. Motstandskraften og tilpasningsevnen til melanomceller oppstår fra en rekke faktorer, inkludert deres høye genetiske mutasjonsbyrde3 og deres nevrale crest-opprinnelse, som gir avgjørende fenotypisk plastisitet 3,4,5. På hvert trinn tillater transkripsjonsprogrammer metastaserende melanomceller å bytte fra en stat til en annen basert på signaler fra krysstalet med mikromiljøet, som består av immunsystemet6, det ekstracellulære miljøet 7,8 og den cellulære arkitekturen til fysiske barrierer9 som de kommer i kontakt med. For eksempel unnslipper melanomceller immunovervåking ved å nedregulere uttrykket av viktige immunprimende tumorutskilte faktorer6.
Studier beskriver en "premetastatisk nisje", hvor melanomceller skiller ut kjemokiner og cytokiner for å prime det fjerne "mål" organet for metastase10. Disse funnene reiser viktige spørsmål om organtropismen til metastatiske melanomceller og den anatomiske ruten de tar for å få tilgang til fjernt vev. Etter intravasasjon er melanomceller kjent for å metastasere gjennom lymfatikk (lymfatisk spredning) og blodkar (hematogen spredning)2,11. Mens de fleste pasienter presenterer med lokalisert sykdom, presenterer en liten undergruppe av tilfeller med fjern metastatisk sykdom og ingen lymfatisk formidling (negativ lymfeknuteinvolvering)11, noe som tyder på eksistensen av alternative metastatiske veier for melanom.
Når de koloniserer et metastatisk sted, gjennomgår melanomceller epigenetiske og metabolske tilpasninger12,13. For å få tilgang til og invadere nye rom bruker melanomceller proteaser14 og cytoskeletale modifikasjoner 11,15, noe som gjør dem i stand til å traversere til og vokse på sitt nye sted. Vanskeligheten med å målrette melanomceller ligger i kompleksiteten og antallet slike tilpasninger; Feltet bør derfor gjøre en innsats for å gjenskape så mange trinn og tilpasninger som mulig. Til tross for mange fremskritt i in vitro-analyser som organoider og 3D-kulturer16,17, recapitulaterer disse modellene bare ufullstendig in vivo metastatisk kaskade.
Murine modeller har vist verdi ved å slå en balanse mellom reproduserbarhet, teknisk gjennomførbarhet og simulering av menneskelig sykdom. Intravaskulært, ortopisk og heterotopisk implanterte melanomceller fra pasientavledede xenografter eller kortsiktige kulturer til immunkompliserte eller humaniserte mus representerer ryggraden i måloppdagelse i metastatisk melanom. Imidlertid mangler disse systemene ofte en avgjørende biologisk begrensning på metastase: immunsystemet. Syngeneiske melanommetastasemodeller som har denne begrensningen er relativt knappe i feltet. Disse systemene, utviklet i immunompende mus, inkludert B16-F1018, YUMM-familien av cellelinjer19, SM120, D4M321, RIM322 eller mer nylig, RMS23 og M1 (Mel114433), M3 (HCmel1274), M4 (B2905)24 melanomcellelinjer, lette undersøkelsen av den komplekse rollen til vertsresponsen immun i melanomprogresjon.
Her presenteres en rørledning for melanommetastasemålidentifikasjon. Med økende og større 'omics' datasett som genereres fra melanom pasientkohorter, postulerer vi at studier som holder det mest kliniske løftet er de som stammer fra big data-integrasjon, noe som fører til omhyggelig funksjonell og mekanistisk avhør 25,26,27,28. Ved å bruke musemodeller til å studere potensielle mål i den metastatiske prosessen, kan man redegjøre for in vivo-spesifikke hendelser og vevsinteraksjoner, og dermed øke sannsynligheten for klinisk oversettelse. Flere metoder for å kvantifisere metastatisk byrde skisseres, og gir komplementære data om resultatene av et gitt eksperiment. En protokoll for encellet isolasjon fra svulster i ulike organer er beskrevet for å hjelpe den objektive karakteriseringen av genuttrykk i metastatiske celler, som kan komme før encellet eller bulk RNA-sekvensering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Dyreprosedyrene som er involvert i følgende protokoll ble godkjent av New York University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Alle prosedyrene utføres i innretninger godkjent av Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). Figur 1 viser den generelle eksperimentelle tilnærmingen.
1. Pasientavledede melanom kortsiktige kulturer (KJØNNS)
- Legg vevet i en 60 mm Petri-tallerken med 1 ml fullstendig RPMI (RPMI 1640 supplert med 10% foster bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyuvatt, 1x MEM ikke-essensielle aminosyrer oppløsning og penicillin (100 IE/ml)/streptomycin (100 μg/ml)).
MERK: For å øke forholdet mellom tumorceller, om nødvendig, disseker og fjern vevet rundt svulsten i Petri-parabolen, under et mikroskop, ved hjelp av sterile kirurgiske instrumenter. - Finsnitt det friske vevet ved hjelp av steriliserte barberblader i 1-2 mm terninger. Tilsett 4 ml fullstendig RPMI og pipette innholdet på platen opp og ned 5-10 ganger med en 10 ml serologisk pipette.
- Overfør celleopphenget til et 15 ml polypropylenkonisk rør og spinn cellene ned (180 × g i 5 minutter ved 4 °C). Aspirer den supernatante, resuspend cellepelleten i 1 ml friskt medium, og overfør suspensjonen til en 25 cm2 vevskulturflaske.
- For å hjelpe vevsfragmentene til å feste seg til bunnen, sett kolben vippet i en 20°-30° vinkel i en vevskulturinkubator ved 37 °C, 5 % CO2 i 20 minutter.
- Legg kolben flatt for å la mediet dekke vevet, og sjekk kulturens status daglig. Del cellene når de når 90-100% samløp. Oppretthold kortsiktige kulturer med et "lavt" passasjenummer.
MERK: Kjønnssykdommer vil bli etablert ca 2 måneder etter celleisolasjon og kultur, selv om den faktiske tidslinjen varierer mellom prøver og tumortyper. Etter 10 til 14 passasjer når cellelinjer 100% renhet, som bare inneholder melanomceller29. Terskelen for passasjenummer bestemmes empirisk ved å observere endringer i cellemorfologi, doblingstid og atferd in vivo. For å bevare heterogenitet og andre egenskaper ved foreldresvulsten, må du ikke dele cellene mer enn 1:5. - Ved etablering av en STC og med en hvilken som helst cellelinjemodell som skal injiseres i dyr som beskrevet i etterfølgende trinn, transduce celler med en reporter.
MERK: En fluorescerende tag (f.eks. rødt fluorescerende protein (RFP), grønt fluorescerende protein (GFP)), for eksempel, tillater ex-vivo immunfluorescensavbildning og sortering av tumorceller ved fluorescensaktivert cellesortering (FACS). Luciferase muliggjør in vivo bioluminescensavbildning, et nyttig verktøy for overvåking av eksperimentell progresjon (avsnitt 4).
Figur 1: Skjematisk som illustrerer den beskrevne arbeidsflyten, fra integrering av pasientdata til generering og analyse av in vivo-data fra mus. Forkortelser: LOF = tap av funksjon; GOF = forsterkning av funksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
2. Xenograft implantasjon
MERK: De eksperimentelle prosedyrene som er beskrevet her, utføres hos mus som har nedsatt adaptivt og medfødt immunforsvar, NOD.Cg PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mus; eller hos mus som bare mangler adaptiv immunitet, for eksempel T-cellemangel athymic / nude (NU / J) mus. Dyr er av mannlig kjønn, 8 til 10 uker. Hunnene viser ofte en høy forekomst av gonadale metastaser ved intrakarakuminjeksjon av tumorceller, noe som reduserer overlevelsen.
- For subkutane og intradermale injeksjoner, lag en 1:1 celle suspensjon ved å blande en del av celler suspendert i 1x Dulbecco fosfat-bufret saltvann (DPBS) med en del tint ekstracellulært matrise substrat (EMS), og hold på is ved 4 °C. For intravaskulære (intrakariace, intracarotid, retro-orbital, hale vene eller milt) injeksjoner, suspendere cellene i DPBS bare.
MERK: Riktig volum for intradermale injeksjoner bør holdes så lavt som mulig (30 μL). For subkutane injeksjoner kan det injiserte volumet gå opp til 150 μL, og for intravaskulære injeksjoner, opptil 250 μL (basert på dyrets vekt). Legg til den endelige cellefjæringen 10-30% ekstra volum injisering, basert på mengden injisert og sprøyten som brukes til å ta hensyn til det døde volumet inne i glidespissen og nålens (f.eks. en 1 ml tuberkulinsprøyte med en 30 G, 25 mm nål har et dødt volum på 100 μL). - Utfør en pilot for å karakterisere oppførselen til cellelinjene som er i bruk og tidslinjen for tumorprogresjon in vivo. For intradermale injeksjoner, start med å injisere 1000 opptil 50 000 celler / 30 μL. For subkutane injeksjoner, start med å injisere 10.000 opptil 2 × 106 celler / 150 μL. For intravaskulære (intrakarakum-, intracarotid-, retro-orbitale og miltniske) injeksjoner, start med å injisere 50 000 celler/150 μL.
MERK: Intravaskulære injeksjoner predisponerer dyrene for emboliske hendelser, enten ved å introdusere luft i sirkulasjonssystemet eller ved å bruke et stort antall celler som okkluderer de små karene. Bland cellefjæringen godt for å unngå klumping. Klargjør sprøyten før du laster inn celleopphenget. Fjern eventuelle luftbobler inne i sprøyten. Hold celleopphenget/sprøytene på is til lasting og injeksjonstid. - Administrer anestesi ved innånding. Still inn oksygennivåregulatoren mellom 1-2 l/min. Plasser dyret i induksjonskammeret med isofluran fordamperen satt til 2,5-5% for induksjon og 1,5-3% for vedlikehold.
MERK: Overvåk dyrets pust og hjertefrekvens mens du er i anestesiinduksjonsfasen. Ikke la dyret være uten tilsyn. Ikke overvåk mer enn ett dyr samtidig. Titer mengden anestesi til dyrets vekt. - Flytt dyret fra induksjonskammeret inn i nesekjeglen. Påfør steril petrolatum oftalmisk salve på dyrets øyne for å forhindre hornhinnen tørrhet under prosedyren.
- Barber prosedyrestedet med et rett barberblad vippet i en 30° vinkel. Rengjør huden på prosedyreområdet med 70% isopropylalkoholpinner. Før ytterligere trinn, vurder for et tilstrekkelig nivå av anestesi ved pedalrefleks.
- For intradermale injeksjoner, utfør hele prosedyren inne i et biosikkerhetsskap for å opprettholde aseptiske forhold.
- Bedøv og barber dyret som beskrevet i trinn 2.3-2.5.
- Grip og trekk huden bakover mot banen til nålestikket. Bruk en 31 G insulin sprøytenål, 6 mm lang, holdt i en akutt vinkel, punkter huden forsiktig med skråkanten vendt oppover.
- Kjenn trykkutløsningen på spissen av nålen. Før forsiktig frem for å holde deg inne i det intradermale rommet og ikke passere gjennom hele huddybden inn i subcutis. Avgjørende: Hvis man glir inn i det subkutane rommet, fjern kanylen, bytt injeksjonsområdet og sett inn kanylen igjen. Injiser hele volumet (30 μL) cellefjæring langsomt til et kuppelformet hvalfangst er observert.
MERK: Lave injeksjonsvolumer vil føre til mindre disseksjon av hudlagene og mindre arkitektonisk forvrengning. - Hold nålen inne og tell til 5.
MERK: EMS blir viskøs ved kroppstemperatur, noe som bidrar til å unngå tilbakestrømning gjennom nåle punkteringssåret. - Fjern nålen og enkelthus dyret i et bur på en varm pute for å gjenopprette. Returner dyret til vivariumburet etter å ha gjenvunnet bevisstheten, når sternal og ambulerende.
MERK: Overvåk dyret kontinuerlig under alle prosedyrene som er beskrevet i denne protokollen. Ikke la dyret være uten tilsyn eller overvåk mer enn ett dyr samtidig. - Overvåk utviklingen av tumorvekst, vekttap og generell helsestatus i forbindelse med veterinærpersonell daglig i den første vekstfasen og mer intenst, om nødvendig, etter at dyrene begynner å miste vekt. Under disse overvåkingsøktene: veie dyrene og plotte et diagram for å overvåke vekttap, og se etter tegn på tumorsår, nevrologiske, lokomotoriske og / eller atferdsmessige tegn (sløvhet, mangel på grooming, lav mat eller vanninntak).
MERK: Avlive dyrene umiddelbart etter å ha observert tegn på avansert sykdom (mer enn 20% vekttap, en kroppstilstandsscore på <2, ekstremt redusert aktivitetsnivå, lammelse eller anfall). Bruk eutanasimetoden godkjent av institusjonens IACUC (f.eks. en automatisert bordplate CO2-kammer brukes til å eksponere dyrene for CO2 i 15 minutter etterfulgt av en sekundær metode for eutanasi, enten cervical dislocation, decapitation eller pneumothorax indusert bilateralt ved å incising ribcage). - Ta målinger med kalipere og bruk lengden (L) og bredden (W) dimensjonene til svulsten for å beregne volumet (V) med formelen:
- For subkutane injeksjoner:
- Utfør hele prosedyren inne i et biosikkerhetsskap for å opprettholde aseptiske forhold 26,27.
- Bedøv og barber dyret som beskrevet i trinn 2.3-2.5.
- Bruk en 28 G til 31 G insulin sprøytenål, 6 mm i lengde, holdt i en akutt vinkel, punkter huden forsiktig med skråkanten vendt oppover. Føl trykkutløsningen på spissen av nålen to ganger mens du passerer gjennom epidermis, dermis og hypodermis.
MERK: Den andre gangen en trykkutløsning merkes på spissen av nålen, indikerer at det subkutane rommet er nådd. - Injiser hele volumet (30-150 μL) celleoppheng sakte til en langstrakt ellipseformet hvalfangst observeres. Hold nålen inne og tell til 5. Tell til 10 for større volumer (mer enn 50 μL).
MERK: EMS blir viskøs ved kroppstemperatur, noe som bidrar til å unngå tilbakestrømning gjennom nåle punkteringssåret. - Fjern nålen og enkelthus dyret i et bur på en varm pute for å gjenopprette. Returner dyret til vivariumburet etter å ha gjenvunnet bevisstheten, når sternal og ambulerende.
MERK: Under postprocedural overvåking, observere for tegn på komplikasjoner (lav respiratorisk hastighet, blødning, langsom utvinning) og adressere dem på riktig måte. Hvis det ikke observeres noen forbedring, fortsett til humane eutanasiprosedyrer beskrevet i MERKNAD i trinn 2.6.6. - Overvåk dyret for tumorvekst, vekttap og generell helsestatus som beskrevet i trinn 2.6.6-2.6.7.
- For intrakariac injeksjoner:
- Utfør hele prosedyren inne i et biosikkerhetsskap for å opprettholde aseptiske forhold 26,30.
- Bedøv dyret som beskrevet i trinn 2.3-2.4.
- Overfør dyret til ultralydmaskinens oppvarmede plattform og fest den med hypoallergen tape til nesekjeglen.
- Barber thoraxen med et rett barberblad vippet i en 30° vinkel. Rengjør huden på prosedyreområdet med 3 anvendelser av 10% povidon-jod vekslende med 3 anvendelser av isopropylalkohol.
- Før ytterligere trinn, vurder for et tilstrekkelig nivå av anestesi ved pedalrefleks. Påfør ultralydgel på prosedyrestedet.
- Fang hjertevinduet med ultralydsonden. Plasser ultralydsonden midt på thoraxen på venstre side av dyret for å fange et horisontalt vindu orientert for å oppnå en tverrsnittsvisning (kort akse) av venstre ventrikel. Sørg for at probens lange akse vender oppover, fest sonden i en 50° vinkel og den oppvarmede plattformen i en 20° vinkel. Lås proben og støtterammen på plass.
- Trekk opp cellefjæringen mens du arbeider inne i biosikkerhetsskapet i en tuberkulin 1 ml sprøyte med en 30 G, 25 mm nål. Fjern eventuelle luftbobler i sprøyten.
MERK: Det er viktig å opprette og opprettholde en encellet suspensjon mens cellene behandles og injiseres. Fjerning av luftbobler er et viktig skritt for å unngå luftemboli. Et godt primet sprøytenålsystem vil forhindre unngåelige dødsfall i den eksperimentelle gruppen. Trekk alltid mer volum inn i sprøyten enn det som skal injiseres. Det ekstra volumet vil bidra til å fjerne luften ved å injisere noe av cellefjæringen tilbake i et 1,5 ml rør. - Lås sprøyten i stereotaktisk injektor. Under ultralydveiledning, før nålen gjennom thoracic veggen inn i venstre ventrikel av hjertet. Injiser hele volumet (100-250 μL) celleoppheng sakte.
- Fjern nålen og enkelthus dyret i et bur på en varm pute for å gjenopprette. Returner dyret til vivariumburet etter å ha gjenvunnet bevisstheten, når sternal og ambulerende. Overvåk dyret for tumorvekst, vekttap og generell helsestatus som beskrevet i trinn 2.6.6.
- For intraarotid injeksjoner:
- Utfør hele prosedyren på en riktig desinfisert overflate for å opprettholde aseptiske forhold30.
- Bedøv dyret med en ketamin (100 mg/kg) og xylazin (10 mg/kg) cocktail ved intraperitoneal injeksjon med en insulin sprøyte, 28 G nål. Påfør steril petrolatum oftalmisk salve på dyrets øyne for å forhindre hornhinnen tørrhet under prosedyren.
- Barber prosedyreområdet med et rett barberblad vippet i en 30° vinkel. Før ytterligere trinn, vurder for et tilstrekkelig nivå av anestesi ved pedalrefleks.
- Plasser dyret under et stereomikroskop på en varmepute. Rengjør huden på prosedyreområdet med 3 anvendelser av 10% povidon-jod vekslende med 3 anvendelser av isopropylalkohol.
- Ikke sterilt personlig verneutstyr (PVU) og sterile hansker. Forbered det sterile feltet ved å legge en steril gardin over dyrets kropp.
MERK: Hvis den sterile gardinen ikke har et hull som passer til størrelsen og plasseringen av snittet, bretter du gardinen i to og bruker Metzenbaum-saksen til å kutte hullet i riktig størrelse midt på det sterile gardinen. - Bruk en skalpell eller Iris saks for å inse huden fra halve nakken ned til brystbenet. Med to mikrokirurgiske tang, dissekerer du direkte de 2 submandibulære spyttkjertlene i midtlinjeplanet. Bruk en elektrisk cautery for hemostase, om nødvendig.
- Disseker fasciaen rundt den vanlige halspulsåren (CCA) fra manubriumet mot bifurkasjonen og fortsett medialt for å frigjøre den bakre veggen til den eksterne karotisen. Klipp den eksterne halspulsåren (ECA) midlertidig før injisering.
MERK: Når du dissekerer rundt omkretsen av CCA, må det tas hensyn til ikke å skade vagusnerven (ligger lateral til arterien). - Last celleopphenget i en 1 ml sprøyte med en 33 G, 15 mm nål.
- Passer to 7-0 ligaturer under CCA, og utfør en løs instrument knute for hver av de to ligaturene. Bruk en 5 mm, 10 G trykkbeholderklemme og klipp ECA midlertidig. Bind den proksimale ligaturen; Deretter knytter du den distale ligaturen løst (ved siden av bifurkasjonen av CCA). Bruk den distale løkken senere for å kontrollere blødningen etter injeksjonen.
- Bruk sprøyten med en 33 G, 15 mm nål, punkter forsiktig CCA med nålens skråkant vendt oppover og i en akutt vinkel. Injiser hele volumet (50-150 μL) celleoppheng sakte.
- Ta tak i den distale løkken med tangene og løft den mens du fjerner nålen for å okkludere lumen i CCA og stoppe blødningen. Bytt sprøyten med en #7 Jewelers tang og bind ned den distale sløyfen.
- Kast en annen instrumentknut på den distale ligaturen og fjern karklemmen fra ECA. Kontroller operasjonsfeltet for blødning og cauterize eventuelle blødningsbeholdere før lukking. Bruk en 9 mm stifteenhet for å lukke dyrets hud og plassere dyret på en varm pute for å gjenopprette.
MERK: Fjern stiftene 7-10 dager etter operasjonen. - Administrer smertestillende medisiner subkutant-Buprenorfin (0,3 mg/ml) hver 12.
MERK: Alternativt kan du vurdere å bruke en utvidet smertestillende medisin, som krever 1 dose hver 72. - Returner dyret til vivariumburet etter å ha gjenvunnet bevisstheten, når sternal og ambulerende. Overvåk dyrene postoperativt daglig for tegn på kirurgisk infeksjon eller smerte, generell helsestatus og komplikasjoner.
MERK: Dyr som ikke kommer seg godt etter overlevelseskirurgi kan få ekstra doser smertestillende medisiner og vil bli avlivet humant hvis de ikke er fullstendig restituert med 72 timer etter operasjonen. - Overvåk dyret for tumorvekst, vekttap og generell helsestatus som beskrevet i trinn 2.6.6.
- For retro-orbitale injeksjoner:
MERK: Bruk denne teknikken som et alternativ til hale vene injeksjoner når operatøren er opplært og dyktig i denne teknikken og når det er en sterk vitenskapelig begrunnelse. Cellefjæringer levert via denne ruten kan indusere tumorvekst i retro-orbitalrommet; Derfor bør det tas nøye hensyn til risikoene og fordelene når du velger denne teknikken. For eksempel, for å dra nytte av den direkte sirkulasjonsforbindelsen av retro-orbital venøs bihule med intracerebral vener via anastomoser, velg denne metoden når hjernesvulstdannelse har mislyktes ved hjelp av andre injeksjonsruter.- Utfør hele prosedyren inne i et biosikkerhetsskap for å opprettholde aseptiske forhold. Ikke sterilt verneutstyr og hansker.
- Bedøv dyret som beskrevet i trinn 2.3-2.4.
MERK: For denne prosedyren, ikke bruk steril petrolatum oftalmisk salve på dyrets øyne fordi dette vil hindre injeksjon; påfør kun lokale bedøvelsesdråper. - Last cellesuspensjonen i en insulinsprøyte med en 28-31 G, 6 mm nål.
- Med dyret i utsatt posisjon, trekk øyelokkene tilbake til øyet stikker ut. Påfør 1 dråpe lokalbedøvelse i øyet på siden som gjennomgår prosedyren.
- Sett nålen i en 30-45° vinkel mellom øyet og medial epicanthus med skråkanten vendt nedover. Injiser cellesuspensjonen (10-150 μL) langsomt.
MERK: Langsommere bevegelser forhindrer skade på øyet og tilbakestrømningen av injektatet. - Utfør trinnene som er beskrevet i 2.7.5-2.7.6.
- For miltinjeksjoner:
- Utfør hele prosedyren inne i et biosikkerhetsskap for å opprettholde aseptiske forhold31. Ikke sterilt verneutstyr og sterile hansker.
- Bedøv og barber dyret som beskrevet i trinn 2.3-2.5.
- Plasser dyret i en høyre lateral liggende stilling. Rengjør huden på prosedyreområdet med 3 anvendelser av 10% povidon-jod vekslende med 3 anvendelser av isopropylalkohol og forbered det kirurgiske feltet som beskrevet i trinn 2.9.5.
- Bruk Metzenbaum saks eller en skalpell, gjør et 1 cm snitt i venstre flanke av bukveggen etterfulgt av et snitt inn i bukhinnen.
MERK: Milten vil bli sett gjennom den gjennomskinnelige bukveggen etter å ha gjort huden snittet. Utfør det bukhinneale snittet nøyaktig på dette nettstedet. - Eksponer milten og milt hilum gjennom snittet. Bruk en 28-31 G insulin sprøytenål, 6 mm i lengde, punkter forsiktig milten med nålens skråkant vendt oppover og i en akutt vinkel.
MERK: Hvis punkteringssårene blør, cauterize nettstedet for å begrense blødning og tilbakestrømning. - Injiser hele volumet (50-100 μL) celleoppheng sakte. Fjern kanylen. Plasser en liten gasbind på milten og legg trykk med en tang. Klem milten lett mellom gasbindet ved hjelp av fine mygg tang og vent i 15 min.
- Utfør en praktektomi ved å binde milt hilum med en 3-0 eller 4-0 silke sutur, cauterizing karene om nødvendig. Lukk bukhinnen med en 5-0 polydioksanin (PDS) eller polygllykolsyreabsorberbar sutur.
- Utfør trinnene som er beskrevet i trinn 2.7.5-2.7.6.
MERK: Dyr som presenterer blødningskomplikasjoner eller som ikke har gjenopprettet fullt ut 72 timer etter operasjonen, bør humant avlives. Husk at musenes velvære er prioriteten til enhver tid.
3. Iscenesatt overlevelseskirurgi (SSS)
- Basert på eksperimentelle konklusjoner fra trinn 2.2, bestem riktig tid til overlevelseskirurgi. Avhengig av cellelinjen og eksperimentell hypotese, velg et tidligere tidspunkt for tumorreseksjon (ved et tumorvolum = 150 mm3) eller et senere tidspunkt (ved et tumorvolum = 500 mm3)26.
MERK: Tumorvolumgrensen er 1500 mm3 når tumorbyrden er høy nok til å være skadelig for dyrets velvære og predisponerer for komplikasjoner. - Bedøv og barber dyret som beskrevet i trinn 2.3-2.5.
MERK: Hele prosedyren utføres inne i et biosikkerhetsskap. - Rengjør huden på prosedyreområdet med 3 anvendelser av 10% povidon-jod vekslende med 3 anvendelser av isopropylalkohol og forbered det kirurgiske feltet som beskrevet i trinn 2.9.5.
- Bruk Iris saks eller en skalpell, oppskalere huden, opprettholde en 5-7 mm reseksjonsmargin fra kanten av svulsten.
MERK: Marginen for reseksjon avhenger av svulstens evne til å spre seg lokalt. For aggressive svulster, øk reseksjonsmarginen samtidig som du sørger for at nok hud er igjen til å utføre sårlukkingen. - Når det gjelder intradermale svulster, resect svulsten sammen med omkretsen hud.
- For subkutane svulster, disseker og fjern svulsten under huden.
MERK: Hvis svulsten invaderer bukhinnen og/eller huden, resect den en bloc med svulsten og lukk bukhinnen med 5-0/4-0 PDS eller polyglykolsyre absorberbare suturer. - Lukk såret med 9 mm stifteenhet.
MERK: Fjern stiftene 7-10 dager etter operasjonen. Administrer smertestillende medisiner og legg dyret på en varm pute for å gjenopprette. Fortsett å administrere smertestillende medisiner for 72 timer etter operasjonen, en gang hver 12 h i henhold til trinn 2.9.13. Dyr med blødningskomplikasjoner eller som ikke har gjenvunnet full bevissthet etter operasjonen, bør humant avlives. - Enkelthus dyret i et bur, på en varm pute for å gjenopprette. Returner dyret til vivariumburet etter å ha gjenvunnet bevisstheten, når sternal og ambulerende.
- Fortsett å overvåke dyrets postkirurgi for lokale gjentakelser, vekttap, nevrologiske, lokomotoriske og / eller atferdsmessige tegn (sløvhet, mangel på grooming, lavt mat- eller vanninntak) og generell helsestatus.
4. In vivo-avbildning (figur 2A)
- Administrer D-luciferin substrat (150 mg/kg) til dyr ved intraperitoneal injeksjon med en 1 ml insulinsprøyte, 28 G nål.
MERK: Tumorceller må transduseres stabilt med luciferase cDNA. - Induser anestesi som beskrevet i trinn 2.3-2.4, 6 min etter D-luciferin substrat injeksjon.
- Utfør avbildning ved hjelp av en BLI-skanner (bioluminescensavbildning) (in vivo-bildebehandlingssystem )26.
- Flytt dyret inne i bildekammeret og inn i nesekjeglen. Bilde opptil 5 dyr samtidig, avhengig av bildesystemets kapasitet.
- Start instrumentet ved å trykke initialiser. Still eksponeringstidsinnstillingen på auto (1-120 s).
- Ta et tomt bilde for å trekke fra en hvilken som helst bakgrunn om nødvendig. Klikk på Hent og lagre bildet etter at anskaffelsessekvensen er fullført.
- Plasser dyret tilbake i et bur, som sitter med 50% av baseoverflateområdet over en oppvarmingspute for å gjenopprette fra anestesi. Returner dyret til vivariumburet etter å ha gjenvunnet bevisstheten, når sternal og ambulerende.
- For dataanalyse i samme in vivo-bildeprogramvare som bildene ble tatt med, naviger til mappen der bildene er lagret, og åpne bildene av alle musene som gjelder eksperimentet samtidig.
MERK: Analyse av ett bilde om gangen tillater ikke normalisering på tvers av grupper. - Sett enhetene til utstråling (teller ikke). Kontroller at det ikke er merket av i avmerkingsboksen som angir at enkeltpersonen ikke er merket av, da dette utelukker normalisering av signal på tvers av grupper.
- Bruk tegneverktøyet Region of Interest (ROI) til å tegne sirkulære ROIer for hjerneregionen og rektangulære ROIer for kroppen. Vær forsiktig med å utelukke ørene og nesen fra hjernens avkastning, da de har en tendens til å avgi uspesifisert luminescens. For å minimere skjevheter i denne prosessen, tegn ROIer bare på musenes fotografier, uten at lystetthetssignalet er lagt over.
- Velg Mål ROIer for å kvantifisere signalet og eksportere dataene til et regneark. Analyser forskjeller mellom grupper ved å plotte total luminescerende flux (p/sek/cm2/sr) i kroppsområder av interesse.
MERK: For å vurdere forskjeller mellom grupper i hjernetropisme spesifikt, beregn forholdet mellom hjernesignalet og kroppssignalet for hver mus. Denne kontrollen for intermouse variasjon i generell tumorbyrde og forskjeller i nivåer av luciferase uttrykk mellom eksperimentelle grupper.
5. Ex vivo magnetisk resonansavbildning
- Utfør ex vivo MR umiddelbart etter eutanasi. Alternativt kan du høste organene av interesse, fikse dem i formalin i opptil 72 timer, og utføre avbildningen på et senere tidspunkt.
- Skaff bildene med et mikro-MR-system på 7 Tesla (7-T) (300 MHz) utstyrt med en NMR-konsoll og en nullkokt, horisontal boremagnet eller lignende utstyr.
MERK: Behovet for en aktivt skjermet gradientspoleinnsats med riktig avveining av ytelsen er avgjørende. Det må gi gradient linearitet på minst 50 mm dynamisk sfærisk volum (DSV) for å dekke settet med prøver undersøkt samtidig uten geometrisk forvrengning. Kombinasjonen av graderingsstyrke (fra 440 til 750 mT/m) og driftssyklus som muliggjør maksimale samtidige likestrømsstrømmer fra 3 x 30 A til 3 x 87 A, vil muliggjøre tilstrekkelig bildeytelse. Gradientspoleinnsatsen som brukes (se materialtabellen) muliggjør følgende ytelse: 660 mT/m, 130 μs stigningstid, 3 x 87 A og en DSV = 80 mm. - Utfør skanningene med en kommersiell sende-mottak sirkulært polarisert hele musen kroppen radiofrekvens spole (OD = 59 mm, ID = 38mm, L = 40 mm) innstilt til 300.16 MHz, 1H proton Larmor frekvens.
MERK: Denne rf-sonden muliggjør innsamling av 3D-datasett med submillimetrisk isotropisk oppløsning (<150 μm) under skanning over natten som strekker seg over 8-12 timer. - Oppdag tumorbyrden ved hjelp av flere sekvenser30.
MERK: Hyperintense signal oppdaget av en T2-vektet, Rapid Imaging med Refokuserte ekko (RARE) sekvens gjenkjenner ødem omkringliggende svulster. - Utfør 3D RARE-sekvensen med følgende anskaffelsesparametere: [120 μm]3 isotropisk oppløsning; oppkjøpstid 5 t, 27 min; repetisjonstid (TR) = 500 ms; ekkoavstand (ES) = 12,7 min; Turbo faktor TFx = 12; effektiv ekkotid (TEeff) = 76,2 ms; båndbredde (BW) = 75 KHz; Matrisestørrelse = 2843; synsfelt (FOV) = [4,0 mm]3; antall gjennomsnitt (Nav) = 6.
- Oppdag metastaser ved hjelp av følgende parametere.
- For pigmenterte metastaser med signallys, bruk en T1-vektet 3D Gradient ekkosekvens med følgende parametere: [120 μm]3 isotropisk oppløsning; oppkjøpstid 2 t, 41 min; TR = 20 ms; ekkotid (TE) = 4,0 ms; vend vinkel (FA) = 18°; BW = 75 KHz; Matrisestørrelse = 2843; FOV = [34,0 mm]3; Nav = 6.
- For upigmenterte og/eller hemoragiske metastaser, bruk et hypointenssignal når du anskaffer deg under en T2*-vektet, multigradient ekkosekvens (MGE) (3D MGE, [120 μm]3 isotropisk oppløsning; oppkjøpstid 3 t, 35 min; TR = 40 ms; TE = 3,6 ms; ES = 3,2 ms; 4 ekko; FA = 20°; BW = 100 kHz; Matrisestørrelse = 2843; FOV = (34,0 mm)3; Nav = 4.
- Bruk alle 3 sekvenser for å kvantifisere tumorbyrde.
- Kryssreferanse tumorområdene identifisert under analyse med histologiske seksjoner for å sikre nøyaktighet. Se avsnitt 7 og 8.
6. Vevsbehandling for encellet eller bulk RNA-sekvensering
- Avlive dyret ved å bruke en hvilken som helst metode godkjent av institusjonens IACUC. Se en av fremgangsmåtene som er beskrevet i merknaden i trinn 2.6.6.
- Dissekere organene av interesse og plassere dem i separate brønner av en tallerken som inneholder Hanks balanserte saltløsning (HBSS) på is. Arbeid raskt og hold vevet på is til enhver tid for å maksimere celle levedyktigheten.
MERK: Følgende trinn er spesifikke for hjernebehandling. Juster kollagentype til det spesifikke vevet, basert på dine behov. - Forbered en 6-brønns plate med 3 ml HBSS i hver brønn.
- For å visualisere og ytterligere bidra til å lede disseksjonen, bruk et fluorescensmikroskop og identifiser de merkede områdene.
- Disseker fluorescerende områder og plasser vevsfragmentene i 6-brønnsplaten (1 fragment per brønn hvis individuelle metastatiske foci skal analyseres eller flere fragmenter fra ett organ hvis flere metastaser i samme organ skal analyseres). Bruk sterile barberblader for å hakke vevet i fragmenter så små som mulig (uten å bruke mer enn 1-2 min på dette trinnet for hver prøve).
MERK: Hvis du begrenser behandlingstiden til svulstene, bidrar du til å bevare celle levedyktigheten. - Aspirer og overfør innholdet i hver brønn til et 15 ml konisk rør.
MERK: Klipp spissen på en pipettespiss på 1000 μL for å lette overføringen av større fragmenter. - Tilsett 1 ml HBSS i brønnen og sørg for at de resterende vevsfragmentene/cellene overføres til 15 ml-røret, som vil inneholde et endelig volum på 4 ml. Tilsett 50 μL kollagenalisse type I (40 mg/ml) og 12,5 μL DNase I (2000 enheter/ml) i hvert rør.
- Plasser de koniske rørene i et vannbad oppvarmet ved 37 °C i 45 minutter. Virvel kort de koniske rørene hvert 5.
- Forkjøp en 70 μm sil med HBSS. Bruk den avkappede enden av et sterilisert mikrosentrifugerør eller plastdelen av et sprøytestempel og slip vevet homogenater gjennom en 70 μm sil i et nytt 50 ml konisk rør.
MERK: Forvarm silene med HBSS- eller FACS-bufferen muliggjør anstrengelse. - Vask silen med 1 ml HBSS. Forkjøp en 40 μm sil med HBSS. Filtrer hver prøve igjen gjennom en 40μm sil i et nytt 50 ml konisk rør. Tilsett 1 ml FBS til 40 μm silen for å vaske den. Hold de koniske rørene på is hele tiden.
- Fyll opp det koniske røret til 50 ml med iskald DPBS. Snurr ned cellene (180 × g i 10 min ved 4 °C). Kast supernatanten, vær forsiktig så du ikke mister cellepellet.
MERK: For hjerneprøver, resuspend cellene i 2,5 ml 38% tetthet separasjon løsning (fortynnet i HBSS og lagre ved romtemperatur (RT)). Overfør til 5 ml FACS-rør. Spinn i 20 min ved 800 × g. Klipp spissen av en 1000 μL pipettespiss og fjern det øverste fettlaget. Ikke la noe fett på rørenes vegger. Hvis det er fett igjen, snurr du ned igjen og gjentar prosessen. Dette er et kritisk skritt. Fjern resten av væskefasen (pelletsen vil være gjennomsiktig og vanskelig å visualisere). - Resuspend cellene i 1 ml rød blodlegeme (RBC) lysis buffer og inkubere i 60 s ved RT. Slukke lysisløsningen ved å legge til 20 ml DPBS.
- Snurr ned cellene ved 180 × g i 10 min ved 4 °C. Fjern supernatanten og resuspend cellene i 2 ml FACS buffer (5% FBS i DPBS).
- Fortsett med å sortere merkede celler og/eller bibliotekforberedelse for enten bulk- eller encellet RNA-sekvensering.
MERK: Celler kan spunnes ned, snap-frozen og lagres ved -80 °C før RNA-isolasjon for bulk RNA-seq.
7. Dyrevevsperfusjon og forberedelse til immunhitologiske analyser
- Bedøv dyret med en overdose ketamin (300 mg/kg) og xylazin (30 mg/kg) cocktail ved intraperitoneal injeksjon med en insulin sprøyte og en 28 G nål.
- Eksponer hjertet ved grov disseksjon og gjør et snitt i riktig atrium. Hold hjertet forsiktig på plass med lange, buede tang vendt fremre.
MERK: Formalin og paraformaldehyd (PFA) er kreftfremkallende stoffer. Les sikkerhetsdatabladet (SDS), unngå eksponering for røyk og bruk riktig personlig verneutstyr. - Bruk en 10 ml sprøyte med en 22 G, 22 mm kanyle, injiser 10 ml DPBS etterfulgt av 10 ml PFA i venstre ventrikel.
- Fortsett å høste organene og last dem inn i forhåndsmerkede histologiske kassetter. Plasser kassettene i en beholder i riktig størrelse som har plass til nok fikseringsmiddel (formalin) til å dekke vevet.
MERK: Ideelt sett bør fikseringsvolumet være 5-10 ganger volumet av vevet. - Fest organene inne i de histologiske kassettene i 10% formalin i 48-72 timer. Kast 10% formalin og vask kassettene to ganger med 1x DPBS.
- Begynn dehydreringsprosessen ved å nedsenke kassettene i 70% etanol i 2 timer. Fortsett å senke kassettene suksessivt i økende etanolkonsentrasjoner: 80%, 95%, 100% i 1 time hver. Bytt 100% oppløsning to ganger etter 1,5 timer. Senk kassettene ned i xylen i 1,5 timer og utfør tre endringer i løsningen.
- Legg kassettene i parafinvoks ved 58-60 °C. Seksjon parafinblokkene. Fortsett til hematoksylin og eosin (H&E) orimmunohistokjemi farging.
- For å identifisere melanomceller, bruk en av disse markørene eller et panel: S100, Melan-A, HMB-45, Tyrosinase, MITF. Når det er mulig, bruk NuMA(Nuclear Mitotic Apparatus Protein) farging, da det er en svært spesifikk menneskelig cellemarkør.
MERK: NuMA-farging gir en skarp avgrensning mellom vert (mus) og engraferte celler (humane) som hjelper til med bildebehandling og påfølgende tumorkarantifiseringsstadier.
Figur 2: Eksempler på BLI-, brightfield-, ex vivo-fluorescens og H&E-fargebilder som illustrerer den multipronged tilnærmingen for analyse av kandidatgeners effekter i melanommetastase. (A) BLI, (B) BF, (C) ex vivo fluorescens og (D) H&E fargebilder. Bildene som brukes til illustrasjonsformål tilsvarer et eksperiment der 131/6-4L melanomceller transdusert med en ikke-målrettet kontroll shRNA (shNTC) eller en shRNA-målretting FUT8 ble injisert i immunodeficient (NSG) mus. FUT8-silencing svekket den metastatiske spredningen av melanomceller. Skalastenger og fargestang = p/sek/cm2/sr × 106 (A), 100 mm (B, C), 100 μm (D). Forkortelser: BLI = bioluminescensavbildning; H&E = hematoksylin og eosin; shRNA = kort hårnål RNA; shNTC = ikke-målrettingskontroll shRNA; NSG = ikke-overvektig diabetiker alvorlig kombinert immunsvikt gamma; FUT8 = fucosyltransferase 8; BF = brightfield. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
8. NuMA-flekker (Nuclear Mitotic Apparatus Protein) (figur 3)
- Bruk et anti-NuMA-antistoff som en svært menneskespesifikk mititotisk spindelmarkør for identifisering og kvantifisering av metastatisk belastning i vevsseksjoner. 8.1. Svært spesifikk og sensitiv identifisering av melanomceller oppnås.
- Hvis kromogene immunhistokjemi for NuMA utføres på et automatisk immundempende instrument, følg disse trinnene som beskrevet32:
- Deparaffiniser seksjonene i xylen og rehydrer dem i sekvensielt avtagende etanolkonsentrasjoner. Hold lysbildene nedsenket i 15 minutter i xylen og overfør dem til 100% etanol i ytterligere 15 minutter.
MERK: Resten av etanol rehydreringstrinnene (95%, 80%, 75%) varer i 3 til 5 min hver. - Skyll lysbildene i deionisert vann.
- Utfør epitoputhenting ved å senke skliene ned i en beholder (f.eks . Coplin-fargekanne) i 10 mM natriumsitratbuffer, pH 6,0, i en 1200 Watt mikrobølgeovn med 100 % effekt i 10 minutter.
- Bruk ukonjugert, polyklonal kanin antimennesket NuMA antistoff for merking, fortynnet 1:7,000 i Tris-Bovine serum albumin (BSA) (25 mM Tris, 15 mM NaCl, 1% BSA, pH 7.2). Kjør de aktuelle positive og negative kontrollene parallelt med studiedelene.
- Inkuber lysbildene med det primære antistoffet i 12 timer. Oppdag det primære antistoffet med geit anti-kanin HRP konjugert multimer og visualiser komplekset med 3,3-diaminobenzidin og en kobbersulfatforsterker.
- Vask lysbildene i destillert vann, motstain med hematoksylin, dehydrer og monter med permanent medium.
MERK: Dehydreringstrinnene er motsatt av rehydreringstrinnene som er beskrevet i trinn 8.3. Skann lysbildene med den tilgjengelige skanneren med 20x eller 40x forstørrelse og last dem opp til en database. - Bruk programvare til å tegne ROIer for å inkludere alle NuMA-fargede celler i organvevet, unntatt andre organparenchyma og tomme mellomrom.
- Juster innstillingene for å kategorisere NuMA-positive og NuMA-negative celler mens du bruker passende positive og negative kontroller for hvert organ. Bruk en etablert programvarealgoritme til å kvantifisere det totale antallet/prosenten av NuMA-positive celler for hvert utvalg.
9. Vev skiver immunfluorescens
For å identifisere det metastatiske stadiet der en bestemt genkandidat er nødvendig (f.eks. ekstravasasjon vs. overlevelse etter sådd), kan man bestemme vevsskiveimmunofluorescence på forskjellige tidspunkter for å spore tumorcelleprogresjon fra injeksjon til fjern organinvasjon, såing og vekst. Denne tilnærmingen gjør det mulig å legge til markører for nærliggende celler for å fange ekstravasasjonshendelsen og de omkringliggende tumormikromiljøet endres33.
- Bedøv dyret som beskrevet i trinn 7.1.
- Injiser 100 μg fluorofor konjugert Lycopersicon Esculentum (Tomat) Lectin i venstre ventrikel av hvert dyr, 3 min før perfusjon, for å avgrense det vaskulære endotelet.
MERK: La Tomat Lectin resirkulere i hele systemet. - Perfuse dyret som beskrevet i trinn 7.2-7.3. Høst organene av interesse og overfør dem til forhåndsmerkede beholdere fylt med 4% PFA. Fest vevet i 24 til 48 timer. Del vevet ved hjelp av en vibratom i 30-50 μm tykke skiver.
MERK: Tykkelsen bør optimaliseres. Skiver mellom 30 μm og 50 μm tykkelse anbefales, spesielt når du utfører z-stack bildebehandling. - Inkuber sektorene i blokkeringsbuffer (10 % normalt geiteserum, 2 % BSA, 0,25 % Triton X-100 i DPBS) i 2 timer ved RT.
- Utfør et fargeoptimaliseringseksperiment.
MERK: Ettersom antigengjenvinningstid, buffere som brukes til antigenuthenting, temperatur, forskjellige antistoffer / forskjellige partier, og typen vev påvirker fargingen, er det nødvendig med optimaliseringsforsøk. - Tilsett primære antistoffer ved en optimalisert fortynning og inkuber for en optimalisert tid ved en optimalisert temperatur (se eksempler i tabell 1).
MERK: Bruk passende kontroller for primære/sekundære antistoffer og uoppdagede vevsprøver. - Vask vevskivene 3 ganger i 5 min med 0,25% Triton X-100 i DPBS.
- Inkuber vevskivene i sekundært antistoff fortynnet i blokkeringsløsning for ønsket tid (tabell 1).
- Vask vevskivene 3 ganger i 5 min med 0,25% Triton X-100 i DPBS.
- Flekk kjernene med 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) fortynnet 1:1,000 i DPBS eller blokkering buffer i 5 min.
- Tilsett 2 dråper antifade fluorescensmonteringsmedium til en dekslelip og monter vevet på glasssklier, og sørg for at skivene er fullt dekket av monteringsmedium.
MERK: Pass på at det ikke er luftbobler direkte på skivene, da dette forvrenger mikroskopi. - Ta konfokale bilder med det tilgjengelige mikroskopet ved hjelp av et 60x oljeinnlevelsesmål.
MERK: Når du anskaffer konfiskeringsbilder, bruker du de samme innstillingsparametrene (spenning, luftige enheter og forsterkning) på tvers av alle bildene i eksperimentet. - Ta ikke-konfiskeringsbilder ved hjelp av mikroskopet ved 10x, 20x eller 40x.
- Last opp bildene i en bildeanalyseprogramvare og analyser dem ved å sammenligne de valgte parametrene (dvs. område, antall, intensitet av markører eller kontakt med tilstøtende celler).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Følgende tall illustrerer hvordan den beskrevne arbeidsflyten er anvendt for identifisering av nye drivere av melanommetastase. Figur 2 oppsummerer resultatene av en publisert studie der effekten av å dempe fucosyltransferase FUT8 i in vivo melanommetastase ble studert26. Kort fortalt viste analyse av humane pasientglykomiske data (innhentet ved lectin arrays) og transkripsjonsprofilering økte nivåer av alfa-1,6-fucose forbundet med progresjon fra primær til metastatisk melanom, i samsvar med en økning i tilsvarende fucosyltransferase (FUT8).
113/6-4L melanomceller transdusert med lentivirus med FUT8 shRNA eller tilsvarende ikke-målrettingskontroll (shNTC) ble introdusert ved ultralydstyrt intrakardiakuminjeksjon i immunodeficient mus (NSG), som beskrevet ovenfor (pkt. 2.9). Musene ble overvåket for metastatisk formidling av in vivo BLI. Musene ble euthanized på slutten av eksperimentet, organene ble undersøkt for ex vivo fluorescens og behandlet for histologiske analyser. I tillegg til H&E ble NuMA-farging utført for å spesifikt identifisere menneskelige celler i murinvev. Som illustrert i figur 3 ble NuMA-fargede seksjoner behandlet ved digital avbildning for å kvantifisere den metastatiske byrden på tvers av flere seksjoner og eksperimentelle grupper. En lignende arbeidsflyt kan anvendes for å vurdere andre kandidatgeners bidrag til melanommetastase.
Figur 3: NuMA-fargede lungeseksjoner. (A) Venstre, representative bilder av NuMA-fargede lungeseksjoner fra gruppe I (melanomceller infisert med kontroll lentivirus) og gruppe II (melanomceller infisert med metastaseringsdemper-uttrykkende lentivirus). Skalastenger = 1000 μm. Innsett viser metastatiske foci (i midten) som kan kvantifiseres ved hjelp av programvare. Høyre, metastatiske melanomceller er merket grønne, og orgelområdet avgrenses av en grønn klekket linje. NuMA-negative celler er merket med blått. Skalastenger = 100 μm. (B) Eksempel på mikrometastase i NuMA-fargede lungeseksjoner illustrerer programvarens følsomhet ved å oppdage et lite antall celler. Skalastenger = 100 μm. Forkortelse: NuMA = Kjernemitotisk apparat protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Antistoff | Fabrikant | Katalognr. | Vertsarter | Reaktivitet | Fluorofor | Fortynning | Inkubasjonstid | Inkubasjonstemperatur |
| anti-GFP | Abcam | ab6556 | Kanin | Mus | ikke-konjugere | 1:1000 | 24 timer | 4°C |
| anti-GFAP | Aves-laboratorier | GFAP | Kylling | Mus | ikke-konjugere | 1:2000 | 24 timer | 4°C |
| sekundær | Invitrogen | a11041 | Geit | Kylling | A568 | 1:500 | 2 timer | Romtemperatur |
| sekundær | Invitrogen | a32731 | Geit | Kanin | A488 | 1:500 | 2 timer | Romtemperatur |
Tabell 1: Eksempler på antistoff- og inkubasjonstilstander for immunfluorescens i hjerneskiven.
| Cellelinje | Type | På tide å eutanasi | Kjønn av mus | Genetisk bakgrunn av mus | Injeksjonsvei | # Celler injisert | Områder for metastase | |
| 12-273 BM+ | Humant melanom STC | 4-5 uker | M | NSG | Intrakardium | 100 000 | Hjerneparenchyma, leptomeninges, lever, nyre, binyrene | |
| 131/4-5B1* | Menneskelig melanom | 4-6 uker | M | Athymic naken eller NSG | Intrakardium | 50-200K | Hjerneparenchyma, lever, lunge | |
| 113/6-4L* | Menneskelig melanom | 5-7 uker | M | Athymic naken eller NSG | Intrakardium | 50-100K | Hjerneparenchyma (få), lever, lunge | |
| WM 4265-2** | Humant melanom STC | 11 uker | M | Athymic naken eller NSG | Intrakardium | 200 000 | Hjerne parenchyma | |
| WM 4257-1** | Humant melanom STC | 10-13 uker | M | Athymisk naken | Intrakardium | 100 000 | Hjerneparenchyma (få) | |
| WM 4257-2** | Humant melanom STC | 10-13 uker | M | Athymisk naken | Intrakardium | 100 000 | Hjerne parenchyma | |
| 10-230 BM+ | Humant melanom STC | 8-9 uker | M | Athymisk naken | Intrakardium | 100 000 | Hjerneparenchyma, leptomeninges, lever (få) | |
Tabell 2: Nedbrytning av resultater fra representative in vivo-eksperimenter av ulike menneskelige melanomcellelinjer og kortsiktige kulturer etter den beskrevne protokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målet med denne tekniske rapporten er å tilby en standardisert, topp-til-bunn arbeidsflyt for undersøkelse av potensielle aktører i melanommetastase. Ettersom in vivo-eksperimenter kan være kostbare og tidkrevende, er strategier for å maksimere effektiviteten og øke verdien av den oppnådde informasjonen avgjørende.
Det er viktig å bruke komplementære tilnærminger gjennomgående for å kryssvalidere funn i samme eksperiment. For eksempel er både NuMA immunhiistokjemisk farging og BLI komplementære metoder for å kvantisere metastatisk byrde fordi ingen av dem er omfattende. Mens BLI er en uvurderlig, ikke-invasiv metode for å spore tumorprogresjon in vivo, er disse dataene iboende av lav oppløsning. NuMA farging tillater omhyggelig analyse av metastatisk byrde i faste organer; Imidlertid er omfattende seksjonering gjennom hele vevstykkelsen upraktisk. Som sådan kan bare en prøve av hvert organ farges. Faktisk, i forfatternes erfaring, er BLI-resultatene ikke alltid direkte proporsjonale med tumorbyrden som er tydelig i histopatologisk analyse. Dette skyldes delvis den begrensede følsomheten til denne metoden, spesielt i hjernen, på grunn av transkraniell demping34. I tillegg kan disse dataene påvirkes av ufullstendig luciferinopptak og/eller variabelt luciferaseuttrykk. Derfor bør BLI tolkes i forbindelse med ex vivo-avbildning og histopatologiske studier.
Histologisk evaluering av vevsprøver behandlet med generiske flekker, som H&E, krever spesialisert anatomopatologiopplæring, er ofte lavgjennomstrømning, og er utsatt for interobservervariasjoner. Forfatterne jobber for tiden med bioinformatikkkolleger for å standardisere og akselerere eksperimentell dataanalyse ved å utvikle en maskinlæringsalgoritme for automatisert og pålitelig kvantisering av metastatisk byrde som en prosentandel av organvevsseksjonen i histopatologiske bilder. Disse og andre verktøy vil være kritiske for feltet, spesielt ettersom rollen til det metastatiske mikromiljøet kommer i fokus med en finere oppløsning (f.eks. romlig transkripsjon). Likevel er ekspert histopatologisk evaluering av vevet viktig, spesielt i undertyper av hjernemetastase som leptomeningeal, en biologisk distinkt undertype, som lett feiltolkes som parenchymal hjernemetastase via BLI alene. NuMA-farging (avsnitt 8) akselererer den histopatologiske vurderingen av metastatisk byrde, noe som muliggjør objektiv identifisering og kvantifisering av menneskelige celler i museorganer. Skillet mellom anatomiske rom på NuMA-fargede seksjoner, som hjerneparenchyma kontra leptomeningene, er imidlertid avgjørende for å få ytterligere biologisk innsikt.
Teknikkene som er beskrevet her, kan brukes til å undersøke den funksjonelle relevansen av gener av interesse for melanommetastatisk kaskade. Det er viktig å velge en modell med en reproduserbar fenotype som passer for den aktuelle studien. For eksempel kan et gen oppregulert i menneskelige pasientprøver av metastase bli "slått ned" for å vurdere om dette reduserer metastatisk byrde sammenlignet med en kontrollgruppe. Denne tilnærmingen utføres best i en modellcellelinje eller kortsiktig kultur som inneholder både a) høyt uttrykk for genet av interesse og b) genererer betydelig metastatisk byrde med pålitelig kinetikk når den injiseres i mus, slik at en reduksjon i metastatisk kapasitet vil bli merkbar og tildeler den genetiske perturbasjonen som testes.
Også avgjørende i eksperimentell design er den valgte injeksjonsmodusen som passer best til metastaseringsstadiet som undersøkes. Hvert trinn av den metastatiske kaskaden presenterer distinkte biologiske og fysiske barrierer for melanomceller. Etterforskere som ønsker å svare på spørsmål om de første stadiene av metastase, nemlig invasjon og intravasasjon, bør anvende teknikkene som er skissert i avsnitt 2 for henholdsvis intradermale og subkutane injeksjoner, etterfulgt av overlevelseskirurgi (avsnitt 3). Viktigst, disse prosedyrene etterligner prosessen der primære melanomer blir resected hos mennesker, hvoretter en pasient kan eller ikke kan presentere med metastase. Mens det teknisk sett er mer delikat enn subkutan injeksjon, planter den intradermale ruten tumorceller i det anatomiske rommet der melanomer utvikler seg hos menneskelige pasienter. Dette er spesielt viktig i studier av immunovervåking av melanom, da huden har et unikt økosystem for patruljering av immunpopulasjoner35.
Men hvis hypotesen som testes sentrerer seg om senere stadier av metastase, for eksempel ekstravasasjon fra arteriell sirkulasjon, er metoder som intrakarakum, intracarotid og retro-orbital injeksjon fordelaktige. Disse teknikkene gir metastase i større skala i en mye kortere tidsperiode enn de som involverer en "primær" svulst. Spesielt for studier av hjernemetastase kan modeller som på en pålitelig måte produserer svulster i hjernen parenchyma være vanskelig å etablere. I disse tilfellene representerer intracarotid og retro-orbital injeksjon metoder for å omgå organer med lavere "inngangsbarrierer", som lever og nyrer, noe som kan forårsake for tidlig dødelighet hos mus injisert via intrakardiensveien.
Musens genetiske bakgrunn for valg for xeno- eller allografttransplantasjon avhenger av kilden til celler (menneske, mus) og av og til på genetiske modifikasjoner av de implanterte cellene som kan fremkalle immunavvisning. Eksperimenter som involverer humane xenograftmodeller utføres vanligvis hos mus med nedsatt adaptivt og medfødt immunforsvar, NOD.Cg PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mus; eller mus som mangler adaptiv immunitet, for eksempel T-cellemangel athymic / nude (NU / J) mus. En annen immunodeficient modell ofte brukt er RAG2 knockout (KO) modell, som mangler B og T celler og beholder en funksjonell naturlig killer celle populasjon. Disse immunodeficient musemodellene må distribueres strategisk, da hver har fordeler på bekostning av noen ulemper knyttet til deres iboende immunmangler. Etter forfatternes erfaring viser den samme cellelinjen eller pasientavledede STC forskjellig organtropisme basert på injeksjonsveien (f.eks. subkutan vs. intrakarakum) og/eller mottakerens musestamme (f.eks. NSG vs. athymisk/naken) (se tabell 2).
For å redusere den eksperimentelle variasjonen knyttet til verten der melanomceller implanteres (f.eks. immunrespons, mikrobiota) og maksimere 'på målet' og reproduserbare funn, anbefales følgende: i) øke antall eksperimentelle dyr per gruppe (ved hjelp av kraftberegninger for å nå et optimalt antall basert på effektstørrelsen), ii) ved hjelp av ortogonale metoder for å manipulere genkandidater (dvs. CRISPR/Cas9-, CRISPRi-, shRNA- og add-back-eksperimenter (dvs. samtidig ektopisk uttrykk for en Cas9- eller shRNA-resistent cDNA av genet av interesse). Disse komplementære teknikkene reduserer off-target effekter mulighet og / eller biologisk og eksperimentell variasjon.
Selv om denne protokollen sikkert kan brukes til hypotesedrevet validering av kandidatdrivere eller undertrykkere av metastase, kan disse metodene også være nyttige for objektive, utforskende studier. Samlet CRISPR/cas9, CRISPR-KRAB-dCas9 (CRISPRi) og shRNA-baserte skjermer gjør det mulig for en prosess med darwinistisk utvalg å spille ut in vivo36. Det konseptuelle grunnlaget for slike studier er som følger: En celle med et gen slått ut som er avgjørende for fenotypen av interesse (f.eks. tumorvekst) vil dø eller unnlate å spre seg, slik at representasjonen i det sekvenserte biblioteket reduseres ved avslutningen av eksperimentet i forhold til grunnlinjen. Prosedyrene beskrevet her kan brukes for en slik tilnærming, med passende optimalisering37,38.
Når det gjelder kandidatgenvalg, kan flere kilder utvinnes. Melanoma pasienttranskripsjons- og proteomikkdatasett er offentlig tilgjengelig via NCBI Gene Expression Omnibus (GEO)39, European Genome-Phenome Archive40, cBioPortal41 (som er vert for The Cancer Genome Atlas, eller TCGA42) og andre vertssteder. Reanalysering av rådata anbefales da kvalitetskontrolltiltak kan variere sterkt mellom offentlige databaser, noe som påvirker resultatene. Ved avhør av rådatasett inkluderer spørsmål som passer for kandidatgenvalg egnet for anvendelse på arbeidsflyten beskrevet her: hvilke gener er dysregulert i metastatiske prøver sammenlignet med primære melanomprøver eller til melanocytisk nevi?; hvilke gener er dysregulert på bestemte steder av metastase?; er det dysregulerte uttrykket av kandidatgenet forbundet med forbedret pasientoverlevelse?; er dette genet en del av et større genuttrykksprogram som generelt er dysregulert?; er interaktivitetene til genproduktet godt karakterisert eller ukjent?; er genproduktet legemiddelbart, og i så fall er målrettingsverktøy tilgjengelige?; og svært viktig, er genet avgjørende for alle menneskelige celler, eller for mange vev, slik at interferens med sin aktivitet i en klinisk setting kan vise seg giftig?
Den riktige strategien for manipulering av genene av interesse avhenger av hypotesene som skal testes. For eksempel kan et gen oppregulert i metastase slås ned for å vurdere om de tilsvarende musene vil vise redusert metastatisk byrde sammenlignet med en kontrollgruppe. Denne tilnærmingen utføres best i en modellcellelinje eller kortsiktig kultur, som inneholder både: a) høyt uttrykk for genet av interesse og b) genererer merkbar metastatisk byrde når den injiseres i mus med reproduserbare kinetikk. Knockdown tilnærminger inkluderer shRNA- og CRISPR / Cas9-baserte metoder, som begge kan konstrueres via lentiviral infeksjon av melanomceller og distribueres på en induserbar eller konstituerende måte. En av fordelene med inducible uttrykk (se pLKO Tet-On i materialtabellen) er den tidsmessige reguleringen av knockdown, som kan utnyttes i et in vivo-eksperiment . Dermed kan induserbare shRNAer/sgRNAer brukes til å modellere en "terapeutisk setting" der etablerte tumorceller blir utsatt for en kandidatgen-knockdown. Eksponering for induserende middel, for eksempel doxycyklin, kan imidlertid ha konsekvenser for oppførselen til visse melanomceller; Som sådan er inkludering av kontrollceller transdusert med en kryptert shRNA som også opplever denne behandlingen kritisk.
Mens shRNAer ofte gir en delvis knockdown av genuttrykk, redigerer CRISPR / Cas9-baserte systemer et gen på DNA-nivå, teoretisk fremkaller en komplett "knockout" (KO). Deres bruk presenterer både fordeler og ulemper. Hvis et gen er avgjørende for melanomcelle levedyktighet, vil celler med en komplett KO bli negativt valgt in vitro og senere in vivo. Selv om dette problemet kan delvis reduseres ved å velge encellede kloner, sliter melanomceller med å vokse fra enkeltceller, noe som resulterer i uforutsigbare og ofte forskjellige tilpasninger. Dermed må flere KO-kloner testes for å kontrollere for interklonale fenotypiske variasjoner. Videre, når det gjelder pasientavledede kjønnssykdommer spesielt, kan antall lentivirale infeksjoner som melanomceller blir utsatt for, i stor grad påvirke in vitro-spredning og in vivo metastatisk oppførsel. Derfor anbefales en enkeltvektor, enkeltinfeksjonstilnærming med Cas9 og en sgRNA (se lentiCRISPRv2 i materialtabellen). Andre systemer benytter seg av en "rekombinin død" Cas9 for å fremkalle transkripsjonell undertrykkelse (dCas9-KRAB i materialtabellen).
En funksjonsgevinsttilnærming kan være hensiktsmessig hvis et gen av interesse er hypoteset om å være et metastaseringsfremmende gen. I dette tilfellet er valget av en melanomlinje som gir få metastaser ved injeksjon hos mus og med lavt basalt uttrykk for interessegenet nøkkelen. Overekspressjonskonstruksjoner (spesielt de som drives av CMV-promotører) fører ofte til suprafysiologiske uttrykksnivåer, noe som forårsaker protetoksisk stress. Derfor anbefales det å velge lentivirale vektorer som tillater det fysiologiske uttrykket av genet av interesse.
Når en tilnærming er valgt, er det viktig å utføre følgende eksperimenter før engraftment av celler. Lentivirale infeksjonsprosedyrer varierer mellom laboratorier og vil nødvendiggjøre optimalisering for hver cellelinje og knockdown-system. Universelle hensyn inkluderer imidlertid et fullstendig positivt eller negativt utvalg av celler med gennedslag (f.eks. FACS/cellesortering for fluorescerende reportere eller valg av antibiotikaresistens, hvis aktuelt), etterfulgt av RT-qPCR og vestlig blott med passende kontroller for å demonstrere reproduserbar og robust knockdown eller overekspression av genet av interesse. En in vitro proliferation analyse bør utføres for å avgjøre om forstyrrelse av genet av interesse påvirker cellens levedyktighet. Dette trinnet er viktig for pålitelig cellekarakterisering og for riktig tolkning av in vivo-resultater . Her er et eksempel på en fallgruve hvis de beskrevne forsøkene ikke utføres: Hvis en gennedslag resulterer i en drastisk spredningsfeil in vitro, vil dette forvirre tolkningen av redusert metastatisk byrde, da det spesifikke bidraget fra dette genet til den metastatiske kaskaden ikke kan vurderes nøyaktig. Ulike modaliteter av spredningsanalyser inkluderer kommersielt tilgjengelige sett, levende celleavbildningssystemer eller tradisjonelle cellekulturbaserte analyser, for eksempel krystallfiolett, trypanblå ekskludering.
Blant de viktigste begrensningene for denne plattformen i å oppdage meglere i melanom er at den foreslåtte arbeidsflyten undersøker bare tumorcelleintrinsiske genkandidater, ikke gener uttrykt av cellene i det omkringliggende mikromiljøet på forskjellige metastatiske stadier, som er viktige modulatorer av tumorcelletilpasning og såing av distale organer. En annen viktig faktor å vurdere er differensial metastatisk oppførsel basert på engraftmentruten. Den interlaboratoriske og interoperatorvariabiliteten som er iboende for noen av teknikkene som presenteres, kan løses ved standardisering på tvers av metastaseringsforskningsfeltet. For tiden er den mest passende protokollen for standardisering intrakariacinjeksjonen på grunn av ultralydveiledningen og statiske injeksjonsenheter, noe som reduserer interoperatorvariabiliteten. Denne protokollen representerer et av de mange trinnene i retning av ensartethet, reproduserbarhet og grundig dokumentasjon av metoder som brukes på tvers av laboratorier som arbeider med identifisering av nye meglere av melanommetastase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å erklære.
Acknowledgments
Vi takker Divisjonen for avanserte forskningsteknologier (DART) ved NYU Langone Health, og spesielt Experimental Pathology Research Laboratory, Genome Technology Center, Cytometry and Cell Sorting Laboratory, Pre-Clinical Imaging Core, som delvis støttes av Perlmutter Cancer Center Support Grant NIH / NCI 5P30CA016087. Vi takker NYU Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group (PI: Dr. Iman Osman) for å gi tilgang til pasientavledede melanom kortsiktige kulturer+ (10-230BM og 12-273BM), som ble oppnådd gjennom IRB-godkjente protokoller (Universal Consent study #s16-00122 og Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group studie #10362). Vi takker Dr. Robert Kerbel (University of Toronto) for å ha levert 113/6-4L og 131/4-5B1 melanomcellelinjer* og Dr. Meenhard Herlyn (Wistar Institute) for å gi WM 4265-2, WM 4257s-1, WM 4257-2 melanom kortsiktige kulturer**. E.H. støttes av NIH/NCI R01CA243446, P01CA206980, American Cancer Society-Melanoma Research Alliance Team Science Award og en NIH Melanoma SPORE (NCI P50 CA225450; PI: I.O.). Figur 1 ble opprettet med Biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #15 Scapel Blade | WPI | 500242 | For surgical procedures |
| #3 Scapel Handle | WPI | 500236 | For surgical procedures |
| 1 mL Tuberculin syringe, slip tip | BD | 309626 | Injections |
| 10 mL syringe, slip tip | BD | 301029 | Perfusion |
| 10% Formalin Sodium Buffered | EK Industries | 4499-20L | For perfusion/tissue fixative |
| 15 mL Conical | Corning | 430052 | Cell culture |
| 15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes | Falcon | 352196 | Cell culture |
| 200 Proof Ethanol | Deacon Labs | 04-355-223 | Histology |
| 22G – 22mm needle | BD | 305156 | Perfusion |
| 4-0 Vicryl Suture | Ethicon | J464G | Suture |
| 4% Carson's phosphate buffered paraformaldehyde | EMS | 15733-10 | For perfusion/tissue fixative |
| 40µm | Corning | 431750 | Tissue processing |
| 5-0 Absorbable Suture | Ethicon | 6542000 | Closure |
| 50 mL Conical | Corning | 430828 | Cell culture |
| 50mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | Cell culture |
| 7-0 Silk suture | FST | 18020-70 | Ligature |
| 70µm | Corning | 431751 | Tissue processing |
| Anti-fade mounting media | Vector Labs | H-1000-10 | Immunofluorescence |
| Approximator applying Forceps, 10cm | WPI | 14189 | For microsurgical procedures |
| Avance | Bruker | 3 HD | NMR Console |
| Biospec 7030 | Bruker | 7030 | Micro MRI |
| BSA | Bioreg | A941 | NuMA Staining |
| Castroviejo suturing forceps, straight tips 5.5mm tying platform, 11cm | WPI | WP5025501 | For microsurgical procedures |
| Coplin Staining Jar | Bel-Art | F44208-1000 | Histology |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Immunofluorescence |
| dCas9-KRAB | Addgene | 110820 | Genetic manipulation |
| DNase I | NEB | M0303L | Tissue processing |
| DPBS | Corning | 21-030-CM | Tissue processing |
| Extra Sharp Uncoated Single Edge Blade | GEM | 62-0167 | Tissue processing |
| Extracellular Matrix Substrate | Corning | 354234 | Consider the Growth Factor Reduced ( as alternative |
| FBS | Cytiva | SH30910.03 | Cell culture |
| Fiji Image J | Fiji Image J | Software | Immunofluorescence |
| Goat anti-rabbit HRP conjugated multimer | Thermo Fisher | A16104 | NuMA Staining |
| Goat Serum | Gibco | PCN5000 | Immunofluorescence |
| HBSS | Corning | 21-020-CV | Tissue processing |
| Hematoxylin | Richard-Allan Scientific | 7231 | Histology |
| Illumina III | PerkinElmer | CLS136334 | BLI Instrument |
| Insulin syringe 28G - 8mm needle | BD | 329424 | Injections |
| Insulin syringe 31G - 6mm needle | BD | 326730 | Injections |
| Iris Forceps, 10.2cm, Full Curve, serrated | WPI | 504478 | For perfusion and surgical procedures |
| Isoflurane USP | Covetrus | 11695067772 | Anesthesia |
| Jewelers #7 Forceps Titanium 11 cm 0.07 x 0.01 mm Tip | WPI | WP6570 | For microsurgical procedures |
| Ketamine HCl 100mg/mL | Mylan Ind. | 1049007 | Anesthesia |
| lentiCRISPRv2 | Addgene | 98290 | Genetic manipulation |
| Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin, DyLight 649 | Invitrogen | L32472 | Vascular endothelial cells marker |
| MEM non-essential amino acids X 100 | Corning | 25-025-CI | Cell culture |
| Metzenbaum Scissors | WPI | 503269 | For surgical procedures |
| Microinjection Unit | KOPF | 5000 | Intracardiac injections |
| NaCl | Fisher | S25877 | NuMA Staining |
| Needle 30G x 25mm | BD | 305128 | Intracardiac Injection |
| Needle 33G x 15mm | Hamilton | 7747-01 | Intracarotid Injection |
| Needle holder, Castroviejo, 14cm, with lock, 1.2mm Serrated Jaws | WPI | 14137-G | For microsurgical procedures |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice | The Jackson Laboratory | 005557 | Murine model |
| NU/J mice | The Jackson Laboratory | 002019 | Murine model |
| Nuclear Mitotic Apparatus Protein polyclonal rabbit anti-human | Abcam | 97585 | NuMA Staining |
| Penicillin-Streptomycin 10000U/mL | Gibco | 15140122 | Cell culture |
| Percoll | GE | 0891-01 | density separation solution |
| PI Classic Surgical Gloves | Cardinal Health | 2D72PT75X | Surgery |
| pLKO Tet-On | Addgene | 21915 | Genetic manipulation |
| Povidone-Iodine 10% Solution | Medline | MDS093943 | Surgery |
| Proparacaine Drops 0.5% | Akorn Pharma | AX0501 | Opthalmic local anesthetic |
| Puralube Petrolatum Opthalmic Ointment | Dechra | 83592 | Anesthesia |
| Razor Blade Double Edge Blades | EMS | 72000 | Shaving and Vibrotome Brain Slicing |
| Reflex 9mm EZ Clip | Braintree | EZC- KIT | Wound closure |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CM | Cell culture |
| Scissors, Spring 10.5cm Str, 8mm Blades | WPI | 501235 | For microsurgical procedures |
| Semi-Automatic Vibrating Blade Microtome | Leica | VT1200 | Brain Slice Immunofluorescence |
| Single Channel Anesthesia Vaporizer System | Kent Scientific | VetFlo-1210S | Anesthesia |
| Smartbox Tabletop Chamber System and Exhaust Blower | EZ Systems | TT4000 | CO2 Euthanasia |
| Sterile Fenestrated Disposable Drape | Medline | NON21002 | Surgery |
| Sterile Non-Reinforced Aurora Surgical Gowns with Set-In Sleeves | Medline | DYNJP2715 | Surgery |
| T25 Flask | Corning | 430639 | Cell culture |
| Tris | Corning | 46-031-CM | NuMA Staining |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | Immunofluorescence |
| Troutman tying forceps, 10cm, Curved G pattern, 0.52mm tip with tying platform | WPI | WP505210 | For microsurgical procedures |
| Vessel clips 10G Pressure 5x 0.8mm Jaws, 5/pkg | WPI | 15911 | For microsurgical procedures |
| Visiopharm | Visiopharm | Visiopharm | NuMA Staining Quantification Software |
| Xylasine 100mg/mL | Akorn Pharma | 59399-111-50 | Anesthesia |
| Xylene | Fisher | X3P-1GAL | Histology |
References
- Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Adler, N. R., Haydon, A., McLean, C. A., Kelly, J. W., Mar, V. J. Metastatic pathways in patients with cutaneous melanoma. Pigment Cell Melanoma Research. 30 (1), 13-27 (2017).
- Platz, A., Egyhazi, S., Ringborg, U., Hansson, J. Human cutaneous melanoma; a review of NRAS and BRAF mutation frequencies in relation to histogenetic subclass and body site. Molecular Oncology. 1 (4), 395-405 (2008).
- Alonso, S. R., et al. A high-throughput study in melanoma identifies epithelial-mesenchymal transition as a major determinant of metastasis. Cancer Research. 67 (7), 3450-3460 (2007).
- Rowe, C. J., Khosrotehrani, K. Clinical and biological determinants of melanoma progression: Should all be considered for clinical management. Australasian Journal of Dermatology. 57 (3), 175-181 (2016).
- Plebanek, M. P., et al. Pre-metastatic cancer exosomes induce immune surveillance by patrolling monocytes at the metastatic niche. Nature Communications. 8 (1), 1319 (2017).
- Orgaz, J. L., et al. Loss of pigment epithelium-derived factor enables migration, invasion and metastatic spread of human melanoma. Oncogene. 28 (47), 4147-4161 (2009).
- Ladhani, O., Sanchez-Martinez, C., Orgaz, J. L., Jimenez, B., Volpert, O. V. Pigment epithelium-derived factor blocks tumor extravasation by suppressing amoeboid morphology and mesenchymal proteolysis. Neoplasia. 13 (7), 633-642 (2011).
- Ju, R. J., Stehbens, S. J., Haass, N. K. The role of melanoma cell-stroma interaction in cell motility, invasion, and metastasis. Frontiers in Medicine - Dermatology. 5, 307 (2018).
- Wiley, H. E., Gonzalez, E. B., Maki, W., Wu, M. T., Hwang, S. T. Expression of CC chemokine receptor-7 and regional lymph node metastasis of B16 murine melanoma. Journal of the National Cancer Institute. 93 (21), 1638-1643 (2001).
- Meier, F., et al. Metastatic pathways and time courses in the orderly progression of cutaneous melanoma. British Journal of Dermatology. 147 (1), 62-70 (2002).
- Turner, N., Ware, O., Bosenberg, M. Genetics of metastasis: melanoma and other cancers. Clinical & Experimental Metastasis. 35 (5-6), 379-391 (2018).
- Ubellacker, J. M., et al. Lymph protects metastasizing melanoma cells from ferroptosis. Nature. 585 (7823), 113-118 (2020).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Cunningham, C. C., et al. Actin-binding protein requirement for cortical stability and efficient locomotion. Science. 255 (5042), 325-327 (1992).
- Unger, C., et al. Modeling human carcinomas: physiologically relevant 3D models to improve anti-cancer drug development. Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 50-67 (2014).
- Fong, E. L., Harrington, D. A., Farach-Carson, M. C., Yu, H. Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling. Biomaterials. 108, 197-213 (2016).
- Nakamura, K., et al. Characterization of mouse melanoma cell lines by their mortal malignancy using an experimental metastatic model. Life Science. 70 (7), 791-798 (2002).
- Meeth, K., Wang, J. X., Micevic, G., Damsky, W., Bosenberg, M. W. The YUMM lines: a series of congenic mouse melanoma cell lines with defined genetic alterations. Pigment Cell Melanoma Research. 29 (5), 590-597 (2016).
- Koya, R. C., et al. BRAF inhibitor vemurafenib improves the antitumor activity of adoptive cell immunotherapy. Cancer Research. 72 (16), 3928-3937 (2012).
- Jenkins, M. H. Multiple murine BRaf(V600E) melanoma cell lines with sensitivity to PLX4032. Pigment Cell Melanoma Research. 27 (3), 495-501 (2014).
- Tuncer, E., et al. SMAD signaling promotes melanoma metastasis independently of phenotype switching. The Journal of Clinical Investigation. 129 (7), 2702-2716 (2019).
- Schwartz, H., et al. Incipient Melanoma Brain Metastases Instigate Astrogliosis and Neuroinflammation. Cancer Research. 76 (15), 4359-4371 (2016).
- Perez-Guijarro, E., et al. Multimodel preclinical platform predicts clinical response of melanoma to immunotherapy. Nature Medicine. 26 (5), 781-791 (2020).
- Krepler, C., et al. A Comprehensive Patient-Derived Xenograft Collection Representing the Heterogeneity of Melanoma. Cell Reports. 21 (7), 1953-1967 (2017).
- Agrawal, P., et al. A systems biology approach identifies FUT8 as a driver of melanoma metastasis. Cell. 31 (6), 804-819 (2017).
- Hanniford, D., et al. Epigenetic silencing of CDR1as drives IGF2BP3-mediated melanoma invasion and metastasis. Cancer Cell. 37 (1), 55-70 (2020).
- Kim, H., et al. PRMT5 control of cGAS/STING and NLRC5 pathways defines melanoma response to antitumor immunity. Science Translational Medicine. 12 (551), (2020).
- de Miera, E. V., Friedman, E. B., Greenwald, H. S., Perle, M. A., Osman, I. Development of five new melanoma low passage cell lines representing the clinical and genetic profile of their tumors of origin. Pigment Cell Melanoma Research. 25 (3), 395-397 (2012).
- Morsi, A., et al. Development and characterization of a clinically relevant mouse model of melanoma brain metastasis. Pigment Cell Melanoma Research. 26 (5), 743-745 (2013).
- Huynh, C., et al. Efficient in vivo microRNA targeting of liver metastasis. Oncogene. 30 (12), 1481-1488 (2011).
- Zou, C., et al. Experimental variables that affect human hepatocyte AAV transduction in liver chimeric mice. Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 18, 189-198 (2020).
- Kleffman, K., et al. Melanoma-secreted Amyloid Beta Suppresses Neuroinflammation and Promotes Brain Metastasis. bioRxiv. , 854885 (2019).
- Curtis, A., Calabro, K., Galarneau, J. R., Bigio, I. J., Krucker, T. Temporal variations of skin pigmentation in C57BL/6 mice affect optical bioluminescence quantitation. Molecular Imaging and Biology. 13 (6), 1114-1123 (2011).
- Sil, P., Wong, S. W., Martinez, J. More than skin deep: autophagy is vital for skin barrier function. Frontiers in Immunology. 9, 1376 (2018).
- Chen, S., et al. Genome-wide CRISPR screen in a mouse model of tumor growth and metastasis. Cell. 160 (6), 1246-1260 (2015).
- Hart, T., et al. High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities. Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).
- Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
- Edgar, R., Domrachev, M., Lash, A. E. Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository. Nucleic Acids Research. 30 (1), 207-210 (2002).
- Lappalainen, I., et al. The European Genome-phenome Archive of human data consented for biomedical research. Nature Genetics. 47 (7), 692-695 (2015).
- Cerami, E., et al. The cBio cancer genomics portal: an open platform for exploring multidimensional cancer genomics data. Cancer Discovery. 2 (5), 401-404 (2012).
- Grossman, R. L., et al. Toward a shared vision for cancer genomic data. New England Journal of Medicine. 375 (12), 1109-1112 (2016).
