Eine robuste Entdeckungsplattform zur Identifizierung neuartiger Mediatoren der Melanommetastasierung

Summary

Dieser Artikel beschreibt einen Workflow von Techniken, die zum Testen neuartiger Kandidatenmediatoren von Melanommetastasen und deren Wirkmechanismus eingesetzt werden.

Abstract

Metastasierung ist ein komplexer Prozess, bei dem Zellen Barrieren überwinden müssen, die nur unvollständig durch In-vitro-Assays modelliert werden. Ein systematischer Workflow wurde unter Verwendung robuster, reproduzierbarer In-vivo-Modelle und standardisierter Methoden etabliert, um neue Akteure in der Melanommetastasierung zu identifizieren. Dieser Ansatz ermöglicht Datenrückschlüsse in bestimmten experimentellen Stadien, um die Rolle eines Gens bei Metastasen genau zu charakterisieren. Modelle werden erstellt, indem genetisch veränderte Melanomzellen über intrakardiale, intradermale oder subkutane Injektionen in Mäuse eingeführt werden, gefolgt von einer Überwachung mit serieller In-vivo-Bildgebung . Sobald vordefinierte Endpunkte erreicht sind, werden Primärtumoren und/oder metastasentragende Organe entnommen und für verschiedene Analysen verarbeitet. Tumorzellen können sortiert und einer von mehreren "Omics"-Plattformen unterzogen werden, einschließlich der Einzelzell-RNA-Sequenzierung. Organe werden bildgebenden und immunhistopathologischen Analysen unterzogen, um die Gesamtbelastung durch Metastasen zu quantifizieren und ihren spezifischen anatomischen Standort abzubilden. Diese optimierte Pipeline, einschließlich standardisierter Protokolle für Transplantation, Überwachung, Gewebeernte, -verarbeitung und -analyse, kann für patientenabgeleitete, kurzfristige Kulturen und etablierte menschliche und murine Zelllinien verschiedener solider Krebsarten übernommen werden.

Introduction

Die hohe Mortalität im Zusammenhang mit metastasierendem Melanom in Kombination mit einer zunehmenden Inzidenz von Melanomen weltweit 1 (geschätzter Anstieg von 7,86% bis²⁰²⁵⁾ erfordert neue Behandlungsansätze. Fortschritte in der Zielentdeckung hängen von reproduzierbaren Metastasenmodellen ab, einem hochkomplexen Prozess. Während der Schritte der metastasierenden Kaskade müssen Melanomzellen unzählige Barrieren überwinden, um eine Umgehung des Immunsystems und die Besiedlung entfernter Gewebe zu erreichen². Die Widerstandsfähigkeit und Anpassungsfähigkeit von Melanomzellen ergibt sich aus einer Vielzahl von Faktoren, darunter ihre hohe genetische Mutationslast 3 und ihr Neuralkammursprung, die eine entscheidende phänotypische Plastizität^{verleihen 3,4,5}. Bei jedem Schritt ermöglichen Transkriptionsprogramme es metastasierenden Melanomzellen, von einem Zustand in einen anderen zu wechseln, basierend auf Hinweisen aus dem Übersprechen mit der Mikroumgebung, bestehend aus dem Immunsystem⁶, dem extrazellulären Milieu^7,8 und der zellulären Architektur der physischen Barrieren^9, mit denen sie in Kontakt kommen. Zum Beispiel entziehen sich Melanomzellen der Immunüberwachung, indem sie die Expression wichtiger immunprimierender tumorsezernierter Faktoren herunterregulieren⁶.

Studien beschreiben eine "prämetastasierende Nische", in der Melanomzellen Chemokine und Zytokine absondern, um das entfernte "Zielorgan" für Metastasen¹⁰ vorzubereiten. Diese Ergebnisse werfen wichtige Fragen über den Organtropismus metastasierender Melanomzellen und den anatomischen Weg auf, den sie nehmen, um auf entferntes Gewebe zuzugreifen. Nach der Intravasation ist bekannt, dass Melanomzellen durch Lymphatika (lymphatische Ausbreitung) und Blutgefäße (hämatogene Ausbreitung) metastasieren2,11. Während die meisten Patienten eine lokalisierte Erkrankung aufweisen, weist eine kleine Untergruppe von Fällen eine ferne metastasierende Erkrankung und keine lymphatische Verbreitung (negative Lymphknotenbeteiligung^{) auf11,} was auf die Existenz alternativer metastasierender Wege für Melanome hindeutet.

Wenn sie eine metastasierende Stelle besiedeln, durchlaufen Melanomzellen epigenetische und metabolische Anpassungen^12,13. Um auf neue Kompartimente zuzugreifen und in sie einzudringen, verwenden Melanomzellen Proteasen 14 und zytoskelettale Modifikationen ^11,15, die es ihnen ermöglichen, zu ihrem neuen Standort zu gelangen und dort zu wachsen. Die Schwierigkeit bei der Bekämpfung von Melanomzellen liegt in der Komplexität und Anzahl solcher Anpassungen; Daher sollte sich das Feld bemühen, so viele Schritte und Anpassungen wie möglich experimentell nachzubilden. Trotz zahlreicher Fortschritte in in vitro Assays wie Organoiden und 3D-Kulturen^16,17 rekapitulieren diese Modelle die in vivo metastatische Kaskade nur unvollständig.

Murine-Modelle haben sich als wertvoll erwiesen, indem sie ein Gleichgewicht zwischen Reproduzierbarkeit, technischer Machbarkeit und Simulation menschlicher Krankheiten gefunden haben. Intravaskuläre, orthotopisch und heterotopisch implantierte Melanomzellen aus patientenabgeleiteten Xenotransplantaten oder Kurzzeitkulturen in immungeschwächte oder humanisierte Mäuse stellen das Rückgrat der Zielentdeckung bei metastasierendem Melanom dar. Diesen Systemen fehlt jedoch oft eine entscheidende biologische Einschränkung der Metastasierung: das Immunsystem. Syngene Melanommetastasenmodelle, die diese Einschränkung besitzen, sind auf dem Gebiet relativ selten. Diese Systeme, die in immunkompetenten Mäusen entwickelt wurden, einschließlich B16-F10¹⁸, der YUMM-Familie der Zelllinien¹⁹, SM1 20, D4M3 21, RIM3 22 oder neuer, der RMS 23 und M1 (Mel114433), M3 (HCmel1274), M4 (B2905) ²⁴ Melanom-Zelllinien, erleichtern die Untersuchung der komplexen Rolle der Immunantwort des Wirts bei der Melanomprogression.

Hier wird eine Pipeline zur Identifizierung von Melanommetastasenzielen vorgestellt. Mit zunehmenden und größeren "Omics" -Datensätzen, die aus Melanom-Patientenkohorten generiert werden, postulieren wir, dass Studien, die das klinischste Versprechen haben, diejenigen sind, die aus der Big-Data-Integration stammen, was zu einer akribischen funktionellen und mechanistischen Befragung führt^25,26,27,28. Durch die Verwendung von Mausmodellen zur Untersuchung potenzieller Ziele im metastatischen Prozess können in vivo-spezifische Ereignisse und Gewebeinteraktionen berücksichtigt werden, wodurch die Wahrscheinlichkeit einer klinischen Translation erhöht wird. Mehrere Methoden zur Quantifizierung der metastatischen Belastung werden skizziert und liefern ergänzende Daten zu den Ergebnissen eines bestimmten Experiments. Ein Protokoll für die Einzelzellisolierung von Tumoren in verschiedenen Organen wird beschrieben, um die unvoreingenommene Charakterisierung der Genexpression in metastasierenden Zellen zu unterstützen, die der Einzelzell- oder Massen-RNA-Sequenzierung vorausgehen kann.

Protocol

HINWEIS: Die Tierverfahren, die mit dem folgenden Protokoll verbunden sind, wurden vom New York University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt. Alle Verfahren werden in Einrichtungen durchgeführt, die von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC) zugelassen sind. Abbildung 1 zeigt den allgemeinen experimentellen Ansatz.

1. Von Patienten abgeleitete Melanom-Kurzzeitkulturen (STCs)

1. Geben Sie das Gewebe in eine 60 mm große Petrischale mit 1 ml vollständigem RPMI (RPMI 1640 ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 1x MEM nicht-essentieller Aminosäurelösung und Penicillin (100 IE / ml ) / Streptomycin (100 μg / ml)).
   HINWEIS: Um das Verhältnis der Tumorzellen zu erhöhen, analysieren und entfernen Sie bei Bedarf das den Tumor umgebende Gewebe in der Petrischale unter einem Mikroskop mit sterilen chirurgischen Instrumenten.
2. Schneiden Sie das frische Gewebe mit sterilisierten Rasierklingen fein in 1-2 mm große Würfel. Fügen Sie 4 ml vollständige RPMI hinzu und pipettieren Sie den Inhalt der Platte 5-10 Mal mit einer serologischen Pipette von 10 ml auf und ab.
3. Übertragen Sie die Zellsuspension auf ein 15 ml Polypropylen-Konionsröhrchen und drehen Sie die Zellen nach unten (180 × g für 5 min bei 4 ° C). Saugen Sie den Überstand ab, suspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml frischem Medium und übertragen Sie die Suspension in einen 25 cm² großen Gewebekulturkolben.
4. Um den Gewebefragmenten zu helfen, sich am Boden festzusetzen, stellen Sie den Kolben in einem Gewebekultur-Inkubator in einem Gewebekultur-Inkubator in einem Winkel von 20 ° -30 ° C auf 5% CO₂ für 20 min gekippt.
5. Legen Sie den Kolben flach ab, damit das Medium das Gewebe bedecken kann, und überprüfen Sie täglich den Status der Kultur. Teilen Sie die Zellen auf, wenn sie eine 90-100% ige Konfluenz erreichen. Halten Sie kurzfristige Kulturen bei einer "niedrigen" Durchgangszahl aufrecht.
   HINWEIS: STCs werden etwa 2 Monate nach der Zellisolierung und -kultur eingerichtet, obwohl der tatsächliche Zeitplan zwischen Proben und Tumorarten variiert. Nach 10 bis 14 Passagen erreichen die Zelllinien eine Reinheit von 100% und enthalten nur Melanomzellen²⁹. Die Passage Number Threshold wird empirisch bestimmt, indem Veränderungen in der Zellmorphologie, der Verdopplungszeit und des Verhaltens in vivo beobachtet werden. Um die Heterogenität und andere Merkmale des Elterntumors zu erhalten, teilen Sie die Zellen nicht mehr als 1:5 auf.
6. Nach der Etablierung eines STC und mit einem Zelllinienmodell, das in die Tiere injiziert werden soll, wie in den folgenden Schritten beschrieben, transduzieren Sie Zellen mit einem Reporter.
   HINWEIS: Ein fluoreszierendes Tag (z. B. rotfluoreszierendes Protein (RFP), grün fluoreszierendes Protein (GFP)) ermöglicht beispielsweise die Ex-vivo-Immunfluoreszenzbildgebung und die Sortierung von Tumorzellen durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS). Luciferase ermöglicht in vivo Biolumineszenz-Bildgebung, ein nützliches Werkzeug zur Überwachung der experimentellen Progression (Abschnitt 4).

Abbildung 1: Schematische Darstellung des beschriebenen Workflows, von der Patientendatenintegration bis zur Generierung und Analyse von In-vivo-Daten von Mäusen. Abkürzungen: LOF = Funktionsverlust; GOF = Funktionsgewinn. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

2. Xenograft-Implantation

HINWEIS: Die hier beschriebenen experimentellen Verfahren werden an Mäusen durchgeführt, die ein geschwächtes adaptives und angeborenes Immunsystem haben, NOD.Cg-Prkdc^{scidIl2rg tm1Wjl}/SzJ (NSG) Mäuse; oder bei Mäusen, denen nur eine adaptive Immunität fehlt, wie die T-Zell-defizienten athymischen/nackten (NU/J) Mäuse. Tiere sind männlichen Geschlechts, 8 bis 10 Wochen alt. Frauen zeigen oft eine hohe Inzidenz von Gonadenmetastasen bei intrakardialer Injektion von Tumorzellen, was ihr Überleben reduziert.

1. Für subkutane und intradermale Injektionen ist eine 1:1-Zellsuspension herzustellen, indem ein Teil der in 1x Dulbeccos Phosphate-Buffered Saline (DPBS) suspendierten Zellen mit einem Teil aufgetautem extrazellulärem Matrixsubstrat (EMS) gemischt und bei 4 °C auf Eis gehalten wird. Für intravaskuläre (intrakardiale, intrakarotide, retro-orbitale, Schwanzvenen- oder splenische) Injektionen suspendieren Sie die Zellen nur in DPBS.
   HINWEIS: Das geeignete Volumen für intradermale Injektionen sollte so gering wie möglich gehalten werden (30 μL). Bei subkutanen Injektionen kann das injizierte Volumen bis zu 150 μL und bei intravaskulären Injektionen bis zu 250 μL (basierend auf dem Gewicht des Tieres) betragen. Fügen Sie der endgültigen Zellsuspension 10-30% zusätzliches Injektionsvolumen hinzu, basierend auf der injizierten Menge und der verwendeten Spritze, um das tote Volumen in der Schlupfspitze und das der Nadel zu berücksichtigen (z. B. eine 1 ml Tuberkulinspritze mit einer 30 G, 25mm Nadel hat ein totes Volumen von 100 μL).
2. Führen Sie ein Pilotprojekt durch, um das Verhalten der verwendeten Zelllinien und den Zeitplan der Tumorprogression in vivo zu charakterisieren. Für intradermale Injektionen beginnen Sie mit der Injektion von 1.000 bis zu 50.000 Zellen / 30 μL. Beginnen Sie bei subkutanen Injektionen mit der Injektion von 10.000 bis zu 2 × 10⁶ Zellen/150 μL. Für intravaskuläre (intrakardiale, intrakarotide, retro-orbitale und splenische) Injektionen beginnen Sie mit der Injektion von 50.000 Zellen / 150 μL.
   HINWEIS: Intravaskuläre Injektionen prädisponieren die Tiere für embolische Ereignisse, entweder durch Einbringen von Luft in das Kreislaufsystem oder durch Verwendung einer übermäßigen Anzahl von Zellen, die die kleinen Gefäße verschließen. Mischen Sie die Zellsuspension gut, um ein Verklumpen zu vermeiden. Grundieren Sie die Spritze, bevor Sie die Zellsuspension laden. Entfernen Sie alle Luftblasen in der Spritze. Bewahren Sie die Zellsuspension/Spritzen bis zum Laden und zum Zeitpunkt der Injektion auf Eis auf.
3. Verabreichen Sie die Anästhesie durch Inhalation. Stellen Sie den Sauerstoffmessregler zwischen 1-2 l / min ein. Legen Sie das Tier in die Induktionskammer, wobei der Isofluran-Verdampfer auf 2,5-5% für die Induktion und 1,5-3% für die Wartung eingestellt ist.
   HINWEIS: Überwachen Sie die Atmung und Herzfrequenz des Tieres während der Anästhesie-Induktionsphase. Lassen Sie das Tier nicht unbeaufsichtigt. Überwachen Sie nicht mehr als ein Tier gleichzeitig. Titern Sie die Menge der Anästhesie auf das Gewicht des Tieres.
4. Bewegen Sie das Tier aus der Induktionskammer in den Nasenzapfen. Tragen Sie sterile petrolatum ophthalmologische Salbe auf die Augen des Tieres auf, um Hornhauttrockenheit während des Eingriffs zu verhindern.
5. Rasieren Sie die Verfahrensstelle mit einer geraden Rasierklinge, die in einem Winkel von 30 ° geneigt ist. Reinigen Sie die Haut des Verfahrensbereichs mit 70% Isopropylalkohol-Tupfern. Beurteilen Sie vor weiteren Schritten eine ausreichende Anästhesie durch Pedalreflex.
6. Bei intradermalen Injektionen führen Sie das gesamte Verfahren in einer Biosicherheitskabine durch, um aseptische Bedingungen aufrechtzuerhalten.
   1. Betäuben und rasieren Sie das Tier wie in den Schritten 2.3-2.5 beschrieben.
   2. Greifen und ziehen Sie die Haut rückwärts gegen die Flugbahn des Nadelstichs zurück. Mit einer 31 G Insulinspritzennadel, 6 mm lang, in einem spitzen Winkel gehalten, punktieren Sie die Haut sanft mit der Fase nach oben.
   3. Spüren Sie die Druckentlastung an der Spitze der Nadel. Gehen Sie vorsichtig vor, um im intradermalen Kompartiment zu bleiben und nicht durch die gesamte Hauttiefe in die Unterhaut zu gelangen. Entscheidend: Wenn man in den subkutanen Raum schlüpft, entfernen Sie die Nadel, wechseln Sie den Injektionsbereich und setzen Sie die Nadel wieder ein. Injizieren Sie das gesamte Volumen (30 μL) der Zellsuspension langsam, bis eine kuppelförmige Quaddel beobachtet wird.
      HINWEIS: Geringe Injektionsvolumina induzieren weniger Dissektion der Hautschichten und weniger architektonische Verzerrungen.
   4. Halten Sie die Nadel drin und zählen Sie bis 5.
      HINWEIS: EMS wird bei Körpertemperatur viskos und hilft, Rückfluss durch die Nadelstichwunde zu vermeiden.
   5. Entfernen Sie die Nadel und legen Sie das Tier in einem Käfig auf einem warmen Pad auf, um sich zu erholen. Bringen Sie das Tier in den Vivariumkäfig zurück, nachdem Sie das Bewusstsein wiedererlangt haben, wenn es sternal und gehfähig ist.
      HINWEIS: Überwachen Sie das Tier kontinuierlich während aller in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren. Lassen Sie das Tier nicht unbeaufsichtigt und überwachen Sie nicht mehr als ein Tier gleichzeitig.
   6. Überwachen Sie das Fortschreiten des Tumorwachstums, des Gewichtsverlusts und des allgemeinen Gesundheitszustands in Zusammenarbeit mit dem tierärztlichen Personal täglich in der Anfangswachstumsphase und bei Bedarf intensiver, nachdem die Tiere mit dem Abnehmen begonnen haben. Während dieser Überwachungssitzungen: Wiegen Sie die Tiere und zeichnen Sie ein Diagramm, um den Gewichtsverlust zu überwachen, und überprüfen Sie auf Anzeichen von Tumorgeschwüren, neurologischen, lokomotorischen und / oder Verhaltensmerkmalen (Lethargie, mangelnde Pflege, geringe Nahrungs- oder Wasseraufnahme).
      HINWEIS: Euthanasie die Tiere unmittelbar nach der Beobachtung von Anzeichen einer fortgeschrittenen Krankheit (mehr als 20% Gewichtsverlust, ein Körperzustandswert von <2, extrem reduzierte Aktivitätsniveaus, Lähmungen oder Krampfanfälle). Verwenden Sie die von der IACUC der Institution genehmigte Euthanasiemethode (z. B. wird eine automatisierte Tisch-CO 2-Kammer verwendet, um die Tiere 15 Minuten lang CO₂ auszusetzen, gefolgt von einer sekundären Euthanasiemethode, entweder zervikale Dislokation, Enthauptung oder Pneumothorax, der bilateral durch Einschneiden des_Brustkorbs induziert wird).
   7. Nehmen Sie Messungen mit Messschiebern vor und verwenden Sie die Länge (L) und die Breite (W) des Tumors, um das Volumen (V) mit der Formel zu berechnen:
      
7. Für subkutane Injektionen:
   1. Führen Sie das gesamte Verfahren in einer Biosicherheitskabine durch, um aseptische Bedingungen aufrechtzuerhalten^26,27.
   2. Betäuben und rasieren Sie das Tier wie in den Schritten 2.3-2.5 beschrieben.
   3. Mit einer 6 mm langen Insulinspritzennadel von 28 g bis 31 g, die in einem spitzen Winkel gehalten wird, stichen Sie sanft die Haut mit der Fase nach oben ein. Spüren Sie die Druckentlastung an der Spitze der Nadel zweimal , während Sie durch die Epidermis, Dermis und Hypodermis gehen.
      HINWEIS: Das zweite Mal, wenn eine Druckentlastung an der Spitze der Nadel gefühlt wird, zeigt an, dass das subkutane Kompartiment erreicht wurde.
   4. Injizieren Sie das gesamte Volumen (30-150 μL) der Zellsuspension langsam, bis eine längliche ellipsenförmige Quaddel beobachtet wird. Halten Sie die Nadel drin und zählen Sie bis 5. Zählen Sie bis 10 für größere Volumina (mehr als 50 μL).
      HINWEIS: EMS wird bei Körpertemperatur viskos und hilft, Rückfluss durch die Nadelstichwunde zu vermeiden.
   5. Entfernen Sie die Nadel und legen Sie das Tier in einem Käfig auf einem warmen Pad auf, um sich zu erholen. Bringen Sie das Tier in seinen Vivariumkäfig zurück, nachdem Sie das Bewusstsein wiedererlangt haben, wenn es sternal und gehfähig ist.
      HINWEIS: Achten Sie während der postprozeduralen Überwachung auf Anzeichen von Komplikationen (niedrige Atemfrequenz, Blutungen, langsame Genesung) und behandeln Sie sie angemessen. Wenn keine Besserung beobachtet wird, fahren Sie mit humanen Euthanasieverfahren fort, die in der ANMERKUNG zu Schritt 2.6.6 beschrieben sind.
   6. Überwachen Sie das Tier auf Tumorwachstum, Gewichtsverlust und allgemeinen Gesundheitszustand, wie in den Schritten 2.6.6-2.6.7 beschrieben.
8. Für intrakardiale Injektionen:
   1. Führen Sie das gesamte Verfahren in einer Biosicherheitskabine durch, um aseptische Bedingungen aufrechtzuerhalten^26,30.
   2. Betäuben Sie das Tier wie in den Schritten 2.3-2.4 beschrieben.
   3. Bringen Sie das Tier auf die beheizte Plattform des Ultraschallgeräts und befestigen Sie es mit hypoallergenem Klebeband am Nasenkonus.
   4. Rasieren Sie den Thorax mit einer geraden Rasierklinge, die in einem Winkel von 30 ° geneigt ist. Reinigen Sie die Haut des Verfahrensbereichs mit 3 Anwendungen von 10% Povidon-Jod im Wechsel mit 3 Anwendungen von Isopropylalkohol.
   5. Beurteilen Sie vor weiteren Schritten eine ausreichende Anästhesie durch Pedalreflex. Tragen Sie das Ultraschallgel auf die Verfahrensstelle auf.
   6. Erfassen Sie das Herzfenster mit der Ultraschallsonde. Positionieren Sie die Ultraschallsonde in der Mitte des Thorax auf der linken Seite des Tieres, um ein horizontales Fenster zu erfassen, das auf eine Querschnittsansicht (kurze Achse) des linken Ventrikels ausgerichtet ist. Stellen Sie sicher, dass die Längsachse der Sonde nach oben zeigt, und fixieren Sie die Sonde in einem Winkel von 50 ° und die beheizte Plattform in einem Winkel von 20 °. Verriegeln Sie die Sonde und den Stützrahmen in Position.
   7. Ziehen Sie die Zellsuspension auf, während Sie in der Biosicherheitskabine in einer Tuberkulin-1-ml-Spritze mit einer 30 G, 25-mm-Nadel arbeiten. Entfernen Sie alle Luftblasen in der Spritze.
      HINWEIS: Es ist wichtig, eine Einzelzellsuspension zu erstellen und beizubehalten, während die Zellen verarbeitet und injiziert werden. Das Entfernen von Luftblasen ist ein wichtiger Schritt, um Luftembolien zu vermeiden. Ein gut grundiertes Spritzennadelsystem verhindert vermeidbare Todesfälle in der experimentellen Gruppe. Ziehen Sie immer mehr Volumen in die Spritze, als injiziert wird. Das zusätzliche Volumen hilft, die Luft zu entfernen, indem ein Teil der Zellsuspension wieder in eine 1,5-ml-Röhre injiziert wird.
   8. Verriegeln Sie die Spritze im stereotaktischen Injektor. Führen Sie die Nadel unter Ultraschallführung durch die Brustwand in den linken Ventrikel des Herzens. Injizieren Sie das gesamte Volumen (100-250 μL) der Zellsuspension langsam.
   9. Entfernen Sie die Nadel und legen Sie das Tier in einem Käfig auf einem warmen Pad auf, um sich zu erholen. Bringen Sie das Tier in seinen Vivariumkäfig zurück, nachdem Sie das Bewusstsein wiedererlangt haben, wenn es sternal und gehfähig ist. Überwachen Sie das Tier auf Tumorwachstum, Gewichtsverlust und allgemeinen Gesundheitszustand, wie in Schritt 2.6.6 beschrieben.
9. Für intrakarotis-Injektionen:
   1. Führen Sie das gesamte Verfahren auf einer ordnungsgemäß desinfizierten Oberfläche durch, um die aseptischen Bedingungen aufrechtzuerhalten³⁰.
   2. Betäuben Sie das Tier mit einem Cocktail aus Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) durch intraperitoneale Injektion mit einer Insulinspritze, 28 G Nadel. Tragen Sie sterile petrolatum ophthalmologische Salbe auf die Augen des Tieres auf, um Hornhauttrockenheit während des Eingriffs zu verhindern.
   3. Rasieren Sie den Verfahrensbereich mit einer geraden Rasierklinge, die in einem Winkel von 30 ° geneigt ist. Beurteilen Sie vor weiteren Schritten eine ausreichende Anästhesie durch Pedalreflex.
   4. Legen Sie das Tier unter ein Stereomikroskop auf ein wärmendes Pad. Reinigen Sie die Haut des Verfahrensbereichs mit 3 Anwendungen von 10% Povidon-Jod im Wechsel mit 3 Anwendungen von Isopropylalkohol.
   5. Tragen Sie sterile persönliche Schutzausrüstung (PSA) und sterile Handschuhe. Bereiten Sie das sterile Feld vor, indem Sie einen sterilen Vorhang über den Körper des Tieres legen.
      HINWEIS: Wenn der sterile Vorhang kein Loch hat, das für die Größe und Lage des Einschnitts geeignet ist, falten Sie den Vorhang in zwei Hälften und schneiden Sie mit einer Metzenbaum-Schere das Loch in der Mitte des sterilen Vorhangs in die entsprechende Größe.
   6. Verwenden Sie ein Skalpell oder eine Irisschere, um die Haut vom halben Hals bis zum Brustbein zu schneiden. Mit zwei mikrochirurgischen Pinzetten die 2 submandibulären Speicheldrüsen in der Mittellinienebene stumpf auseinander schneiden. Verwenden Sie bei Bedarf eine elektrische Kauterisation für die Hämostase.
   7. Sezieren Sie die Faszie, die die gemeinsame Halsschlagader (CCA) vom Manubrium in Richtung der Bifurkation umgibt, und fahren Sie medial fort, um die hintere Wand der äußeren Halsschlagader zu befreien. Befestigen Sie die äußere Halsschlagader (ECA) vor der Injektion vorübergehend.
      HINWEIS: Bei der Sezierung um den Umfang des CCA muss darauf geachtet werden, dass der Vagusnerv (liegt seitlich zur Arterie) nicht beschädigt wird.
   8. Laden Sie die Zellsuspension in eine 1 ml Spritze mit einer 33 G, 15 mm Nadel.
   9. Führen Sie zwei 7-0-Ligaturen unter der CCA durch und führen Sie für jede der beiden Ligaturen einen losen Instrumentenknoten aus. Verwenden Sie einen 5 mm, 10 G Druckbehälterclip und klemmen Sie den ECA vorübergehend an. Binden Sie die proximale Ligatur; dann binden Sie die distale Ligatur locker (neben der Verzweigung der CCA). Verwenden Sie die distale Schleife später, um die Blutung nach der Injektion zu kontrollieren.
   10. Verwenden Sie die Spritze mit einer 33 G, 15 mm Nadel, punktieren Sie vorsichtig die CCA mit der Fase der Nadel nach oben und in einem spitzen Winkel. Injizieren Sie das gesamte Volumen (50-150 μL) der Zellsuspension langsam.
   11. Greifen Sie die distale Schlaufe mit der Pinzette und heben Sie sie an, während Sie die Nadel entfernen, um das Lumen der CCA zu verschließen und die Blutung zu stoppen. Tauschen Sie die Spritze gegen eine #7 Juweliere-Pinzette aus und binden Sie die distale Schlaufe fest.
   12. Werfen Sie einen weiteren Instrumentenknoten auf die distale Ligatur und entfernen Sie den Gefäßclip von der ECA. Kontrollieren Sie das Operationsfeld für Blutungen und kauterisieren Sie alle blutenden Gefäße vor dem Schließen. Verwenden Sie eine 9-mm-Heftvorrichtung, um die Haut des Tieres zu schließen, und legen Sie das Tier auf ein warmes Pad, um sich zu erholen.
       HINWEIS: Entfernen Sie die Klammern 7-10 Tage nach der Operation.
   13. Verabreichen Sie Analgetika subkutan - Buprenorphin (0,3 mg / ml) alle 12 h für 72 h nach der Operation in einer Konzentration von 0,1 mg / kg.
       HINWEIS: Alternativ können Sie ein Analgetikum mit verlängerter Freisetzung verwenden, das alle 72 Stunden 1 Dosis erfordert.
   14. Bringen Sie das Tier in seinen Vivariumkäfig zurück, nachdem Sie das Bewusstsein wiedererlangt haben, wenn es sternal und gehfähig ist. Überwachen Sie die Tiere täglich postoperativ auf Anzeichen einer Infektion oder Schmerzen an der Operationsstelle, einen allgemeinen Gesundheitszustand und Komplikationen.
       HINWEIS: Tiere, die sich von einer Überlebensoperation nicht gut erholen, können zusätzliche Dosen von Schmerzmitteln erhalten und werden human eingeschläfert, wenn sie sich nicht bis 72 Stunden nach der Operation vollständig erholen.
   15. Überwachen Sie das Tier auf Tumorwachstum, Gewichtsverlust und allgemeinen Gesundheitszustand, wie in Schritt 2.6.6 beschrieben.
10. Für retroorbitale Injektionen:
    HINWEIS: Verwenden Sie diese Technik als Alternative zu Heckveneninjektionen, wenn der Bediener in dieser Technik geschult und kompetent ist und wenn es eine starke wissenschaftliche Begründung gibt. Zellsuspensionen, die über diesen Weg abgegeben werden, können Tumorwachstum im retroorbitalen Raum induzieren; Daher sollten bei der Wahl dieser Technik die Risiken und Vorteile sorgfältig berücksichtigt werden. Um beispielsweise die direkte zirkulatorische Verbindung des retroorbitalen Veneninus mit den intrazerebralen Venenvenen über Anastomosen zu nutzen, wählen Sie diese Methode, wenn die Hirntumorbildung auf anderen Injektionswegen fehlgeschlagen ist.
    1. Führen Sie das gesamte Verfahren in einer Biosicherheitskabine durch, um aseptische Bedingungen aufrechtzuerhalten. Ziehen Sie sterile PSA und Handschuhe an.
    2. Betäuben Sie das Tier wie in den Schritten 2.3-2.4 beschrieben.
       HINWEIS: Tragen Sie bei diesem Verfahren keine sterile petrolatum-Augensalbe auf die Augen des Tieres auf, da dies die Injektion behindert. Tragen Sie nur Lokalanästhesietropfen auf.
    3. Laden Sie die Zellsuspension in eine Insulinspritze mit einer 28-31 G, 6 mm Nadel.
    4. Wenn sich das Tier in Bauchlage befindet, ziehen Sie die Augenlider zurück, bis das Auge hervorsteht. Tragen Sie 1 Tropfen Lokalanästhetikum auf die Seite auf, die dem Eingriff unterzogen wird.
    5. Führen Sie die Nadel in einem Winkel von 30-45° zwischen dem Auge und dem medialen Epicanthus mit der Fase nach unten ein. Injizieren Sie die Zellsuspension (10-150 μL) langsam.
       HINWEIS: Langsamere Bewegungen verhindern eine Schädigung des Auges und den Rückfluss der Injektion.
    6. Führen Sie die in 2.7.5-2.7.6 beschriebenen Schritte aus.
11. Für Milzinjektionen:
    1. Führen Sie das gesamte Verfahren in einer Biosicherheitskabine durch, um aseptische Bedingungen^{aufrechtzuerhalten 31}. Ziehen Sie sterile PSA und sterile Handschuhe an.
    2. Betäuben und rasieren Sie das Tier wie in den Schritten 2.3-2.5 beschrieben.
    3. Bringen Sie das Tier in eine rechte seitliche Liegeposition. Reinigen Sie die Haut des Verfahrensbereichs mit 3 Anwendungen von 10% Povidon-Jod im Wechsel mit 3 Anwendungen von Isopropylalkohol und bereiten Sie das Operationsfeld wie in Schritt 2.9.5 beschrieben vor.
    4. Machen Sie mit einer Metzenbaum-Schere oder einem Skalpell einen 1 cm großen Schnitt in der linken Flanke der Bauchdecke, gefolgt von einem Schnitt in das Peritoneum.
       HINWEIS: Die Milz wird nach dem Hautschnitt durch die durchscheinende Bauchdecke gesehen. Führen Sie den Peritonealschnitt genau an dieser Stelle durch.
    5. Legen Sie die Milz und das Milzhilum durch den Schnitt frei. Mit einer 28-31 G Insulinspritzennadel, 6 mm lang, punktieren Sie vorsichtig die Milz mit der Fase der Nadel nach oben und in einem spitzen Winkel.
       HINWEIS: Wenn die Stichwunde blutet, kauterisieren Sie die Stelle, um Blutungen und Rückfluss zu begrenzen.
    6. Injizieren Sie das gesamte Volumen (50-100 μL) der Zellsuspension langsam. Entfernen Sie die Nadel. Legen Sie eine kleine Gaze auf die Milz und üben Sie Druck mit einer Pinzette aus. Klemmen Sie die Milz mit einer feinen Moskitozange leicht zwischen die Gaze und warten Sie 15 min.
    7. Führen Sie eine Splenektomie durch, indem Sie das Milzhilum mit einer 3-0- oder 4-0-Seidennaht binden und die Gefäße bei Bedarf kauterisieren. Schließen Sie das Peritoneum mit einer 5-0 Polydioxanon (PDS) oder Polyglykolsäure resorbierbaren Naht.
    8. Führen Sie die in den Schritten 2.7.5-2.7.6 beschriebenen Schritte aus.
       HINWEIS: Tiere, die Blutungskomplikationen aufweisen oder sich 72 Stunden nach der Operation nicht vollständig erholt haben, sollten human eingeschläfert werden. Denken Sie daran, dass das Wohlbefinden der Mäuse zu jeder Zeit Priorität hat.

3. Inszenierte Überlebenschirurgie (SSS)

1. Basierend auf den experimentellen Schlussfolgerungen aus Schritt 2.2 bestimmen Sie den richtigen Zeitpunkt bis zur Überlebensoperation. Wählen Sie je nach Zelllinie und experimenteller Hypothese einen früheren Zeitpunkt für die Tumorresektion (bei einem Tumorvolumen = 150 mm 3) oder einen späteren Zeitpunkt (bei einem Tumorvolumen = 500 mm³)²⁶.
   HINWEIS: Die Tumorvolumengrenze beträgt 1.500 mm 3, wenn die Tumorlast hoch genug ist^, um das Wohlbefinden des Tieres zu beeinträchtigen und für Komplikationen prädisponiert.
2. Betäuben und rasieren Sie das Tier wie in den Schritten 2.3-2.5 beschrieben.
   HINWEIS: Das gesamte Verfahren wird in einer Biosicherheitskabine durchgeführt.
3. Reinigen Sie die Haut des Verfahrensbereichs mit 3 Anwendungen von 10% Povidon-Jod im Wechsel mit 3 Anwendungen von Isopropylalkohol und bereiten Sie das Operationsfeld wie in Schritt 2.9.5 beschrieben vor.
4. Verwenden Sie eine Iris-Schere oder ein Skalpell, schneiden Sie die Haut ein und halten Sie einen 5-7 mm Resektionsrand vom Rand des Tumors aufrecht.
   HINWEIS: Der Spielraum für die Resektion hängt von der Fähigkeit des Tumors ab, sich lokal auszubreiten. Erhöhen Sie bei aggressiven Tumoren den Resektionsrand, während Sie sicherstellen, dass genügend Haut übrig bleibt, um den Wundverschluss durchzuführen.
5. Bei intradermalen Tumoren resektieren Sie den Tumor zusammen mit der umlaufenden Haut.
6. Bei subkutanen Tumoren sezieren und entfernen Sie den Tumor unter der Haut.
   HINWEIS: Wenn der Tumor in das Peritoneum und / oder die Haut eindringt, resezieren Sie ihn en bloc mit dem Tumor und schließen Sie das Peritoneum mit 5-0/4-0 PDS oder Polyglykolsäure resorbierbaren Nähten.
7. Schließen Sie die Wunde mit der 9 mm Heftvorrichtung.
   HINWEIS: Entfernen Sie die Klammern 7-10 Tage nach der Operation. Verabreichen Sie analgetische Medikamente und legen Sie das Tier auf ein warmes Pad, um sich zu erholen. Setzen Sie die Verabreichung von analgetischen Medikamenten für 72 Stunden nach der Operation fort, einmal alle 12 Stunden gemäß Schritt 2.9.13. Tiere mit Blutungskomplikationen oder die nach der Operation nicht wieder das volle Bewusstsein erlangt haben, sollten human eingeschläfert werden.
8. Legen Sie das Tier in einem Käfig auf, auf einem warmen Pad, um sich zu erholen. Bringen Sie das Tier in den Vivariumkäfig zurück, nachdem Sie das Bewusstsein wiedererlangt haben, wenn es sternal und gehfähig ist.
9. Überwachen Sie das Tier nach der Operation weiterhin auf lokale Rezidive, Gewichtsverlust, neurologische, lokomotorische und / oder Verhaltensmerkmale (Lethargie, mangelnde Pflege, geringe Nahrungs- oder Wasseraufnahme) und den allgemeinen Gesundheitszustand.

4. In-vivo-Bildgebung (Abbildung 2A)

1. Verabreichen Sie den Tieren D-Luciferin-Substrat (150 mg/kg) durch intraperitoneale Injektion mit einer 1 ml Insulinspritze, 28 G Nadel.
   HINWEIS: Tumorzellen müssen stabil mit der Luciferase-cDNA transduziert werden.
2. Induzieren Sie die Anästhesie wie in den Schritten 2.3-2.4, 6 Minuten nach der D-Luciferin-Substratinjektion beschrieben.
3. Führen Sie die Bildgebung mit einem Biolumineszenz-Bildgebungsscanner (BLI) (In-vivo-Bildgebungssystem )²⁶ durch.
4. Bewegen Sie das Tier in die Bildgebungskammer und in den Nasenkegel. Fotografieren Sie bis zu 5 Tiere gleichzeitig, abhängig von der Kapazität des Bildgebungssystems.
5. Starten Sie das Instrument, indem Sie auf Initialisieren klicken. Stellen Sie die Einstellung der Belichtungszeit auf auto (1-120 s) ein.
6. Nehmen Sie ein leeres Bild auf, um bei Bedarf einen beliebigen Hintergrund zu subtrahieren. Klicken Sie auf Erfassen und speichern Sie das Bild, nachdem die Aufnahmesequenz abgeschlossen ist.
7. Legen Sie das Tier zurück in einen Käfig, der mit 50% der Grundfläche über einem Wärmekissen sitzt, um sich von der Anästhesie zu erholen. Bringen Sie das Tier in den Vivariumkäfig zurück, nachdem Sie das Bewusstsein wiedererlangt haben, wenn es sternal und gehfähig ist.
8. Für die Datenanalyse in derselben In-vivo-Bildgebungssoftware , mit der die Bilder aufgenommen wurden, navigieren Sie zu dem Ordner, in dem die Bilder gespeichert sind, und öffnen Sie die Bilder aller Mäuse, die zum Experiment gehören, auf einmal.
   HINWEIS: Die Analyse eines Bildes nach dem anderen ermöglicht keine gruppenübergreifende Normalisierung.
9. Stellen Sie die Einheiten auf Ausstrahlung ein (zählt nicht). Stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen für die Einzelperson deaktiviert ist, da dies eine gruppenübergreifende Normalisierung des Signals verhindert.
10. Zeichnen Sie mit dem Zeichenwerkzeug Region of Interest (ROI) kreisförmige ROIs für die Hirnregion und rechteckige ROIs für den Körper. Achten Sie darauf, die Ohren und die Nase vom ROI des Gehirns auszuschließen, da sie dazu neigen, unspezifische Lumineszenz auszusenden. Um die Verzerrung in diesem Prozess zu minimieren, zeichnen Sie ROIs nur auf den Fotos der Mäuse, ohne dass das lumineszierende Signal überlagert ist.
11. Wählen Sie ROIs messen aus, um das Signal zu quantifizieren und die Daten in eine Tabelle zu exportieren. Analysieren Sie Unterschiede zwischen Gruppen, indem Sie den Gesamtlumineszenzfluss (p / sec / cm² / sr) in Körperregionen von Interesse aufzeichnen.
    HINWEIS: Um Unterschiede zwischen Gruppen im Gehirntropismus speziell zu beurteilen, berechnen Sie das Verhältnis zwischen dem Gehirnsignal und dem Körpersignal für jede Maus. Dies kontrolliert die Intermausvariation der Gesamttumorlast und die Unterschiede in der Luciferase-Expression zwischen experimentellen Gruppen.

5. Ex-vivo-Magnetresonanztomographie

1. Führen Sie eine Ex-vivo-MRT unmittelbar nach der Euthanasie durch. Alternativ können Sie die Organe von Interesse entnehmen, sie bis zu 72 h in Formalin fixieren und die Bildgebung zu einem späteren Zeitpunkt durchführen.
2. Erfassen Sie die Bilder mit einem 7-Tesla (7-T) (300-MHz) Mikro-MRT-System, das mit einer NMR-Konsole und einem Zero-Boil-off-Magneten mit horizontaler Bohrung oder ähnlichen Geräten ausgestattet ist.
   HINWEIS: Die Notwendigkeit eines aktiv abgeschirmten Gradientenspuleneinsatzes mit dem richtigen Leistungskompromiss ist von entscheidender Bedeutung. Sie muss eine Gradientenlinearität von mindestens 50 mm dynamischem sphärischem Volumen (DSV) aufweisen, um die untersuchten Proben gleichzeitig ohne geometrische Verzerrung abzudecken. Die Kombination aus Gradientenfestigkeit (von 440 bis 750 mT/m) und Tastverhältnis, die maximale gleichzeitige Gleichströme von 3 x 30 A bis 3 x 87 A ermöglicht, ermöglicht eine angemessene Bildgebungsleistung. Der verwendete Gradientenspuleneinsatz (siehe Materialtabelle) ermöglicht folgende Leistung: 660 mT/m, 130 μs Anstiegszeit, 3 x 87 A und ein DSV = 80 mm.
3. Führen Sie die Scans mit einer kommerziellen, kreisförmig polarisierten Radiofrequenzspule für den gesamten Mauskörper (OD = 59 mm, ID = 38 mm, L = 40 mm) durch, die auf 300,16 MHz, die ¹H Protonen-Larmor-Frequenz, abgestimmt ist.
   HINWEIS: Diese HF-Sonde ermöglicht die Erfassung von 3D-Datensätzen mit submillimetermetrischer isotroper Auflösung (<150 μm) während nächtlicher Scans von 8-12 h.
4. Erkennen Sie die Tumorlast anhand mehrerer Sequenzen³⁰.
   HINWEIS: Hyperintensives Signal, das von einer_{T2-gewichteten}, schnellen Bildgebung mit refokussierten Echos (RARE) Sequenz erkannt wird, erkennt Ödeme, die Tumore umgeben.
5. Führen Sie die 3D-RARE-Sequenz mit den folgenden Erfassungsparametern durch: [120 μm]³ isotrope Auflösung; Erfassungszeit 5 h, 27 min; Wiederholungszeit (TR) = 500 ms; Echoabstand (ES) = 12,7 min; Turbofaktor TFx = 12; effektive Echozeit (TE_eff) = 76,2 ms; Bandbreite (BW) = 75 kHz; Matrixgröße = 284³; Sichtfeld (FOV) = [4,0 mm]³; Anzahl der Durchschnittswerte (Nav) = 6.
6. Erkennen Sie Metastasen mit den folgenden Parametern.
   1. Für pigmentierte Metastasen mit Signalaufhellung verwenden Sie eine_{T1-gewichtete} 3D-Gradienten-Echosequenz mit folgenden Parametern: [120 μm]³ isotrope Auflösung; Erfassungszeit 2 h, 41 min; TR = 20 ms; Echozeit (TE) = 4,0 ms; Flip-Winkel (FA) = 18°; BW = 75 KHz; Matrixgröße = 2843; Sichtfeld = [34,0 mm]³; Nav = 6.
   2. Verwenden Sie für unpigmentierte und/oder hämorrhagische Metastasen ein hypointensives Signal, wenn Sie unter einer_T2*-gewichteten, multigradienten Echosequenz (MGE) (3D-MGE, [120 μm]3 isotrope Auflösung erfassen; Erfassungszeit ³ h, 35 min; TR = 40 ms; TE = 3,6 ms; ES = 3,2 ms; 4 Echos; FA = 20°; BW = 100 kHz; Matrixgröße = 284³; Sichtfeld = (34,0 mm)³; Nav = 4.
7. Verwenden Sie alle 3 Sequenzen, um die Tumorlast zu quantifizieren.
8. Querverweisen Sie die während der Analyse identifizierten Tumorbereiche mit histologischen Schnitten, um die Genauigkeit zu gewährleisten. Siehe Abschnitte 7 und 8

6. Gewebeverarbeitung für die Einzelzell- oder Bulk-RNA-Sequenzierung

1. Euthanasie das Tier mit einer Methode, die von der IAUC der Institution genehmigt wurde. Sehen Sie sich eines der Verfahren an, die im HINWEIS zu Schritt 2.6.6 beschrieben sind.
2. Sezieren Sie die interessierenden Organe und legen Sie sie in separate Vertiefungen einer Platte, die Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) auf Eis enthält. Arbeiten Sie schnell und halten Sie das Gewebe jederzeit auf Eis, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu maximieren.
   HINWEIS: Die folgenden Schritte sind spezifisch für die Gehirnverarbeitung. Passen Sie den Kollagenase-Typ an das spezifische Gewebe an, basierend auf Ihren Bedürfnissen.
3. Bereiten Sie eine 6-Well-Platte mit 3 ml HBSS in jedem Well vor.
4. Um die Dissektion zu visualisieren und weiter zu leiten, verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop und identifizieren Sie die markierten Bereiche.
5. Sezieren Sie die fluoreszierenden Bereiche und legen Sie die Gewebefragmente in die 6-Well-Platte (1 Fragment pro Well, wenn einzelne metastatische Herde analysiert werden sollen oder mehrere Fragmente aus einem Organ, wenn mehrere Metastasen im selben Organ analysiert werden sollen). Verwenden Sie sterile Rasierklingen, um das Gewebe so klein wie möglich in Fragmente zu zerkleinern (ohne mehr als 1-2 Minuten für diesen Schritt für jede Probe auszugeben).
   HINWEIS: Die Begrenzung der Verarbeitungszeit der Tumoren hilft, die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten.
6. Saugen Sie den Inhalt jedes Wells ab und übertragen Sie ihn in ein 15 ml konisches Rohr.
   HINWEIS: Schneiden Sie die Spitze einer 1.000 μL Pipettenspitze ab, um den Transfer größerer Fragmente zu erleichtern.
7. Fügen Sie 1 ml HBSS in das Bohrloch hinzu und stellen Sie sicher, dass die verbleibenden Gewebefragmente / Zellen in die 15-ml-Röhre übertragen werden, die ein Endvolumen von 4 ml enthält. 50 μL Kollagenase Typ I (40 mg/ml) und 12,5 μL DNase I (2.000 Einheiten/ml) zu jeder Tube.
8. Legen Sie die konischen Rohre für 45 min in ein auf 37 °C beheiztes Wasserbad. Alle 5 Minuten kurz die konischen Röhren umdrehen.
9. Ein 70 μm Sieb mit HBSS vorbenetzen. Verwenden Sie das verschlossene Ende eines sterilisierten Mikrozentrifugenröhrchens oder den Kunststoffteil eines Spritzenkolbens und mahlen Sie das Gewebehomogen durch ein 70 μm langes Sieb zu einem neuen 50 ml konischen Röhrchen.
   HINWEIS: Die Vorbenetzung der Siebe mit HBSS- oder FACS-Puffer erleichtert die Belastung.
10. Waschen Sie das Sieb mit 1 ml HBSS. Ein 40 μm Sieb mit HBSS vorbenetzen. Filtern Sie jede Probe erneut durch ein 40μm-Sieb in ein neues konisches 50-ml-Rohr. Geben Sie 1 ml FBS in das 40-μm-Sieb, um es zu waschen. Halten Sie die konischen Röhren die ganze Zeit auf Eis.
11. Füllen Sie das konische Rohr auf 50 ml mit eiskalten DPBs. Drehen Sie die Zellen herunter (180 × g für 10 min bei 4 °C). Verwerfen Sie den Überstand und achten Sie darauf, das Zellpellet nicht zu verlieren.
    HINWEIS: Für Gehirnproben resuspendieren Sie die Zellen in 2,5 ml 38% iger Dichte-Trennlösung (in HBSS verdünnen und bei Raumtemperatur (RT) lagern). Transfer auf 5 ml FACS-Röhren. Drehen Sie 20 Minuten bei 800 × g. Schneiden Sie die Spitze einer 1.000 μL Pipettenspitze ab und entfernen Sie die oberste Fettschicht. Lassen Sie kein Fett an den Wänden der Röhren. Wenn noch Fett übrig ist, drehen Sie sich erneut nach unten und wiederholen Sie den Vorgang. Dies ist ein kritischer Schritt. Entfernen Sie den Rest der flüssigen Phase (das Pellet ist durchscheinend und schwer zu visualisieren).
12. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml Lysepuffer der roten Blutkörperchen (RBC) und inkubieren Sie für 60 s bei RT. Quen Sie die Lyselösung durch Zugabe von 20 ml DPBS.
13. Drehen Sie die Zellen bei 180 × g für 10 min bei 4 °C herunter. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in 2 ml FACS-Puffer (5% FBS in DPBS).
14. Fahren Sie mit der Sortierung markierter Zellen und / oder der Bibliotheksvorbereitung für die Massen- oder Einzelzell-RNA-Sequenzierung fort.
    HINWEIS: Zellen können vor der RNA-Isolierung für Bulk-RNA-Seq bei -80 ° C gedreht, eingefroren und gelagert werden.

7. Durchblutung tierischen Gewebes und Vorbereitung für immunhistologische Analysen

1. Anästhesieren Sie das Tier mit einer Überdosis Ketamin (300 mg/kg) und Xylazin (30 mg/kg) Cocktail durch intraperitoneale Injektion mit einer Insulinspritze und einer 28 G Nadel.
2. Entblößen Sie das Herz durch grobe Dissektion und machen Sie einen Schnitt im rechten Vorhof. Halten Sie das Herz sanft an Ort und Stelle mit langen, gebogenen Pinzetten, die nach vorne gerichtet sind.
   HINWEIS: Formalin und Paraformaldehyd (PFA) sind Karzinogene. Lesen Sie das Sicherheitsdatenblatt (SDB), vermeiden Sie die Exposition gegenüber Dämpfen und tragen Sie die entsprechende PSA.
3. Injizieren Sie mit einer 10-ml-Spritze mit einer 22-G-, 22-mm-Nadel 10 ml DPBS, gefolgt von 10 ml 4% PFA in den linken Ventrikel.
4. Fahren Sie fort, die Organe zu entnehmen und sie in vorbeschriftete histologische Kassetten zu laden. Legen Sie die Kassetten in einen entsprechend großen Behälter, der genügend Fixiermittel (Formalin) aufnehmen kann, um das Gewebe zu bedecken.
   HINWEIS: Idealerweise sollte das fixierende Volumen das 5-10-fache des Volumens der Gewebe betragen.
5. Fixieren Sie die Organe in den histologischen Kassetten in 10% Formalin für 48-72 h. Entsorgen Sie das 10% Formalin und waschen Sie die Kassetten zweimal mit 1x DPBS.
6. Beginnen Sie den Dehydratisierungsprozess, indem Sie die Kassetten für 2 Stunden in 70% Ethanol tauchen. Tauchen Sie die Kassetten sukzessive in steigende Ethanolkonzentrationen ein: 80%, 95%, 100% für jeweils 1 h. Wechseln Sie die 100%ige Lösung zweimal nach 1,5 h. Tauchen Sie die Kassetten für 1,5 h in Xylol ein und führen Sie drei Änderungen der Lösung durch.
7. Betten Sie die Kassetten bei 58-60 °C in Paraffinwachs ein. Schneiden Sie die Paraffinblöcke auf. Fahren Sie mit der Hämatoxylin- und Eosin- (H & E) oder Immunhistochemie-Färbung fort.
8. Um Melanomzellen zu identifizieren, verwenden Sie einen dieser Marker oder ein Panel: S100, Melan-A, HMB-45, Tyrosinase, MITF. Wenn möglich, verwenden Sie die NuMA-Färbung (Nuclear Mitotic Apparatus Protein), da es sich um einen hochspezifischen menschlichen Zellmarker handelt.
   HINWEIS: Die NuMA-Färbung bietet eine scharfe Abgrenzung zwischen Wirtszellen (Maus) und transplantierten Zellen (Mensch), die bei der Bildverarbeitung und den nachfolgenden Tumorquantifizierungsstadien hilft.

Abbildung 2: Beispiele für BLI-, Hellfeld-, Ex-vivo-Fluoreszenz- und H&E-Färbebilder, die den mehrgleisigen Ansatz zur Analyse der Wirkungen von Kandidatengenen bei Melanommetastasen veranschaulichen. (A) BLI-, (B) BF-, (C) Ex-vivo-Fluoreszenz- und (D) H&E-Färbebilder. Die zur Veranschaulichung verwendeten Bilder entsprechen einem Experiment, bei dem 131/6-4L-Melanomzellen, die mit einer Non-Targeting-Kontroll-shRNA (shNTC) oder einer shRNA-Targeting-FUT8-Mäuse transduziert wurden, in immunodefiziente (NSG) Mäuse injiziert wurden. FUT8-Stummschaltung beeinträchtigte die metastatische Verbreitung von Melanomzellen. Maßstabsleisten und Farbbalken = p/sec/cm²/sr × 10⁶ (A), 100 mm (B, C), 100 μm (D). Abkürzungen: BLI = Biolumineszenzbildgebung; H&E = Hämatoxylin und Eosin; shRNA = Kurzhaarnadel-RNA; shNTC = non-targeting control shRNA; NSG = nicht-adipöser Diabetiker schwerer kombinierter Immunschwäche gamma; FUT8 = Fucosyltransferase 8; BF = Hellfeld. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

8. Färbung des nuklearen mitotischen Apparateproteins (NuMA) (Abbildung 3)

1. Verwenden Sie einen Anti-NuMA-Antikörper als hochgradig humanspezifischen mitotischen Spindelmarker zur Identifizierung und Quantifizierung der metastatischen Belastung in Gewebeschnitten. 8.1. Es wird eine hochspezifische und empfindliche Identifizierung von Melanomzellen erreicht.
2. Wenn die chromogene Immunhistochemie für NuMA an einem automatischen Immunfärbungsinstrument durchgeführt wird, führen Sie die folgenden Schritte wie^{beschrieben aus 32}:
3. Deparaffinisieren Sie die Abschnitte in Xylol und rehydrieren Sie sie in sequentiell abnehmenden Ethanolkonzentrationen. Halten Sie die Objektträger für 15 min in Xylol unter Wasser und übertragen Sie sie für weitere 15 Minuten auf 100% Ethanol.
   HINWEIS: Der Rest der Ethanol-Rehydratisierungsschritte (95%, 80%, 75%) dauert jeweils 3 bis 5 Minuten.
4. Spülen Sie die Objektträger in entionisiertem Wasser ab.
5. Führen Sie die Epitopentnahme durch, indem Sie die Objektträger in einen Behälter (z. B. Coplin-Färbeglas) in einen 10-m-Natriumcitratpuffer mit einem pH-Wert von 6,0 m) in einem 1200-Watt-Mikrowellenherd mit 100% Leistung für 10 min tauchen.
6. Verwenden Sie einen unkonjugierten, polyklonalen Kaninchen-Antihuman-NuMA-Antikörper zur Markierung, verdünnt 1:7.000 in Tris-Rinderserumalbumin (BSA) (25 mM Tris, 15 mM NaCl, 1% BSA, pH 7,2). Führen Sie die entsprechenden Positiv- und Negativkontrollen parallel zu den Studienabschnitten durch.
7. Inkubieren Sie die Objektträger mit dem primären Antikörper für 12 h. Nachweis des primären Antikörpers mit einem Ziegen-Anti-Kaninchen-HRP-konjugierten Multimer und Visualisierung des Komplexes mit 3,3-Diaminobenzidin und einem Kupfersulfat-Enhancer.
8. Waschen Sie die Objektträger in destilliertem Wasser, bekämpfen Sie sie mit Hämatoxylin, dehydrieren Sie sie und montieren Sie sie mit permanentem Medium.
   HINWEIS: Die Dehydratisierungsschritte sind die Umkehrung der in Schritt 8.3 beschriebenen Rehydratationsschritte. Scannen Sie die Dias mit dem verfügbaren Scanner mit 20-facher oder 40-facher Vergrößerung und laden Sie sie in eine Datenbank hoch.
9. Ziehen Sie mithilfe von Software ROIs, um alle NuMA-gefärbten Zellen innerhalb des Organgewebes einzubeziehen, mit Ausnahme anderer Organparenchyme und leerer Räume.
10. Passen Sie die Einstellungen an, um die NuMA-positiven und NuMA-negativen Zellen zu kategorisieren, während Sie für jedes Organ geeignete Positiv- und Negativkontrollen verwenden. Verwenden Sie einen etablierten Softwarealgorithmus, um die Gesamtzahl / den Prozentsatz der NuMA-positiven Zellen für jede Probe zu quantifizieren.

9. Immunfluoreszenz von Gewebescheiben

Um das metastatische Stadium zu identifizieren, in dem ein bestimmter Genkandidat erforderlich ist (z. B. Extravasation vs. Überleben nach der Aussaat), kann man die Immunfluoreszenz von Gewebeschnitten zu verschiedenen Zeitpunkten bestimmen, um die Progression der Tumorzellen von der Injektion bis zur entfernten Organinvasion, dem Seeding und dem Wachstum zu verfolgen. Dieser Ansatz ermöglicht die Addition von Markern für benachbarte Zellen, um das Extravasationsereignis und die Veränderungen der umgebenden Tumormikroumgebung^{zu erfassen 33}.

1. Betäuben Sie das Tier wie in Schritt 7.1 beschrieben.
2. Injizieren Sie 100 μg fluorophorkonjugiertes Lycopersicon Esculentum (Tomaten) -Lektin 3 Minuten vor der Perfusion in den linken Ventrikel jedes Tieres, um das vaskuläre Endothel abzugrenzen.
   HINWEIS: Lassen Sie dem Tomatenlekt Zeit, um im gesamten System zu zirkulieren.
3. Das Tier wie in den Schritten 7.2-7.3 beschrieben durchbluten. Entnehmen Sie die Organe von Interesse und geben Sie sie in vorbeschriftete Behälter, die mit 4% PFA gefüllt sind. Fixieren Sie das Gewebe für 24 bis 48 h. Schneiden Sie das Gewebe mit einem Vibratom in 30-50 μm dicke Scheiben.
   HINWEIS: Die Dicke sollte optimiert werden. Scheiben zwischen 30 μm und 50 μm Dicke werden empfohlen, insbesondere bei der Durchführung von Z-Stack-Imaging.
4. Inkubieren Sie die Scheiben in Blockpuffer (10% normales Ziegenserum, 2% BSA, 0,25% Triton X-100 in DPBS) für 2 h bei RT.
5. Führen Sie ein Färbeoptimierungsexperiment durch.
   HINWEIS: Da die Antigenabrufzeit, die für die Antigengewinnung verwendeten Puffer, die Temperatur, verschiedene Antikörper / verschiedene Chargen und die Art des Gewebes die Färbung beeinflussen, sind Optimierungsexperimente erforderlich.
6. Fügen Sie primäre Antikörper bei einer optimierten Verdünnung hinzu und inkubieren Sie für eine optimierte Zeit bei einer optimierten Temperatur (siehe Beispiele in Tabelle 1).
   HINWEIS: Verwenden Sie geeignete Kontrollen für primäre/sekundäre Antikörper und ungefärbte Gewebeproben.
7. Waschen Sie die Gewebescheiben 3 Mal für 5 min mit 0,25% Triton X-100 in DPBS.
8. Inkubieren Sie die Gewebeschnitte in sekundären Antikörpern, verdünnt in Blockierlösung für die gewünschte Zeit (Tabelle 1).
9. Waschen Sie die Gewebescheiben 3 Mal für 5 min mit 0,25% Triton X-100 in DPBS.
10. Färben Sie die Kerne mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI), verdünnt 1:1.000 in DPBS oder blockieren Sie Puffer für 5 min.
11. Fügen Sie 2 Tropfen Antifade-Fluoreszenz-Montagemedium zu einem Deckglas hinzu und montieren Sie das Gewebe auf Glasobjektträger, um sicherzustellen, dass die Scheiben vollständig mit Montagemedium bedeckt sind.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen direkt auf den Scheiben befinden, da dies die Mikroskopie verzerrt.
12. Nehmen Sie konfokale Bilder mit dem verfügbaren Mikroskop mit einem 60-fachen Öl-Tauchobjektiv auf.
    HINWEIS: Wenn Sie konfokale Bilder aufnehmen, wenden Sie die gleichen Einstellungsparameter (Spannung, Lufteinheiten und Verstärkung) auf alle Bilder innerhalb des Experiments an.
13. Nehmen Sie nicht-konfokale Bilder mit dem Mikroskop bei 10x, 20x oder 40x auf.
14. Laden Sie die Bilder in eine Bildanalysesoftware hoch und analysieren Sie sie, indem Sie die Parameter der Wahl vergleichen (z. B. Fläche, Anzahl, Intensität der Marker oder Kontakt mit benachbarten Zellen).

Representative Results

Die folgenden Abbildungen veranschaulichen, wie der beschriebene Workflow zur Identifizierung neuartiger Treiber der Melanommetastasierung angewendet wurde. Abbildung 2 fasst die Ergebnisse einer veröffentlichten Studie zusammen, in der die Auswirkungen der Stilllegung der Fucosyltransferase FUT8 in vivo Melanommetastasen untersucht wurden²⁶. Kurz gesagt, die Analyse der glykomischen Daten des menschlichen Patienten (erhalten durch Lektin-Arrays) und die transkriptomische Profilierung zeigten erhöhte Konzentrationen von Alpha-1,6-Fucose, die mit einer Progression vom primären zu metastasierenden Melanom assoziiert sind, was mit einem Anstieg der entsprechenden Fucosyltransferase (FUT8) übereinstimmt.

113/6-4L-Melanomzellen, die mit Lentiviren mit einer FUT8-shRNA oder der entsprechenden Non-Targeting-Kontrolle (shNTC) transduziert wurden, wurden durch ultraschallgeführte intrakardiale Injektion in immundefiziente Mäuse (NSG) eingeführt, wie oben beschrieben (Abschnitt 2.9). Die Mäuse wurden mittels in vivo BLI auf metastatische Verbreitung überwacht. Die Mäuse wurden am Ende des Experiments eingeschläfert, die Organe auf Ex-vivo-Fluoreszenz untersucht und für histologische Analysen aufbereitet. Zusätzlich zu H & E wurde die NuMA-Färbung durchgeführt, um menschliche Zellen in murinen Geweben spezifisch zu identifizieren. Wie in Abbildung 3 dargestellt, wurden NuMA-gefärbte Schnitte mittels digitaler Bildgebung verarbeitet, um die metastatische Belastung über mehrere Abschnitte und experimentelle Gruppen hinweg zu quantifizieren. Ein ähnlicher Arbeitsablauf kann angewendet werden, um den Beitrag anderer Kandidatengene zur Melanommetastasierung zu bewerten.

Abbildung 3: NuMA-gefärbte Lungenschnitte. (A) Linke, repräsentative Bilder von NuMA-gefärbten Lungenschnitten aus Gruppe I (Melanomzellen, die mit Kontroll-Lentivirus infiziert sind) und Gruppe II (Melanomzellen, die mit einem Metastasensuppressor-exprimierenden Lentivirus infiziert sind). Maßstabsstäbe = 1.000 μm. Insets zeigen metastatische Herde (Mitte), die mit Hilfe von Software quantifiziert werden können. Richtig, metastasierende Melanomzellen sind grün markiert, und der Organbereich wird durch eine grün geschlüpfte Linie abgegrenzt. NuMA-negative Zellen sind blau markiert. Skalenbalken = 100 μm. (B) Das Beispiel einer Mikrometastasierung in NuMA-gefärbten Lungenschnitten veranschaulicht die Empfindlichkeit der Software bei der Erkennung einer kleinen Anzahl von Zellen. Maßstabsstäbe = 100 μm. Abkürzung: NuMA = Nuclear Mitotic Apparatus Protein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Antikörper	Hersteller	Katalog-Nr.	Wirtsarten	Reaktivität	Fluorophor	Verdünnung	Inkubationszeit	Inkubationstemperatur
Anti-GFP	Abcam	Ab6556	Kaninchen	Maus	Unkonjugiert	1:1000	24 Std.	4°C
Anti-GFAP	Aves Labs	Bruttoanlageinvestitionen	Huhn	Maus	Unkonjugiert	1:2000	24 Std.	4°C
sekundär	Invitrogen	A11041	Ziege	Huhn	A-568	1:500	2 Std.	Raumtemperatur
sekundär	Invitrogen	A32731	Ziege	Kaninchen	A488	1:500	2 Std.	Raumtemperatur

Tabelle 1: Beispiele für Antikörper- und Inkubationsbedingungen für die Immunfluoreszenz von Hirnschnitten.

Zelllinie	Art	Zeit bis zur Euthanasie	Geschlecht der Mäuse	Genetischer Hintergrund von Mäusen	Weg der Injektion	# Zellen injiziert	Orte der Metastasierung
12-273 BM+	Humanes Melanom STC	4-5 Wochen	M	NSG	Intrakardial	100C	Hirnparenchym, Leptomeninges, Leber, Niere, Nebennieren
131/4-5B1*	Humanes Melanom	4-6 Wochen	M	Athymischer Akt oder NSG	Intrakardial	50-200K	Hirnparenchym, Leber, Lunge
113/6-4L*	Humanes Melanom	5-7 Wochen	M	Athymischer Akt oder NSG	Intrakardial	50-100K	Hirnparenchym (wenige), Leber, Lunge
WM 4265-2**	Humanes Melanom STC	11 Wochen	M	Athymischer Akt oder NSG	Intrakardial	200.000	Hirnparenchym
WM 4257-1**	Humanes Melanom STC	10-13 Wochen	M	Athymischer Akt	Intrakardial	100C	Hirnparenchym (wenige)
WM 4257-2**	Humanes Melanom STC	10-13 Wochen	M	Athymischer Akt	Intrakardial	100C	Hirnparenchym
10-230 BM+	Humanes Melanom STC	8-9 Wochen	M	Athymischer Akt	Intrakardial	100C	Hirnparenchym, Leptomeninges, Leber (wenige)

Tabelle 2: Aufschlüsselung der Ergebnisse repräsentativer In-vivo-Experimente verschiedener humaner Melanomzelllinien und Kurzzeitkulturen nach dem beschriebenen Protokoll.

Discussion

Ziel dieses technischen Berichts ist es, einen standardisierten, von oben nach unten gerichteten Workflow für die Untersuchung potenzieller Akteure bei Melanommetastasen anzubieten. Da In-vivo-Experimente kostspielig und zeitaufwendig sein können, sind Strategien zur Maximierung der Effizienz und zur Steigerung des Wertes der erhaltenen Informationen von größter Bedeutung.

Es ist unerlässlich, komplementäre Ansätze zu verwenden, um die Ergebnisse innerhalb desselben Experiments zu überprüfen. Zum Beispiel sind sowohl die immunhistochemische Färbung von NuMA als auch BLI komplementäre Methoden zur Quantifizierung der metastatischen Belastung, da keine von beiden umfassend ist. Während BLI eine unschätzbare, nichtinvasive Methode zur Verfolgung der Tumorprogression in vivo ist, sind diese Daten von Natur aus von geringer Auflösung. Die NuMA-Färbung ermöglicht eine sorgfältige Analyse der metastatischen Belastung in festen Organen; Eine umfassende Schnittführung über die gesamte Gewebedicke ist jedoch unpraktisch. Daher kann nur eine Probe jeder Orgel gefärbt werden. Tatsächlich sind die BLI-Ergebnisse nach der Erfahrung der Autoren nicht immer direkt proportional zur Tumorbelastung, die in der histopathologischen Analyse offensichtlich ist. Dies ist zum Teil auf die begrenzte Empfindlichkeit dieser Methode, insbesondere im Gehirn, aufgrund der transkraniellen Dämpfung^{zurückzuführen 34}. Darüber hinaus können diese Daten durch eine unvollständige Luciferinaufnahme und/oder einen variablen Luciferase-Ausdruck beeinflusst werden. Daher sollte BLI in Verbindung mit Ex-vivo-Bildgebung und histopathologischen Studien interpretiert werden.

Die histologische Bewertung von Gewebeproben, die mit generischen Flecken wie H & E behandelt wurden, erfordert eine spezielle anatomopathologische Ausbildung, ist oft durchsatzarm und anfällig für Variationen zwischen Beobachtern. Die Autoren arbeiten derzeit mit Bioinformatik-Kollegen zusammen, um die experimentelle Datenanalyse zu standardisieren und zu beschleunigen, indem sie einen maschinellen Lernalgorithmus zur automatisierten und zuverlässigen Quantifizierung der metastatischen Belastung als Prozentsatz des Organgewebeschnitts in histopathologischen Bildern entwickeln. Diese und andere Werkzeuge werden für das Feld von entscheidender Bedeutung sein, zumal die Rolle der metastatischen Mikroumgebung mit einer feineren Auflösung in den Fokus rückt (z. B. räumliche Transkriptomik). Dennoch ist eine fachkundige histopathologische Beurteilung des Gewebes unerlässlich, insbesondere bei Subtypen der Hirnmetastasierung wie Leptomeningeal, einem biologisch unterschiedlichen Subtyp, der leicht als parenchymale Hirnmetastasierung allein über BLI fehlinterpretiert werden kann. Die NuMA-Färbung (Abschnitt 8) beschleunigt die histopathologische Beurteilung der metastasierenden Belastung und ermöglicht eine unvoreingenommene Identifizierung und Quantifizierung menschlicher Zellen in Mausorganen. Die Unterscheidung zwischen anatomischen Kompartimenten auf NuMA-gefärbten Abschnitten, wie dem Gehirnparenchym gegenüber den Leptomeninges, ist jedoch entscheidend, um weitere biologische Erkenntnisse zu gewinnen.

Die hierin beschriebenen Techniken können verwendet werden, um die funktionelle Relevanz von Genen zu untersuchen, die für die metastasierende Kaskade des Melanoms von Interesse sind. Es ist wichtig, ein Modell mit einem reproduzierbaren Phänotyp auszuwählen, das für die betreffende Studie geeignet ist. Zum Beispiel kann ein Gen, das in menschlichen Patientenproben von Metastasen hochreguliert ist, "niedergeschlagen" werden, um zu beurteilen, ob dies die metastatische Belastung im Vergleich zu einer Kontrollgruppe verringert. Dieser Ansatz wird am besten in einer Modellzelllinie oder Kurzzeitkultur durchgeführt, die sowohl a) eine hohe Expression des interessierenden Gens aufweist als auch b) eine signifikante metastatische Belastung mit zuverlässiger Kinetik erzeugt, wenn sie in Mäuse injiziert wird, so dass eine Abnahme der metastatischen Kapazität spürbar ist und der getesteten genetischen Störung zugeordnet werden kann.

Entscheidend für das experimentelle Design ist auch die gewählte Art der Injektion, die für das untersuchte Stadium der Metastasierung am besten geeignet ist. Jedes Stadium der metastatischen Kaskade stellt unterschiedliche biologische und physikalische Barrieren für Melanomzellen dar. Forscher, die Fragen zu den Anfangsstadien der Metastasierung, nämlich Invasion und Intravasation, beantworten möchten, sollten die in Abschnitt 2 beschriebenen Techniken für intradermale bzw. subkutane Injektionen anwenden, gefolgt von einer Überlebensoperation (Abschnitt 3). Wichtig ist, dass diese Verfahren den Prozess nachahmen, durch den primäre Melanome beim Menschen reseziert werden, wonach ein Patient Metastasen aufweisen kann oder auch nicht. Obwohl technisch empfindlicher als die subkutane Injektion, pflanzt die intradermale Route Tumorzellen in das anatomische Kompartiment, in dem sich Melanome bei menschlichen Patienten entwickeln. Dies ist besonders wichtig in Studien zur Immunüberwachung von Melanomen, da die Haut ein einzigartiges Ökosystem von patrouillierenden Immunpopulationen^{hat 35}.

Wenn sich die zu testende Hypothese jedoch auf spätere Stadien der Metastasierung, wie die Extravasation aus dem arteriellen Kreislauf, konzentriert, sind Methoden wie die intrakardiale, intrakarotis- und retroorbitale Injektion vorteilhaft. Diese Techniken führen zu Metastasen in einem größeren Maßstab in einer viel kürzeren Zeitspanne als diejenigen, die einen "primären" Tumor betreffen. Insbesondere für Studien zur Hirnmetastasierung können Modelle, die zuverlässig Tumore im Hirnparenchym produzieren, schwierig zu etablieren sein. In diesen Fällen stellen intrakarotis- und retroorbitale Injektionen Methoden zur Umgehung von Organen mit niedrigeren "Eintrittsbarrieren" wie Leber und Nieren dar, die bei Mäusen, die über den intrakardialen Weg injiziert werden, zu einer vorzeitigen Mortalität führen können.

Der genetische Hintergrund der Wahl der Maus für die Xeno- oder Allotransplantattransplantation hängt von der Quelle der Zellen (Mensch, Maus) und gelegentlich von genetischen Veränderungen der implantierten Zellen ab, die eine Abstoßung des Immunsystems hervorrufen können. Experimente mit menschlichen Xenograft-Modellen werden normalerweise an Mäusen mit beeinträchtigtem adaptivem und angeborenem Immunsystem, ^{NOD.Cg-Prkdc scidIl2rg tm1Wjl}/SzJ (NSG) Mäusen durchgeführt; oder Mäuse ohne adaptive Immunität, wie T-Zell-defiziente athymische/nackte (NU/J) Mäuse. Ein weiteres häufig verwendetes immunodefizientes Modell ist das RAG2-Knockout-Modell (KO), dem B- und T-Zellen fehlen und das eine funktionelle natürliche Killerzellpopulation beibehält. Diese immundefizienten Mausmodelle müssen strategisch eingesetzt werden, da jedes Modell Vorteile auf Kosten einiger Nachteile im Zusammenhang mit ihren intrinsischen Immunschwächen hat. Nach der Erfahrung der Autoren weist derselbe Zelllinien- oder Patienten-abgeleitete STC einen unterschiedlichen Organtropismus auf, der auf dem Injektionsweg (z. B. subkutan vs. intrakardial) und/oder dem Empfängermausstamm (z. B. NSG vs. athymisch/nackt) basiert (siehe Tabelle 2).

Um die experimentelle Variabilität in Bezug auf den Wirt, in den Melanomzellen implantiert werden (z. B. Immunantwort, Mikrobiota), zu verringern und die zielgenauen und reproduzierbaren Befunde zu maximieren, wird Folgendes empfohlen: i) Erhöhung der Anzahl der Versuchstiere pro Gruppe (unter Verwendung von Leistungsberechnungen, um eine optimale Anzahl basierend auf der Effektgröße zu erreichen), ii) Verwendung orthogonaler Methoden zur Manipulation von Genkandidaten (d. h. CRISPR/Cas9, CRISPRi, shRNA) und "Add-Back"-Experimente (d.h. begleitende ektopische Expression einer Cas9- oder shRNA-resistenten cDNA des interessierenden Gens). Diese komplementären Techniken reduzieren die Möglichkeit von Off-Target-Effekten und/oder biologische und experimentelle Variationen.

Während dieses Protokoll sicherlich für die hypothesengetriebene Validierung von Kandidatentreibern oder Suppressoren der Metastasierung angewendet werden kann, können diese Methoden auch für unvoreingenommene, explorative Studien nützlich sein. Zum Beispiel ermöglichen gepoolte CRISPR/cas9-, CRISPR-KRAB-dCas9 (CRISPRi) und shRNA-basierte Screens einen Prozess der darwinistischen Selektion, der sich in vivo³⁶ abspielt. Die konzeptionelle Grundlage für solche Studien ist wie folgt: Eine Zelle mit einem ausgeknockten Gen, das für den Phänotyp von Interesse (z. B. Tumorwachstum) wesentlich ist, stirbt oder vermehrt sich nicht, so dass ihre Repräsentation in der sequenzierten Bibliothek am Ende des Experiments relativ zur Baseline verringert wird. Die hier beschriebenen Verfahren können für einen solchen Ansatz mit entsprechender Optimierung^37,38 angewendet werden.

In Bezug auf die Auswahl von Kandidatengenen können mehrere Quellen abgebaut werden. Melanom-Patiententranskriptomik- und Proteomik-Datensätze sind über den NCBI Gene Expression Omnibus (GEO)³⁹, das European Genome-Phenome Archive 40, das cBioPortal⁴¹ (das den Cancer Genome Atlas oder TCGA⁴² hostet) und andere Hosting-Sites öffentlich zugänglich. Eine erneute Analyse von Rohdaten wird empfohlen, da die Qualitätskontrollmaßnahmen zwischen den öffentlichen Datenbanken stark variieren können, was sich auf die Ergebnisse auswirkt. Bei der Abfrage von Rohdatensätzen sind folgende Fragen für die Auswahl von Kandidatengenen geeignet, die für die Anwendung auf den hier beschriebenen Workflow geeignet sind: Welche Gene sind in metastasierenden Proben im Vergleich zu primären Melanomproben oder zu melanozytären Nevi fehlreguliert?; Welche Gene sind an bestimmten Metastasenstellen fehlreguliert?; Ist die fehlregulierte Expression des Kandidatgens mit einem verbesserten Überleben des Patienten verbunden?; Ist dieses Gen Teil eines größeren Genexpressionsprogramms, das im Allgemeinen fehlreguliert ist? Sind die Interaktoren des Genprodukts gut charakterisiert oder unbekannt?; Ist das Genprodukt medikamentös und wenn ja, stehen Targeting-Tools zur Verfügung?; Und ganz wichtig, ist das Gen für alle menschlichen Zellen oder für viele Gewebe so wichtig, dass sich eine Störung seiner Aktivität in einer klinischen Umgebung als toxisch erweisen könnte?

Die geeignete Strategie für die Manipulation der interessierenden Gene hängt von den zu testenden Hypothesen ab. Zum Beispiel kann ein Gen, das in Metastasen hochreguliert ist, niedergeschlagen werden, um zu beurteilen, ob die entsprechenden Mäuse im Vergleich zu einer Kontrollgruppe eine verringerte metastatische Belastung aufweisen würden. Dieser Ansatz wird am besten in einer Modellzelllinie oder Kurzzeitkultur durchgeführt, die sowohl a) eine hohe Expression des interessierenden Gens als auch b) eine beträchtliche metastatische Belastung erzeugt, wenn sie in Mäuse mit reproduzierbarer Kinetik injiziert wird. Knockdown-Ansätze umfassen shRNA- und CRISPR/Cas9-basierte Methoden, die beide über eine lentivirale Infektion von Melanomzellen entwickelt und induzierbar oder konstitutiv eingesetzt werden können. Einer der Vorteile der induzierbaren Expression (siehe pLKO Tet-On im Table of Materials) ist die zeitliche Regulation des Knockdowns, die in einem In-vivo-Experiment genutzt werden kann. So können induzierbare shRNAs/sgRNAs verwendet werden, um ein "therapeutisches Setting" zu modellieren, in dem etablierte Tumorzellen einem Kandidaten-Gen-Knockdown unterzogen werden. Die Exposition gegenüber dem induzierenden Mittel, z. B. Doxycyclin, kann jedoch Konsequenzen für das Verhalten bestimmter Melanomzellen haben; Daher ist die Einbeziehung von Kontrollzellen, die mit einer verschlüsselten shRNA transduziert wurden, die auch diese Behandlung erfahren, von entscheidender Bedeutung.

Während shRNAs oft zu einem teilweisen Knockdown der Genexpression führen, editieren CRISPR/Cas9-basierte Systeme ein Gen auf DNA-Ebene und lösen theoretisch einen vollständigen "Knockout" (KO) aus. Ihre Verwendung bringt sowohl Vor- als auch Nachteile mit sich. Wenn ein Gen für die Lebensfähigkeit von Melanomzellen unerlässlich ist, werden Zellen mit einem vollständigen KO in vitro und später in vivo negativ ausgewählt. Obwohl dieses Problem durch die Auswahl von Einzelligen teilweise gemildert werden kann, haben Melanomzellen Schwierigkeiten, aus einzelnen Zellen zu wachsen, was zu unvorhersehbaren und oft unterschiedlichen Anpassungen führt. Daher müssen mehrere KO-Klone getestet werden, um interklonale phänotypische Variationen zu kontrollieren. Darüber hinaus kann insbesondere bei patientenabgeleiteten STCs die Anzahl der lentiviralen Infektionen, denen Melanomzellen ausgesetzt sind, die In-vitro-Proliferation und das metastasierende Verhalten in vivo stark beeinflussen. Daher wird ein Single-Vektor-, Einzelinfektionsansatz empfohlen, der Cas9 und eine sgRNA (siehe lentiCRISPRv2 in der Materialtabelle) enthält. Andere Systeme nutzen eine "rekombinase tote" Cas9, um transkriptionelle Repression hervorzurufen (dCas9-KRAB in der Tabelle der Materialien).

Ein Gain-of-Function-Ansatz kann angebracht sein, wenn ein Gen von Interesse als metastasenförderndes Gen hypothetisch angesehen wird. In diesem Fall ist die Auswahl einer Melanomlinie, die bei der Injektion bei Mäusen nur wenige Metastasen liefert und eine geringe basale Expression des interessierenden Gens aufweist, von entscheidender Bedeutung. Überexpressionskonstrukte (insbesondere solche, die von CMV-Promotoren angetrieben werden) führen oft zu supraphysiologischen Expressionsniveaus, die proteotoxischen Stress verursachen. Daher wird empfohlen, lentivirale Vektoren zu wählen, die die physiologische Expression des interessierenden Gens ermöglichen.

Sobald ein Ansatz ausgewählt wurde, ist es wichtig, vor der Transplantation von Zellen die folgenden Experimente durchzuführen. Lentivirale Infektionsverfahren variieren zwischen den Labors und erfordern eine Optimierung für jede Zelllinie und jedes Knockdown-System. Zu den universellen Überlegungen gehört jedoch eine vollständige positive oder negative Auswahl von Zellen mit Gen-Knockdown (z. B. FACS/Zellsortierung für fluoreszierende Reporter oder Antibiotikaresistenzselektion, falls zutreffend), gefolgt von RT-qPCR und Western Blot mit geeigneten Kontrollen, um einen reproduzierbaren und robusten Knockdown oder eine Überexpression des interessierenden Gens nachzuweisen. Es sollte ein In-vitro-Proliferationsassay durchgeführt werden, um festzustellen, ob die Interferenz mit dem interessierenden Gen die Lebensfähigkeit der Zellen beeinträchtigt. Dieser Schritt ist wichtig für eine zuverlässige Zellcharakterisierung und für die korrekte Interpretation von in vivo Ergebnissen. Hier ist ein Beispiel für eine Falle, wenn die beschriebenen Experimente nicht durchgeführt werden: Wenn ein Gen-Knockdown in vitro zu einem drastischen Proliferationsdefekt führt, wird dies die Interpretation der verminderten metastatischen Belastung durcheinander bringen, da der spezifische Beitrag dieses Gens zur metastatischen Kaskade nicht genau beurteilt werden kann. Verschiedene Modalitäten von Proliferationsassays umfassen kommerziell erhältliche Kits, Live-Zellbildgebungssysteme oder traditionelle zellkulturbasierte Assays, z. B. Kristallviolett, Trypanblau-Ausschluss.

Zu den Haupteinschränkungen für diese Plattform bei der Entdeckung von Mediatoren im Melanom gehört, dass der vorgeschlagene Workflow nur tumorzellintrinsische Genkandidaten untersucht, nicht Gene, die von den Zellen der umgebenden Mikroumgebung in verschiedenen metastatischen Stadien exprimiert werden, die Schlüsselmodulatoren der Tumorzellanpassung und der Aussaat von distalen Organen sind. Ein weiterer wichtiger zu berücksichtigender Faktor ist das differentielle metastatische Verhalten basierend auf der Transplantationsroute. Die Variabilität zwischen Labor und Interoperator, die einigen der vorgestellten Techniken innewohnt, kann durch Standardisierung im gesamten Bereich der Metastasenforschung angegangen werden. Derzeit ist das am besten geeignete Protokoll für die Standardisierung die intrakardiale Injektion aufgrund der Ultraschallführung und der statischen Injektionsgeräte, die die Variabilität der Interoperatoren reduzieren. Dieses Protokoll stellt einen der zahlreichen Schritte in Richtung Einheitlichkeit, Reproduzierbarkeit und gründliche Dokumentation der Methoden dar, die in Labors zur Identifizierung neuartiger Mediatoren von Melanommetastasen verwendet werden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
#15 Scapel Blade	WPI	500242	For surgical procedures
#3 Scapel Handle	WPI	500236	For surgical procedures
1 mL Tuberculin syringe, slip tip	BD	309626	Injections
10 mL syringe, slip tip	BD	301029	Perfusion
10% Formalin Sodium Buffered	EK Industries	4499-20L	For perfusion/tissue fixative
15 mL Conical	Corning	430052	Cell culture
15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes	Falcon	352196	Cell culture
200 Proof Ethanol	Deacon Labs	04-355-223	Histology
22G – 22mm needle	BD	305156	Perfusion
4-0 Vicryl Suture	Ethicon	J464G	Suture
4% Carson's phosphate buffered paraformaldehyde	EMS	15733-10	For perfusion/tissue fixative
40µm	Corning	431750	Tissue processing
5-0 Absorbable Suture	Ethicon	6542000	Closure
50 mL Conical	Corning	430828	Cell culture
50mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes	Falcon	352070	Cell culture
7-0 Silk suture	FST	18020-70	Ligature
70µm	Corning	431751	Tissue processing
Anti-fade mounting media	Vector Labs	H-1000-10	Immunofluorescence
Approximator applying Forceps, 10cm	WPI	14189	For microsurgical procedures
Avance	Bruker	3 HD	NMR Console
Biospec 7030	Bruker	7030	Micro MRI
BSA	Bioreg	A941	NuMA Staining
Castroviejo suturing forceps, straight tips 5.5mm tying platform, 11cm	WPI	WP5025501	For microsurgical procedures
Coplin Staining Jar	Bel-Art	F44208-1000	Histology
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-1MG	Immunofluorescence
dCas9-KRAB	Addgene	110820	Genetic manipulation
DNase I	NEB	M0303L	Tissue processing
DPBS	Corning	21-030-CM	Tissue processing
Extra Sharp Uncoated Single Edge Blade	GEM	62-0167	Tissue processing
Extracellular Matrix Substrate	Corning	354234	Consider the Growth Factor Reduced ( as alternative
FBS	Cytiva	SH30910.03	Cell culture
Fiji Image J	Fiji Image J	Software	Immunofluorescence
Goat anti-rabbit HRP conjugated multimer	Thermo Fisher	A16104	NuMA Staining
Goat Serum	Gibco	PCN5000	Immunofluorescence
HBSS	Corning	21-020-CV	Tissue processing
Hematoxylin	Richard-Allan Scientific	7231	Histology
Illumina III	PerkinElmer	CLS136334	BLI Instrument
Insulin syringe 28G - 8mm needle	BD	329424	Injections
Insulin syringe 31G - 6mm needle	BD	326730	Injections
Iris Forceps, 10.2cm, Full Curve, serrated	WPI	504478	For perfusion and surgical procedures
Isoflurane USP	Covetrus	11695067772	Anesthesia
Jewelers #7 Forceps Titanium 11 cm 0.07 x 0.01 mm Tip	WPI	WP6570	For microsurgical procedures
Ketamine HCl 100mg/mL	Mylan Ind.	1049007	Anesthesia
lentiCRISPRv2	Addgene	98290	Genetic manipulation
Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin, DyLight 649	Invitrogen	L32472	Vascular endothelial cells marker
MEM non-essential amino acids X 100	Corning	25-025-CI	Cell culture
Metzenbaum Scissors	WPI	503269	For surgical procedures
Microinjection Unit	KOPF	5000	Intracardiac injections
NaCl	Fisher	S25877	NuMA Staining
Needle 30G x 25mm	BD	305128	Intracardiac Injection
Needle 33G x 15mm	Hamilton	7747-01	Intracarotid Injection
Needle holder, Castroviejo, 14cm, with lock, 1.2mm Serrated Jaws	WPI	14137-G	For microsurgical procedures
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice	The Jackson Laboratory	005557	Murine model
NU/J mice	The Jackson Laboratory	002019	Murine model
Nuclear Mitotic Apparatus Protein polyclonal rabbit anti-human	Abcam	97585	NuMA Staining
Penicillin-Streptomycin 10000U/mL	Gibco	15140122	Cell culture
Percoll	GE	0891-01	density separation solution
PI Classic Surgical Gloves	Cardinal Health	2D72PT75X	Surgery
pLKO Tet-On	Addgene	21915	Genetic manipulation
Povidone-Iodine 10% Solution	Medline	MDS093943	Surgery
Proparacaine Drops 0.5%	Akorn Pharma	AX0501	Opthalmic local anesthetic
Puralube Petrolatum Opthalmic Ointment	Dechra	83592	Anesthesia
Razor Blade Double Edge Blades	EMS	72000	Shaving and Vibrotome Brain Slicing
Reflex 9mm EZ Clip	Braintree	EZC- KIT	Wound closure
RPMI 1640	Corning	10-040-CM	Cell culture
Scissors, Spring 10.5cm Str, 8mm Blades	WPI	501235	For microsurgical procedures
Semi-Automatic Vibrating Blade Microtome	Leica	VT1200	Brain Slice Immunofluorescence
Single Channel Anesthesia Vaporizer System	Kent Scientific	VetFlo-1210S	Anesthesia
Smartbox Tabletop Chamber System and Exhaust Blower	EZ Systems	TT4000	CO2 Euthanasia
Sterile Fenestrated Disposable Drape	Medline	NON21002	Surgery
Sterile Non-Reinforced Aurora Surgical Gowns with Set-In Sleeves	Medline	DYNJP2715	Surgery
T25 Flask	Corning	430639	Cell culture
Tris	Corning	46-031-CM	NuMA Staining
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-500ML	Immunofluorescence
Troutman tying forceps, 10cm, Curved G pattern, 0.52mm tip with tying platform	WPI	WP505210	For microsurgical procedures
Vessel clips 10G Pressure 5x 0.8mm Jaws, 5/pkg	WPI	15911	For microsurgical procedures
Visiopharm	Visiopharm	Visiopharm	NuMA Staining Quantification Software
Xylasine 100mg/mL	Akorn Pharma	59399-111-50	Anesthesia
Xylene	Fisher	X3P-1GAL	Histology