Summary
演示了一种高速开顶紫外光声显微镜,可以在术中为手术边缘分析提供组织学图像,包括系统配置,光学对准,样品制备和实验程序。
Abstract
手术切缘分析(SMA)是确认肿瘤切除手术中癌组织完全切除的必要程序,需要术中诊断工具,以避免由于手术切缘阳性而重复手术。最近,利用266 nm波长下DNA/RNA的高固有光学吸收,紫外光声显微镜(UV-PAM)被开发出来,以提供高分辨率的组织学图像,无需标记,显示出作为SMA术中工具的巨大前景。为了能够开发用于SMA的UV-PAM,这里提出了一种高速开顶UV-PAM系统,其操作方式类似于传统的光学显微镜。UV-PAM 系统通过单轴振镜扫描提供 1.2 μm 的高横向分辨率和 55 kHz A 线速率的高成像速度。此外,为了确保病理学家无需额外培训即可轻松解释UV-PAM图像,原始灰度UV-PAM图像通过深度学习算法进行虚拟染色,以模拟标准苏木精和曙红染色图像,从而实现免培训的组织学分析。进行小鼠脑切片成像以证明开顶UV-PAM系统的高性能,说明其在SMA应用中的巨大潜力。
Introduction
手术切缘分析(SMA)需要在显微镜下检查组织标本,是确定切除手术中是否从患者体内取出所有癌细胞的基本程序1。因此,能够快速提供组织学图像的显微镜对于SMA至关重要,可以避免因不完全切除癌细胞而引起的重复手术。然而,根据目前基于明场光学显微镜的金标准方法,切除的组织需要固定在福尔马林中,嵌入石蜡中,切片成薄片(4-7μm),然后在成像前用苏木精和曙红(H&E)染色,这很耗时(3-7天)且费力2,3.冷冻切片是SMA的快速替代方法,通过快速冷冻,切片和染色组织,可以在20-30分钟内提供组织学图像4。然而,组织学特征经常被扭曲,需要熟练的训练,这阻碍了该技术对多种类型的器官的适用性5。
已经为SMA开发了可以提供细胞图像的光学显微镜技术,而无需或只需几个组织处理步骤。但是,他们每个人都有不同的问题。例如,光学相干断层扫描6 和共聚焦反射显微镜7 由于其固有的散射对比度低而具有低特异性。虽然具有紫外线表面激发8 和光片显微镜9 的显微镜可以为SMA提供高分辨率和高对比度的图像,但毒性和挥发性染色程序通常不能在手术室中进行,这延长了周转时间。多光子显微镜10 和受激拉曼显微镜11 可以为SMA提供丰富的信息。然而,用于产生非线性效应所需的超快激光器的高成本阻碍了它们的广泛适用性。
最近,通过利用固有的光学吸收,已经开发了无标记紫外光声显微镜(UV-PAM)来提供高分辨率组织学图像12。在UV-PAM中,激发UV光的光子能量(例如,266nm)首先被细胞核13 中的DNA / RNA吸收,然后转化为热量,通过热弹性膨胀14诱导声波发射。通过检测产生的声波, 可以通过 声学信号的最大振幅投影获得细胞核的二维(2D)UV-PAM图像,从而为SMA提供组织学信息。为了实现UV-PAM的临床应用,已经开发了基于振镜扫描的高速UV-PAM,可在18分钟内为脑活检样本(5 mm x 5 mm)提供组织学图像,在时间敏感型应用中显示出巨大的潜力15.为了进一步验证UV-PAM在厚组织成像中的可能性,提出了一种带有防水单轴微机电系统扫描仪的反射模式UV-PAM系统,成功地证明了术中对人结肠和肝脏组织的组织病理学检查16。由于原始UV-PAM图像是灰度的,而黄金标准的H&E染色图像是粉红色和紫色的,病理学家很难直接解释UV-PAM图像。为了解决这个问题,提出了一种深度学习算法,将灰度UV-PAM图像近乎实时地转移到虚拟H&E染色图像中,以便病理学家无需任何额外培训即可理解图像17。
这项工作报告了一种高速开顶UV-PAM系统,该系统可以像传统的光学显微镜一样操作,提供原始的灰度组织学图像和由深度学习算法辅助的虚拟染色图像。UV-PAM系统对福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)小鼠脑切片进行成像,以证明我们几乎染色的UV-PAM与标准H&E染色图像之间的相似性,显示了其在SMA应用中的潜力。
Protocol
本工作中进行的所有动物实验均由香港科技大学动物伦理委员会批准。
1. 开顶式 UV-PAM 系统(图 1)
- 光学照明
- 使用Q开关二极管泵浦固态激光器(266 nm波长)作为激励源。
- 使用两个凸透镜扩展激光束,并在靠近第一个凸透镜焦点的地方放置一个针孔以执行空间滤波。
- 使用1D振镜(1D GM)向上反射激光束。
- 使用物镜聚焦激光束,并通过环形超声换能器(UT)的中心,然后紧紧聚焦在样品上。
- 超声波检测
- 使用环形聚焦UT检测超声波。超声有效区域的内径和外径分别为3 mm和6 mm。焦距: 6.3 毫米;中心频率:40兆赫;-6 dB 带宽:84%。
- 将UT固定在实验室制造的水箱中,底部有一个光学透明的窗口,由薄石英盖玻片覆盖,以允许紫外线通过。确保UT的有效区域朝上。将水箱连接到两轴手动载物台上,以控制UT的横向位置。
- 打开紫外激光器,调整UT的位置,以允许激光束从UT的中心通过。关闭紫外激光。然后,用去离子水填充水箱以完全浸入UT。
- 将UT的输出连接到两个放大器(总增益= 56 dB),并将第二个放大器的输出连接到数据采集卡(DAQ)。
- 将样品架连接到连接到xy电动载物台的z轴手动载物台上。样品架有一个空孔,允许紫外线通过。在孔周围贴上四条双面胶带。
- 系统对齐
- 将黑色胶带连接到载玻片上,并将载玻片盖住样品架的孔,黑色胶带朝下。按压载玻片以确保其固定在样品架上。然后,降低样品架,将载玻片浸入水中。
- 断开环形UT和放大器,将UT连接到脉冲发生器/接收器,并将脉冲发生器/接收器的输出连接到示波器。将脉冲发生器/接收器操作到脉冲回波模式。将脉冲幅度和脉冲发生器/接收器的增益分别设置为6和20 dB。
- 启用脉冲发生器/接收器并调整样品支架的 z 位置,以找到超声信号最大的声学焦平面位置。
- 将脉冲发生器/接收器更改为传输模式,并将增益设置为60 dB。启用激光输出。调整物镜的 z 轴位置,以最大化示波器测量的 PA 信号。
- 调整环形UT的横向位置,使生成的PA信号对称且最大,表示光学和声学焦点在侧平面中合并。然后,调整样品架的 z 位置以最大化 PA 信号。
- 重复步骤1.4.3和1.4.4以优化PA信号的对称性和幅度。优化PA信号时,在示波器上记录时间延迟(即PA波到达UT所需的时间)。
- 移动样品架以成像黑色胶带的不同位置。调整样品架的平整度,使从黑色胶带的每个位置产生的PA信号具有与步骤1.4.5中测量的时间延迟相同的时间延迟。
- 关闭激光器并将UT连接到两个放大器。
2. 样品制备
- FFPE小鼠脑切片
- 用过量的麻醉剂处死小鼠。然后,按照参考文献18中描述的方案收获小鼠大脑。
- 将收获的大脑固定在10%中性缓冲福尔马林中24小时。
- 通过用分级醇脱水,用二甲苯清除,并用石蜡包埋来处理固定的大脑,如参考文献19中所述。
注意:在通风橱中处理样品。 - 使用切片机将嵌入的大脑切片成薄片(厚度为5μm)。将样品切片放在石英载玻片上。将载玻片在60°C的烘箱中干燥1小时。
- 使用清除剂对切片进行脱蜡(参见 材料表),其去除石蜡以避免高背景信号,因为石蜡在紫外线激发下具有高度吸收性。
注意:在通风橱中处理样品。
- 新鲜小鼠脑切片
- 用过量的麻醉剂处死小鼠。然后,按照参考文献18中所述的方案收获小鼠大脑。
- 用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗小鼠大脑以去除血液。
- 用手切一片脑样本(〜5毫米厚),然后用PBS清洗样品以除去横截面上的血液。
3. 实验程序
- 样品放置
- 准备带有紫外透明膜(聚乙烯,厚度∼10μm)的实验室制造的样品罐。向膜中加入一滴水,然后将生物样品放在样品罐上以覆盖水。对于FFPE切片样品,使用胶带将载玻片固定在膜上。
- 将含样品的样品罐放在样品架上,确保覆盖样品架的空孔。
- 将紫外激光设置为外部触发模式。使用 我们 的 实验 室 自 建 的 LabVIEW 程序 (参见 材料 表), 设置 扫描 参数 如下。
- 将激光重复频率设置为55 kHz;将GM驱动器的 信号类型e设置为 三角形 ,将驱动电压 范围 设置为0.018 V(表示±0.018 V;比例因子:1 V / °)。将 GMnum 设置为22, 将dy 设置为2,以便在每22次激光触发后,GM完成四分之一的扫描周期,y轴电机移动0.3125μm的步长。将 dx 设置为192,以便当y轴电机达到预设位置(例如,5 mm)时,x轴电机移动30μm的步长。
注:x轴和y轴电机的最小增量步长均设置为0.15625 μm。因此,当 dy = 2 时,步长等于 0.15625 x 2 = 0.3125 μm,当 dx = 192 时,步长等于 0.15625 x 192 = 30 μm。要扫描5 x 5 mm2的整个区域,x轴电机将移动5000μm / 30μm = 167次,这意味着将拼接167个子图像以获得整个图像。有关UV-PAM系统的扫描轨迹,请参见 图2 。
- 将激光重复频率设置为55 kHz;将GM驱动器的 信号类型e设置为 三角形 ,将驱动电压 范围 设置为0.018 V(表示±0.018 V;比例因子:1 V / °)。将 GMnum 设置为22, 将dy 设置为2,以便在每22次激光触发后,GM完成四分之一的扫描周期,y轴电机移动0.3125μm的步长。将 dx 设置为192,以便当y轴电机达到预设位置(例如,5 mm)时,x轴电机移动30μm的步长。
- 通过设置 x 轴和 y 轴电机的移动步数(xn = 10 和 yn = 1000),在小区域开始试探扫描。调整z轴手动载物台,将样品放置在焦平面上,以获得最大的PA信号。
- 将x轴和y轴电机移动到所需的起点,通过设置 xn 和 yn 值设置扫描区域,然后启动图像采集程序(参见 材料表)。
- 图像采集后,关闭激光,取下样品架,并储存生物样品。
- 对于新鲜的生物组织,将样品储存在10%中性缓冲福尔马林中。
- 对于FFPE小鼠脑切片,按照参考文献20 中规定的方案用H&E染色,以获得相应的H&E染色图像。
- 使用收集的PA信号,通过实验室构建的图像处理算法重建最大振幅投影图像(参见 材料表)。
Representative Results
图1 所示为高速UV-PAM系统的原理图。在这种设置中,光学激发和超声检测路径位于样品的同一侧和下方,形成反射模式和开顶系统。因此,它易于使用,适用于厚样品成像。
图2 显示了UV-PAM系统在成像过程中的扫描轨迹。首先使用散射插值算法生成每个部分的子图像(例如,5 mm x 30 μm的面积),然后通过使用自定义图像处理算法拼接所有子图像来获得整个图像(例如,面积为5 mm x 5 mm)(参见 材料表)。
图3A和图3B分别显示了FFPE小鼠脑切片的UV-PAM和H&E图像,两者的视场面积为5 x 5 mm2。可以通过材料表中提供的链接从Github访问图像处理算法。图3C-F显示了图3A中标记区域的放大图像,其中单个细胞核可以清晰地分辨。更重要的是,可以在标准的H&E染色图像中找到相应的细胞核(图3G-J),显示了当前用于细胞成像的高精度系统。为了将灰度UV-PAM图像传输到虚拟H&E染色图像,应用了深度学习算法17(参见材料表),对于具有8000 x 8000像素的图像,这将花费不到30秒的时间。相应的放大图像如图3K-N所示。几乎染色的UV-PAM图像提供与H&E染色图像几乎相同的结构信息,显示出当前UV-PAM系统的临床转化的前景。
图 1: 高速开顶式 UV-PAM 系统的示意图。(A) 系统设置。(B)样品架和连接到两轴手动载物台的水箱的照片。(C)固定在水箱中的环形超声波换能器和覆盖样品架孔的样品罐的照片。(D)样品罐与膜和样品的照片,样品将放置在样品架上。紫外线: 紫外线;数据采集卡:数据采集卡;GM:振镜。 请点击此处查看此图的大图。
图 2:UV-PAM 系统在成像过程中的扫描轨迹。 请点击此处查看此图的大图。
图3:基于深度学习的虚拟染色UV-PAM成像的实验结果。(A)FFPE小鼠脑切片的UV-PAM图像。(B)同一切片的标准H&E染色图像。比例尺:1 毫米 (C-F) 放大的 A 标记区域的图像。(G-J)B中标记区域的相应H&E染色图像。(K-N)使用深度学习算法的相应虚拟染色图像。比例尺:50 μm。请点击此处查看此图的大图。
Discussion
综上所述,一种高速开顶UV-PAM系统已被证明可用于组织学成像。介绍了有关系统配置、光学对准、样品制备和实验程序的详细说明。可以通过材料表中提供的链接从Github访问图像采集程序。本系统的横向分辨率约为1.2μm,在最近的出版物21中进行了实验测量。对小鼠脑切片进行成像,以证明本系统可以在18分钟内获得面积为5 x 5 mm2的组织学图像,这是典型大小的脑活检22。虽然原始图像是灰度的,但在深度学习算法启用的数字虚拟染色工具的帮助下,目前的系统可以进一步提供近乎实时的虚拟染色图像,确保病理学家易于适应以解释图像。作为一种无标记图像技术,本UV-PAM系统还可以为未处理的新鲜组织样品提供组织学图像。更多的实例(包括冷冻切片和新鲜组织样品)已经在以前的出版物17中得到了证实。实验结果表明,目前深度学习辅助UV-PAM系统在SMA应用中具有较高的应用潜力。
UV-PAM系统的优点之一是该系统在反射模式下实现,能够对厚组织进行成像。此外,开顶UV-PAM系统允许将样品放置在扫描窗口(样品罐的膜)上,其操作与传统光学显微镜类似。因此,该系统比其它要求样品被两个膜11,14夹在中间的系统更加用户友好。此外,通过使用具有高重复率紫外激光器的1D GM,与使用多焦点激发23的系统相比,目前的UV-PAM系统可以实现高成像速度和更高的成本效益。
目前,成像速度主要受激光重复率和光子预算的限制。使用具有高重复率和高脉冲能量的激光器,可以进一步缩短成像时间。该系统的另一个局限性是,通过找到最大PA信号,样品只能粗略地调整到物镜的焦平面,而不是显示实时图像供用户可视化样品是否对焦。要显示近乎实时的图像,可以应用2D GM。
协议中有两个关键步骤:(a)应优化光学和声学焦点的共聚焦要求,以实现高检测灵敏度;(b)GM在x轴上的扫描范围应小于环形UT的声学焦点,以保持类似的高检测灵敏度(在当前设置中,扫描范围约为30μm±15μm)。否则,将多个子图像拼接在一起以获得整个图像时,边缘周围会出现明显的暗角效果。
Disclosures
T. T. W. W. 和 V. T. C. T. 在 PhoMedics Limited 拥有经济利益,但该公司并不支持这项工作。作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
作者感谢香港创新科技署的资助(ITS/036/19)。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Alcohol | Sigma Aldrich | PHR1373 | Sample dehydration |
Amplifier | Mini Circuit | ZFL-500LN-BNC+ | Ultrasonic signal amplification |
Controller | National Instruments | NI myRIO | System controller |
Data acquisition card | Alazar Technologies | ATS9350 | Ultrasonic signal collection |
Deep-learning algorithm | For transfering the grayscale UV-PAM image to a virtual H&E-stained image; https://github.com/TABLAB-HKUST/Deep-PAM | ||
Formalin | Sigma Aldrich | R04586 | Sample fixation |
H&E staining kit | Abcam | ab245880 | Sample staining |
Histo-Clear II | National Diagnostics | HS-202 | Sample deparaffinization |
Image acquisition program | National Instruments | LabVIEW | Lab-built program using LabVIEW; https://github.com/TABLAB-HKUST/LabVIEW-program-for-UV-PAM |
Image processing algorithm | Mathworks | MATLAB | Lab-built algorithm using MATLAB; https://github.com/TABLAB-HKUST/ImageRec_GM-UVPAM |
Kinematic platform mounts | Thorlabs | KM200B | Adjust the sample to be flat |
Membrane | Glad | Cling wrap | Sandwiched in sample tank |
Microscope objective lens | Thorlabs | LMU- 5X-NUV | Objective lens |
Motorized stages | Physik Instrumente | L-509.10SD00 | Scanning stages |
One-dimensional galvanometer mirror | Thorlabs | GVS411 | Fast scanning mirror |
Oscilloscope | RIGOL Technologies | DS1102E | Ultrasonic signal readout |
Phosphate-buffered saline | Sigma Aldrich | P3813 | Sample washing |
Pinhole | Edmund Optics | #59–257 | Spatial filtering |
Plano convex lens | Thorlabs | LA-4600-UV | Focusing lens |
Plano convex lens | Thorlabs | LA-4663-UV | Collimating lens |
Pulser/receiver | Imaginant | DPR300 | Pulse echo amplifier |
Q-switch diode-pumped solid-state laser | Bright Solutions | WEDGE HF 266 nm | 266-nm laser |
Ring-shaped ultrasonic transducer | University of Southern California | Ultrasonic signal detection | |
Sample holder | Lab-made | Hold the sample tank | |
Sample tank | Lab-made | Hold biological samples | |
Single-axis Z-translational stage | Thorlabs | PT1 | Manual stage |
Two-axis manual stage | Thorlabs | LX20 | Manual stage |
Water tank | Lab-made | Ultrasonic signal transmission | |
Xylene | Sigma Aldrich | XX0060 | Sample clearing |
References
- Kunos, C., et al. Breast conservation surgery achieving ≥ 2 mm tumor-free margins results in decreased local-regional recurrence rates. The Breast Journal. 12, 28-36 (2006).
- Rosai, J. Why microscopy will remain a cornerstone of surgical pathology. Laboratory Investigation. 87 (5), 403-408 (2007).
- Yang, J., Caprioli, R. M. Matrix sublimation/recrystallization for imaging proteins by mass spectrometry at high spatial resolution. Analytical Chemistry. 83 (14), 5728-5734 (2011).
- Jaafar, H. Intra-operative frozen section consultation: concepts, applications and limitations. The Malaysian Journal of Medical Sciences: MJMS. 13 (1), 4 (2006).
- Rastogi, V., et al. Artefacts: a diagnostic dilemma - a review. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 7 (10), 2408-2413 (2013).
- Carrasco-Zevallos, O. M., et al. Review of intraoperative optical coherence tomography: technology and applications [Invited]. Biomedical Optics Express. 8 (3), 1607 (2017).
- Gareau, D. S., Jeon, H., Nehal, K. S., Rajadhyaksha, M. Rapid screening of cancer margins in tissue with multimodal confocal microscopy. Journal of Surgical Research. 178 (2), 533-538 (2012).
- Fereidouni, F., et al. Microscopy with ultraviolet surface excitation for rapid slide-free histology. Nature Biomedical Engineering. 1 (12), 957-966 (2017).
- Tanaka, N., et al. Whole-tissue biopsy phenotyping of three-dimensional tumours reveals patterns of cancer heterogeneity. Nature Biomedical Engineering. 1 (10), 796-806 (2017).
- Jain, M., et al. Multiphoton microscopy: A potential intraoperative tool for the detection of carcinoma in situ in human bladder. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 139 (6), 796-804 (2015).
- Orringer, D. A., et al. Rapid intraoperative histology of unprocessed surgical specimens via fibre-laser-based stimulated Raman scattering microscopy. Nature Biomedical Engineering. 1 (2), 0027 (2017).
- Wong, T. T. W., et al. Fast label-free multilayered histology-like imaging of human breast cancer by photoacoustic microscopy. Science Advances. 3 (5), 1602168 (2017).
- Shen, C. -H. Detection and analysis of nucleic acids. Diagnostic Molecular Biology. , 167-185 (2019).
- Yao, J., Wang, L. V.
Photoacoustic microscopy. Laser & Photonics Reviews. 7 (5), 1-36 (2012). - Li, X., Kang, L., Zhang, Y., Wong, T. T. W. High-speed label-free ultraviolet photoacoustic microscopy for histology-like imaging of unprocessed biological tissues. Optics Letters. 45 (19), 5401 (2020).
- Baik, J. W., et al. Intraoperative label-free photoacoustic histopathology of clinical specimens. Laser & Photonics Reviews. 15 (10), 2100124 (2021).
- Kang, L., Li, X., Zhang, Y., Wong, T. T. W. Deep learning enables ultraviolet photoacoustic microscopy based histological imaging with near real-time virtual staining. Photoacoustics. 25, 100308 (2022).
- Sterile Tissue Harvest | Protocol. , Available from: https://www.jove.com/science-education/10298/sterile-tissue-harvest (2022).
- Steps to Tissue Processing for Histopathology. , Available from: https://www.liecabiosystems.com/knowledge-pathway/an-introduction-to-specimen-processing/ (2022).
- An Intro to H&E Staining: Protocol, Best Practices, Steps & More. , Available from: https://www.liecabiosystems.com/knowledge-pathway/he-staining-overview-a-guide-to-best-practices/ (2022).
- Li, X., et al. Ultraviolet photoacoustic microscopy with tissue clearing for high-contrast histological imaging. Photoacoustics. 25, 100313 (2022).
- Leinonen, V., et al. Assessment of β-amyloid in a frontal cortical brain biopsy specimen and by positron emission tomography with carbon 11-labeled pittsburgh compound B. Archives of Neurology. 65 (10), 1304-1309 (2008).
- Imai, T., et al. High-throughput ultraviolet photoacoustic microscopy with multifocal excitation. Journal of Biomedical Optics. 23 (03), (2018).