Et høyhastighets og åpen ultrafiolett fotoakustisk mikroskop som kan gi histologiske bilder intraoperativt for kirurgisk marginanalyse, demonstreres, inkludert systemkonfigurasjon, optisk justering, prøvepreparering og eksperimentelle prosedyrer.
Kirurgisk marginanalyse (SMA), en viktig prosedyre for å bekrefte fullstendig eksisjon av kreftvev i tumorreseksjonskirurgi, krever intraoperative diagnostiske verktøy for å unngå gjentatte operasjoner på grunn av en positiv kirurgisk margin. Nylig, ved å dra nytte av den høye indre optiske absorpsjonen av DNA / RNA ved 266 nm bølgelengde, er ultrafiolett fotoakustisk mikroskopi (UV-PAM) utviklet for å gi høyoppløselige histologiske bilder uten merking, og viser stort løfte som et intraoperativt verktøy for SMA. For å muliggjøre utviklingen av UV-PAM for SMA, her presenteres et høyhastighets og åpent UV-PAM-system, som kan betjenes på samme måte som konvensjonelle optiske mikroskoper. UV-PAM-systemet gir en høy lateral oppløsning på 1,2 μm, og en høy bildehastighet på 55 kHz A-linjehastighet med enakset galvanometerspeilskanning. Videre, for å sikre at UV-PAM-bilder lett kan tolkes av patologer uten ekstra opplæring, blir de originale gråtone UV-PAM-bildene nesten farget av en dyplæringsalgoritme for å etterligne standard hematoksylin- og eosinfargede bilder, noe som muliggjør treningsfri histologisk analyse. Mushjerneskiveavbildning utføres for å demonstrere den høye ytelsen til UV-PAM-systemet med åpen topp, noe som illustrerer det store potensialet for SMA-applikasjoner.
Kirurgisk marginanalyse (SMA), som krever en undersøkelse av vevsprøver under et mikroskop, er en viktig prosedyre for å avgjøre om alle kreftceller fjernes fra pasientens kropp i en reseksjonsoperasjon1. Derfor er et mikroskop som raskt kan gi histologiske bilder, viktig for SMA å unngå gjentatte operasjoner forårsaket av ufullstendig fjerning av kreftceller. I henhold til den nåværende gullstandardmetoden basert på optisk mikroskopi med lyse felt, må imidlertid det utskilte vevet festes i formalin, innebygd i parafin, seksjoneres i tynne skiver (4-7 μm), og deretter farges av hematoksylin og eosin (H&E) før avbildning, som er tidkrevende (3-7 dager) og arbeidskrevende 2,3 . En frossen seksjon er et raskt alternativ for SMA ved raskt å fryse, kutte og fargelegge vevet, som kan gi histologiske bilder i 20-30 min4. Imidlertid er de histologiske egenskapene ofte forvrengt og krevde dyktig trening, noe som hindrer teknikkens anvendbarhet til flere typer organer5.
Optiske mikroskopiteknikker som kan gi cellulære bilder uten eller med noen få trinn i vevsbehandling er utviklet for SMA. Imidlertid lider hver av dem av forskjellige problemer. For eksempel lider optisk koherenstomografi6 og konfokal refleksmikroskopi7 av lav spesifisitet på grunn av deres lave iboende spredningskontrast. Selv om mikroskopi med ultrafiolett overflateeksitasjon8 og lysarkmikroskopi9 kan gi bilder med høy oppløsning og høy kontrast for SMA, kan den giftige og flyktige fargingsprosedyren vanligvis ikke utføres i et operasjonsrom, noe som forlenger behandlingstiden. Multi-foton mikroskopi10 og stimulert Raman mikroskopi11 kan gi rik informasjon for SMA. Likevel forhindrer den høye prisen på de nødvendige ultraraske laserne som brukes til å generere ikke-lineære effekter, deres brede anvendbarhet.
Nylig, ved å dra nytte av innebygd optisk absorpsjon, er etikettfri ultrafiolett fotoakustisk mikroskopi (UV-PAM) utviklet for å gi høyoppløselige histologiske bilder12. I UV-PAM absorberes fotonenergien til eksitasjons-UV-lyset (f.eks. 266 nm) først av DNA/RNA i cellekjerner13 og omdannes deretter til varme, noe som induserer akustisk bølgeutslipp gjennom termisk elastisk ekspansjon14. Ved å oppdage de genererte akustiske bølgene kan todimensjonale (2D) UV-PAM-bilder av cellekjerner oppnås via maksimal amplitudeprojeksjon av de akustiske signalene, og gir histologisk informasjon for SMA. For å muliggjøre kliniske anvendelser av UV-PAM, er høyhastighets UV-PAM basert på galvanometerspeilskanning utviklet for å gi histologiske bilder for en hjernebiopsiprøve (5 mm x 5 mm) innen 18 minutter, og viser stort potensial i tidssensitive applikasjoner15. For ytterligere å validere muligheten for UV-PAM for tykk vevsavbildning, ble det foreslått et UV-PAM-system i refleksjonsmodus med en vanntett enakses mikroelektromekanisk systemskanner, som med hell demonstrerer intraoperativ histopatologisk undersøkelse av humant kolon og levervev16. Siden det opprinnelige UV-PAM-bildet er i gråtoner mens gullstandarden H&E-farget bilde er i rosa og lilla farger, er det vanskelig for patologer å tolke UV-PAM-bilder direkte. For å løse dette problemet ble det foreslått en dyplæringsalgoritme for å overføre UV-PAM-bilder i gråtoner til virtuelle H&E-fargede bilder i nær sanntid, slik at patologer kan forstå bildene uten ytterligere opplæring17.
Dette arbeidet rapporterer et høyhastighets og åpent UV-PAM-system som kan betjenes på samme måte som konvensjonelle optiske mikroskopier, og gir både originale gråtone histologiske bilder og praktisk talt fargede bilder assistert av en dyplæringsalgoritme. En formalin-fast og parafin-innebygd (FFPE) musehjerneskive er avbildet av UV-PAM-systemet for å demonstrere likheten mellom vår nesten fargede UV-PAM og standard H&E-fargede bilder, som viser potensialet for SMA-applikasjoner.
Oppsummert har et høyhastighets og åpent UV-PAM-system blitt demonstrert for histologisk avbildning. De detaljerte instruksjonene om systemkonfigurasjon, optisk justering, prøveforberedelse og eksperimentelle prosedyrer presenteres. Bildeanskaffelsesprogrammet kan nås fra Github via lenken i materialfortegnelsen. Den laterale oppløsningen av det nåværende systemet er ~ 1,2 μm som har blitt eksperimentelt målt i en nylig publikasjon21. En musehjerneskive ble avbildet for å demonstrere at det nåværende systemet kan få et histologisk bilde innen 18 minutter for et område på 5 x 5 mm2, som er en typisk størrelse på hjernebiopsi22. Selv om det opprinnelige bildet er i gråtoner, ved hjelp av et digitalt virtuelt fargeverktøy aktivert av en dyplæringsalgoritme, kan det nåværende systemet ytterligere gi praktisk talt fargede bilder i nær sanntid, noe som sikrer enkel tilpasning for patologer å tolke bildene. Som en etikettfri bildeteknikk kan det nåværende UV-PAM-systemet også gi histologiske bilder for ubehandlede ferske vevsprøver. Flere eksempler (inkludert frosne seksjonerte og ferske vevsprøver) er vist i en tidligere publikasjon17. De eksperimentelle resultatene viser det høye potensialet i det nåværende dyplæringsassisterte UV-PAM-systemet i SMA-applikasjoner.
En av fordelene med UV-PAM-systemet er at systemet er implementert i refleksjonsmodus, noe som muliggjør avbildning av tykt vev. Dessuten gjør UV-PAM-systemet med åpen topp at prøven kan plasseres på skannevinduet (membranen til prøvetanken), som har en lignende operasjon som tradisjonelle optiske mikroskoper. Derfor er dette systemet mer brukervennlig enn andre systemer som krever at prøver smøres av to membraner11,14. Videre, ved å bruke en 1D GM med en UV-laser med høy repetisjonshastighet, kan det nåværende UV-PAM-systemet oppnå høy bildehastighet med høyere kostnadseffektivitet sammenlignet med systemet ved hjelp av multifokal eksitasjon23.
For tiden er bildehastigheten hovedsakelig begrenset av repetisjonshastigheten til laser- og fotonbudsjettet. Med en laser som har høy repetisjonshastighet og høy pulsenergi, kan bildetiden forkortes ytterligere. En annen begrensning i systemet er at prøven bare kan justeres grovt til fokusplanet til objektivet ved å finne de maksimale PA-signalene, i stedet for å vise et sanntidsbilde for brukere å visualisere om prøven er i fokus. For å vise et bilde i nær sanntid kan 2D GM brukes.
Det er to kritiske trinn i protokollen: (a) det konfokale kravet til den optiske og akustiske foci bør optimaliseres for å oppnå høy deteksjonsfølsomhet; (b) skanneområdet til GM på x-aksen skal være mindre enn det akustiske brennpunktet til den ringformede UT for å opprettholde lignende høy deteksjonsfølsomhet (i det nåværende oppsettet er skanneområdet ~ 30 μm ±15 μm). Ellers vil åpenbare vignetteringseffekter rundt kantene oppstå når flere underbilder er sydd sammen for å få et helt bilde.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å anerkjenne den økonomiske støtten fra Hong Kong Innovation and Technology Commission (ITS/036/19).
Alcohol | Sigma Aldrich | PHR1373 | Sample dehydration |
Amplifier | Mini Circuit | ZFL-500LN-BNC+ | Ultrasonic signal amplification |
Controller | National Instruments | NI myRIO | System controller |
Data acquisition card | Alazar Technologies | ATS9350 | Ultrasonic signal collection |
Deep-learning algorithm | For transfering the grayscale UV-PAM image to a virtual H&E-stained image; https://github.com/TABLAB-HKUST/Deep-PAM | ||
Formalin | Sigma Aldrich | R04586 | Sample fixation |
H&E staining kit | Abcam | ab245880 | Sample staining |
Histo-Clear II | National Diagnostics | HS-202 | Sample deparaffinization |
Image acquisition program | National Instruments | LabVIEW | Lab-built program using LabVIEW; https://github.com/TABLAB-HKUST/LabVIEW-program-for-UV-PAM |
Image processing algorithm | Mathworks | MATLAB | Lab-built algorithm using MATLAB; https://github.com/TABLAB-HKUST/ImageRec_GM-UVPAM |
Kinematic platform mounts | Thorlabs | KM200B | Adjust the sample to be flat |
Membrane | Glad | Cling wrap | Sandwiched in sample tank |
Microscope objective lens | Thorlabs | LMU- 5X-NUV | Objective lens |
Motorized stages | Physik Instrumente | L-509.10SD00 | Scanning stages |
One-dimensional galvanometer mirror | Thorlabs | GVS411 | Fast scanning mirror |
Oscilloscope | RIGOL Technologies | DS1102E | Ultrasonic signal readout |
Phosphate-buffered saline | Sigma Aldrich | P3813 | Sample washing |
Pinhole | Edmund Optics | #59–257 | Spatial filtering |
Plano convex lens | Thorlabs | LA-4600-UV | Focusing lens |
Plano convex lens | Thorlabs | LA-4663-UV | Collimating lens |
Pulser/receiver | Imaginant | DPR300 | Pulse echo amplifier |
Q-switch diode-pumped solid-state laser | Bright Solutions | WEDGE HF 266 nm | 266-nm laser |
Ring-shaped ultrasonic transducer | University of Southern California | Ultrasonic signal detection | |
Sample holder | Lab-made | Hold the sample tank | |
Sample tank | Lab-made | Hold biological samples | |
Single-axis Z-translational stage | Thorlabs | PT1 | Manual stage |
Two-axis manual stage | Thorlabs | LX20 | Manual stage |
Water tank | Lab-made | Ultrasonic signal transmission | |
Xylene | Sigma Aldrich | XX0060 | Sample clearing |