Summary

Høyhastighets ultrafiolett fotoakustisk mikroskopi for histologisk avbildning med virtuell farging assistert av dyp læring

Published: April 28, 2022
doi:

Summary

Et høyhastighets og åpen ultrafiolett fotoakustisk mikroskop som kan gi histologiske bilder intraoperativt for kirurgisk marginanalyse, demonstreres, inkludert systemkonfigurasjon, optisk justering, prøvepreparering og eksperimentelle prosedyrer.

Abstract

Kirurgisk marginanalyse (SMA), en viktig prosedyre for å bekrefte fullstendig eksisjon av kreftvev i tumorreseksjonskirurgi, krever intraoperative diagnostiske verktøy for å unngå gjentatte operasjoner på grunn av en positiv kirurgisk margin. Nylig, ved å dra nytte av den høye indre optiske absorpsjonen av DNA / RNA ved 266 nm bølgelengde, er ultrafiolett fotoakustisk mikroskopi (UV-PAM) utviklet for å gi høyoppløselige histologiske bilder uten merking, og viser stort løfte som et intraoperativt verktøy for SMA. For å muliggjøre utviklingen av UV-PAM for SMA, her presenteres et høyhastighets og åpent UV-PAM-system, som kan betjenes på samme måte som konvensjonelle optiske mikroskoper. UV-PAM-systemet gir en høy lateral oppløsning på 1,2 μm, og en høy bildehastighet på 55 kHz A-linjehastighet med enakset galvanometerspeilskanning. Videre, for å sikre at UV-PAM-bilder lett kan tolkes av patologer uten ekstra opplæring, blir de originale gråtone UV-PAM-bildene nesten farget av en dyplæringsalgoritme for å etterligne standard hematoksylin- og eosinfargede bilder, noe som muliggjør treningsfri histologisk analyse. Mushjerneskiveavbildning utføres for å demonstrere den høye ytelsen til UV-PAM-systemet med åpen topp, noe som illustrerer det store potensialet for SMA-applikasjoner.

Introduction

Kirurgisk marginanalyse (SMA), som krever en undersøkelse av vevsprøver under et mikroskop, er en viktig prosedyre for å avgjøre om alle kreftceller fjernes fra pasientens kropp i en reseksjonsoperasjon1. Derfor er et mikroskop som raskt kan gi histologiske bilder, viktig for SMA å unngå gjentatte operasjoner forårsaket av ufullstendig fjerning av kreftceller. I henhold til den nåværende gullstandardmetoden basert på optisk mikroskopi med lyse felt, må imidlertid det utskilte vevet festes i formalin, innebygd i parafin, seksjoneres i tynne skiver (4-7 μm), og deretter farges av hematoksylin og eosin (H&E) før avbildning, som er tidkrevende (3-7 dager) og arbeidskrevende 2,3 . En frossen seksjon er et raskt alternativ for SMA ved raskt å fryse, kutte og fargelegge vevet, som kan gi histologiske bilder i 20-30 min4. Imidlertid er de histologiske egenskapene ofte forvrengt og krevde dyktig trening, noe som hindrer teknikkens anvendbarhet til flere typer organer5.

Optiske mikroskopiteknikker som kan gi cellulære bilder uten eller med noen få trinn i vevsbehandling er utviklet for SMA. Imidlertid lider hver av dem av forskjellige problemer. For eksempel lider optisk koherenstomografi6 og konfokal refleksmikroskopi7 av lav spesifisitet på grunn av deres lave iboende spredningskontrast. Selv om mikroskopi med ultrafiolett overflateeksitasjon8 og lysarkmikroskopi9 kan gi bilder med høy oppløsning og høy kontrast for SMA, kan den giftige og flyktige fargingsprosedyren vanligvis ikke utføres i et operasjonsrom, noe som forlenger behandlingstiden. Multi-foton mikroskopi10 og stimulert Raman mikroskopi11 kan gi rik informasjon for SMA. Likevel forhindrer den høye prisen på de nødvendige ultraraske laserne som brukes til å generere ikke-lineære effekter, deres brede anvendbarhet.

Nylig, ved å dra nytte av innebygd optisk absorpsjon, er etikettfri ultrafiolett fotoakustisk mikroskopi (UV-PAM) utviklet for å gi høyoppløselige histologiske bilder12. I UV-PAM absorberes fotonenergien til eksitasjons-UV-lyset (f.eks. 266 nm) først av DNA/RNA i cellekjerner13 og omdannes deretter til varme, noe som induserer akustisk bølgeutslipp gjennom termisk elastisk ekspansjon14. Ved å oppdage de genererte akustiske bølgene kan todimensjonale (2D) UV-PAM-bilder av cellekjerner oppnås via maksimal amplitudeprojeksjon av de akustiske signalene, og gir histologisk informasjon for SMA. For å muliggjøre kliniske anvendelser av UV-PAM, er høyhastighets UV-PAM basert på galvanometerspeilskanning utviklet for å gi histologiske bilder for en hjernebiopsiprøve (5 mm x 5 mm) innen 18 minutter, og viser stort potensial i tidssensitive applikasjoner15. For ytterligere å validere muligheten for UV-PAM for tykk vevsavbildning, ble det foreslått et UV-PAM-system i refleksjonsmodus med en vanntett enakses mikroelektromekanisk systemskanner, som med hell demonstrerer intraoperativ histopatologisk undersøkelse av humant kolon og levervev16. Siden det opprinnelige UV-PAM-bildet er i gråtoner mens gullstandarden H&E-farget bilde er i rosa og lilla farger, er det vanskelig for patologer å tolke UV-PAM-bilder direkte. For å løse dette problemet ble det foreslått en dyplæringsalgoritme for å overføre UV-PAM-bilder i gråtoner til virtuelle H&E-fargede bilder i nær sanntid, slik at patologer kan forstå bildene uten ytterligere opplæring17.

Dette arbeidet rapporterer et høyhastighets og åpent UV-PAM-system som kan betjenes på samme måte som konvensjonelle optiske mikroskopier, og gir både originale gråtone histologiske bilder og praktisk talt fargede bilder assistert av en dyplæringsalgoritme. En formalin-fast og parafin-innebygd (FFPE) musehjerneskive er avbildet av UV-PAM-systemet for å demonstrere likheten mellom vår nesten fargede UV-PAM og standard H&E-fargede bilder, som viser potensialet for SMA-applikasjoner.

Protocol

Alle dyreforsøk utført i dette arbeidet er godkjent av Animal Ethics Committee ved The Hong Kong University of Science and Technology. 1. UV-PAM-system med åpen topp (figur 1) Optisk belysning Bruk en Q-bryterdiodepumpet solid state-laser (266 nm bølgelengde) som eksitasjonskilde. Bruk to konvekse linser for å utvide laserstrålen og plasser et hull nær fokuspunktet til det første konvekse objektivet for å utføre romlig filtrering. Reflekter laserstrålen oppover ved hjelp av et 1D-galvanisometerspeil (1D GM). Bruk en objektiv linse for å fokusere laserstrålen og passere gjennom midten av en ringformet ultralydtransduser (UT) før du er tett fokusert på en prøve. Ultralyd deteksjon Bruk en ringformet fokusert UT for å oppdage ultralydbølger. De indre og ytre diameterene i UT-aktive området er henholdsvis 3 mm og 6 mm. Brennvidde: 6,3 mm; senterfrekvens: 40 MHz; -6 dB båndbredde: 84%. Fest UT i en lab-laget vanntank med et optisk gjennomsiktig vindu nederst, dekket av en tynn kvartsdekslelip for å la UV-lys passere gjennom. Påse at det aktive området på UT vender oppover. Fest vanntanken til et manuelt trinn med to akser for å kontrollere utens laterale posisjon. Slå på UV-laseren, juster posisjonen til UT slik at laserstrålen kan passere gjennom fra midten av UT. Slå av UV-laseren. Fyll deretter vanntanken med deionisert vann for å senke UT helt ned. Koble utdataene fra UT til to forsterkere (total gevinst = 56 dB) og koble utgangen til den andre forsterkeren til et datainnsamlingskort (DAQ). Fest en prøveholder til et manuelt trinn på z-aksen som er koblet til xy-motoriserte stadier. Prøveholderen har et tomt hull som gjør at UV-lyset kan passere gjennom. Fest fire stykker dobbeltsidig tape rundt hullet. Systemjustering Fest svart tape til en glasssklie og plasser glasssklie for å dekke hullet på prøveholderen, med den svarte tapen vendt nedover. Trykk på glasssklie for å sikre at den er festet på prøveholderen. Senk deretter prøveholderen for å senke glasset i vannet. Koble fra den ringformede UT-en og forsterkerne, koble UT til pulseren/mottakeren, og koble utgangen til pulseren/mottakeren til et oscilloskop. Bruk pulsøren/mottakeren i Puls-Echo-modus. Sett pulsamplituden og forsterkningen til pulsøren/mottakeren til henholdsvis 6 og 20 dB. Aktiver pulsøren/mottakeren og juster z-posisjonen til prøveholderen for å finne posisjonen til det akustiske brennviddeplanet der ultralydsignalene er maksimale. Endre pulseren/mottakeren til overføringsmodus og sett forsterkningen til 60 dB. Aktiver laserutgangen. Juster z-posisjonen til objektivet for å maksimere PA-signalene som måles av oscilloskopet. Juster sideposisjonen til den ringformede UT for å gjøre det genererte PA-signalet symmetrisk og maksimum, noe som representerer at den optiske og akustiske focien er kulljustert i sideplanet. Juster deretter z-posisjonen til prøveholderen for å maksimere PA-signalene. Gjenta trinn 1.4.3 og 1.4.4 for å optimalisere både symmetrien og amplituden til PA-signalene. Registrer tidsforsinkelsen (dvs. tiden det tar for PA-bølgene å nå UT) på oscilloskopet når PA-signalene er optimalisert. Flytt prøveholderen til bildets forskjellige posisjoner på det svarte båndet. Juster prøveholderens flathet slik at PA-signalene som genereres fra hver posisjon på det svarte båndet, har samme tidsforsinkelse som den som ble målt i trinn 1.4.5. Slå av laseren og koble UT til de to forsterkerne. 2. Prøvepreparering FFPE-mus hjerneskive Ofre en mus med en overdose anestesi. Deretter høster du musehjernen etter protokollen beskrevet i referanse18. Fest den høstede hjernen i 10% nøytral bufret formalin i 24 timer. Behandle den faste hjernen ved dehydrering med gradert alkohol, rydding med xylen og innebygging med parafin som beskrevet i referanse19.MERK: Behandle prøven i en avtrekkshette. Skjær den innebygde hjernen i tynne skiver (5 μm i tykkelse) ved hjelp av en mikrotom. Plasser prøvestykkene på kvartslysbilder. Tørk skliene i en ovn ved 60 °C i 1 time. Deparaffiner seksjonene ved hjelp av et avregningsmiddel (se Materialtabell), som fjerner parafinen for å unngå høye bakgrunnssignaler, da parafin absorberer sterkt med UV-eksitasjon.MERK: Behandle prøven i en avtrekkshette. Fersk mus hjerneskive Ofre en mus med en overdose anestesi. Deretter høster du musehjernen etter protokollen som er angitt i referanse18. Vask musehjernen med fosfatbufret saltvann (PBS) for å fjerne blodet. Klipp en skive av hjerneprøven (~ 5 mm tykk) for hånd, og vask deretter prøven med PBS for å fjerne blodet på tverrsnittet. 3. Eksperimentelle prosedyrer Eksempel på plassering Forbered en lab-laget prøvetank med en UV-gjennomsiktig membran (polyetylen, ∼10 μm i tykkelse). Tilsett en dråpe vann til membranen og legg deretter den biologiske prøven på prøvetanken for å dekke vannet. Når det gjelder FFPE-skiveprøven, bruk tape for å fikse glasssklie på membranen. Plasser prøvetanken på prøveholderen, og pass på å dekke det tomme hullet på prøveholderen. Sett UV-laseren i ekstern utløsermodus. Bruk vårt labbygde LabVIEW-program (se Materialfortegnelser), og angi skanneparametrene som følger. Sett laserrepetisjonshastigheten til 55 kHz; sett signalet påGM-driveren til trekantet og kjørespenningsområdet til 0,018 V (representerer ±0,018 V; skaleringsfaktor: 1 V/°). Sett GMnum til 22 og dy til 2 slik at etter hver 22 laserutløsere fullfører GM en fjerdedel av skanneperioden, og y-aksemotoren beveger seg en trinnstørrelse på 0,3125 μm. Sett dx til 192 slik at når y-aksemotoren når den forhåndsinnstilte posisjonen (f.eks. 5 mm), beveger x-aksemotoren seg en trinnstørrelse på 30 μm.MERK: Den minste trinnvise trinnstørrelsen er satt til 0,15625 μm for både x- og y-aksemotorene. Når dy = 2, er derfor trinnstørrelsen lik 0,15625 x 2 = 0,3125 μm, og når dx = 192, er trinnstørrelsen lik 0,15625 x 192 = 30 μm. For å skanne hele området på 5 x 5 mm2, vil x-aksemotoren bevege seg 5000 μm / 30 μm = 167 ganger, noe som betyr at 167 underbilder vil bli sydd for å få et helt bilde. Se figur 2 for skanningsbanen til UV-PAM-systemet. Start prøveskanning på et lite område ved å angi antall bevegelige trinn for x- og y-aksemotorene (xn = 10 og yn = 1000). Juster z-aksens manuelle stadium for å plassere prøven på fokusplanet for å oppnå maksimale PA-signaler. Flytt både x- og y-aksemotorer til ønsket utgangspunkt, still inn skanneområdet ved å angi xn – og yn-verdiene , og start deretter bildeanskaffelsesprogrammet (se Materialtabell). Etter bildeanskaffelsen slår du av laseren, fjerner prøveholderen og lagrer de biologiske prøvene. Oppbevar prøvene i 10 % nøytralt bufret formalin for ferskt biologisk vev. For FFPE-musens hjerneskiver, flekk med H&E etter protokollen som er angitt i referanse20 for å få de tilsvarende H&E-fargede bildene. Bruk de innsamlede PA-signalene til å rekonstruere det maksimale amplitudeprojeksjonsbildet ved hjelp av en lab-bygget bildebehandlingsalgoritme (se Tabell over materialer).

Representative Results

Figur 1 viser skjematisk for høyhastighets UV-PAM-systemet. I dette oppsettet er de optiske eksitasjons- og ultralyddeteksjonsbanene på samme side og under prøven, og danner en reflekterende modus og åpent system. Dermed er det brukervennlig og egnet for avbildning av tykke prøver. Figur 2 viser skannebanen til UV-PAM-systemet under avbildning. Underbilde av hver seksjon (f.eks. areal på 5 mm x 30 μm) genereres først ved hjelp av en spredt interpoleringsalgoritme, og deretter oppnås et helt bilde (f.eks. areal på 5 mm x 5 mm) ved å sy sammen alle underbildene ved hjelp av tilpasset bildebehandlingsalgoritme (se Tabell over materialer). Figur 3A og figur 3B viser UV-PAM- og H&E-bildene av en FFPE-musehjerneskive, som begge har et synsfelt på henholdsvis 5 x 5 mm2. Bildebehandlingsalgoritmen kan nås fra Github via lenken i materialtabellen. Bildeinnhentingstiden var mindre enn 18 min. Figur 3C-F viser de zoomede bildene av de merkede områdene i figur 3A, der de enkelte cellekjernene tydelig kan løses. Enda viktigere er at de tilsvarende cellekjernene finnes i standard H&E-fargede bilder (figur 3G-J), som viser den høye nøyaktigheten til det nåværende systemet for cellulær avbildning. For å overføre UV-PAM-bildet i gråtoner til et virtuelt H&E-farget bilde, ble det brukt en dyplæringsalgoritme17 (se Materialfortegnelse), som ville ta mindre enn 30 s for et bilde med 8000 x 8000 piksler. De tilsvarende innzoomede bildene vises i figur 3K-N. De nesten fargede UV-PAM-bildene gir nesten samme strukturelle informasjon som H&E-fargede bilder, og viser løfter om klinisk oversettelse av det nåværende UV-PAM-systemet. Figur 1: Skjematisk for uv-PAM-systemet med høy hastighet og åpen topp. (A) Systemoppsettet. (B) Fotografi av prøveholderen og en vanntank som er festet til et toakset manuelt trinn. (C) Fotografi av den ringformede ultralydtransduseren festet i vanntanken og prøvetanken som dekker hullet på prøveholderen. (D) Fotografi av prøvetanken med membranen og prøven som skulle plasseres på prøveholderen. UV: Ultrafiolett; DAQ: Dataanskaffelseskort; GM: Galvanometer speil. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 2: Skannebanen til UV-PAM-systemet under avbildning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 3: Eksperimentelle resultater av UV-PAM-avbildning med dyp læringsbasert virtuell farging. (A) UV-PAM bilde av en FFPE mus hjerneskive. (B) Standard H&E-farget bilde av samme stykke. Skalalinjer: 1 mm. (C-F) Zoomed-in bilder av de merkede områdene i A. (G-J) Tilsvarende H&E-fargede bilder av de merkede områdene i B. (K-N) Tilsvarende nesten fargede bilder ved hjelp av en dyplæringsalgoritme. Skalastenger: 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Oppsummert har et høyhastighets og åpent UV-PAM-system blitt demonstrert for histologisk avbildning. De detaljerte instruksjonene om systemkonfigurasjon, optisk justering, prøveforberedelse og eksperimentelle prosedyrer presenteres. Bildeanskaffelsesprogrammet kan nås fra Github via lenken i materialfortegnelsen. Den laterale oppløsningen av det nåværende systemet er ~ 1,2 μm som har blitt eksperimentelt målt i en nylig publikasjon21. En musehjerneskive ble avbildet for å demonstrere at det nåværende systemet kan få et histologisk bilde innen 18 minutter for et område på 5 x 5 mm2, som er en typisk størrelse på hjernebiopsi22. Selv om det opprinnelige bildet er i gråtoner, ved hjelp av et digitalt virtuelt fargeverktøy aktivert av en dyplæringsalgoritme, kan det nåværende systemet ytterligere gi praktisk talt fargede bilder i nær sanntid, noe som sikrer enkel tilpasning for patologer å tolke bildene. Som en etikettfri bildeteknikk kan det nåværende UV-PAM-systemet også gi histologiske bilder for ubehandlede ferske vevsprøver. Flere eksempler (inkludert frosne seksjonerte og ferske vevsprøver) er vist i en tidligere publikasjon17. De eksperimentelle resultatene viser det høye potensialet i det nåværende dyplæringsassisterte UV-PAM-systemet i SMA-applikasjoner.

En av fordelene med UV-PAM-systemet er at systemet er implementert i refleksjonsmodus, noe som muliggjør avbildning av tykt vev. Dessuten gjør UV-PAM-systemet med åpen topp at prøven kan plasseres på skannevinduet (membranen til prøvetanken), som har en lignende operasjon som tradisjonelle optiske mikroskoper. Derfor er dette systemet mer brukervennlig enn andre systemer som krever at prøver smøres av to membraner11,14. Videre, ved å bruke en 1D GM med en UV-laser med høy repetisjonshastighet, kan det nåværende UV-PAM-systemet oppnå høy bildehastighet med høyere kostnadseffektivitet sammenlignet med systemet ved hjelp av multifokal eksitasjon23.

For tiden er bildehastigheten hovedsakelig begrenset av repetisjonshastigheten til laser- og fotonbudsjettet. Med en laser som har høy repetisjonshastighet og høy pulsenergi, kan bildetiden forkortes ytterligere. En annen begrensning i systemet er at prøven bare kan justeres grovt til fokusplanet til objektivet ved å finne de maksimale PA-signalene, i stedet for å vise et sanntidsbilde for brukere å visualisere om prøven er i fokus. For å vise et bilde i nær sanntid kan 2D GM brukes.

Det er to kritiske trinn i protokollen: (a) det konfokale kravet til den optiske og akustiske foci bør optimaliseres for å oppnå høy deteksjonsfølsomhet; (b) skanneområdet til GM på x-aksen skal være mindre enn det akustiske brennpunktet til den ringformede UT for å opprettholde lignende høy deteksjonsfølsomhet (i det nåværende oppsettet er skanneområdet ~ 30 μm ±15 μm). Ellers vil åpenbare vignetteringseffekter rundt kantene oppstå når flere underbilder er sydd sammen for å få et helt bilde.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne ønsker å anerkjenne den økonomiske støtten fra Hong Kong Innovation and Technology Commission (ITS/036/19).

Materials

Alcohol Sigma Aldrich PHR1373 Sample dehydration
Amplifier Mini Circuit ZFL-500LN-BNC+ Ultrasonic signal amplification
Controller National Instruments NI myRIO System controller
Data acquisition card Alazar Technologies ATS9350 Ultrasonic signal collection
Deep-learning algorithm For transfering the grayscale UV-PAM image to a virtual H&E-stained image; https://github.com/TABLAB-HKUST/Deep-PAM
Formalin Sigma Aldrich R04586 Sample fixation
H&E staining kit Abcam ab245880 Sample staining
Histo-Clear II National Diagnostics HS-202 Sample deparaffinization
Image acquisition program National Instruments LabVIEW Lab-built program using LabVIEW; https://github.com/TABLAB-HKUST/LabVIEW-program-for-UV-PAM
Image processing algorithm Mathworks MATLAB Lab-built algorithm using MATLAB; https://github.com/TABLAB-HKUST/ImageRec_GM-UVPAM
Kinematic platform mounts Thorlabs KM200B Adjust the sample to be flat
Membrane Glad Cling wrap Sandwiched in sample tank
Microscope objective lens Thorlabs LMU- 5X-NUV Objective lens
Motorized stages Physik Instrumente L-509.10SD00 Scanning stages
One-dimensional galvanometer mirror Thorlabs GVS411 Fast scanning mirror
Oscilloscope RIGOL Technologies DS1102E Ultrasonic signal readout
Phosphate-buffered saline Sigma Aldrich P3813 Sample washing
Pinhole Edmund Optics #59–257 Spatial filtering
Plano convex lens Thorlabs LA-4600-UV Focusing lens
Plano convex lens Thorlabs LA-4663-UV Collimating lens
Pulser/receiver Imaginant DPR300 Pulse echo amplifier
Q-switch diode-pumped solid-state laser Bright Solutions WEDGE HF 266 nm 266-nm laser
Ring-shaped ultrasonic transducer University of Southern California Ultrasonic signal detection
Sample holder Lab-made Hold the sample tank
Sample tank Lab-made Hold biological samples
Single-axis Z-translational stage Thorlabs PT1 Manual stage
Two-axis manual stage Thorlabs LX20 Manual stage
Water tank Lab-made Ultrasonic signal transmission
Xylene Sigma Aldrich XX0060 Sample clearing

References

  1. Kunos, C., et al. Breast conservation surgery achieving ≥ 2 mm tumor-free margins results in decreased local-regional recurrence rates. The Breast Journal. 12, 28-36 (2006).
  2. Rosai, J. Why microscopy will remain a cornerstone of surgical pathology. Laboratory Investigation. 87 (5), 403-408 (2007).
  3. Yang, J., Caprioli, R. M. Matrix sublimation/recrystallization for imaging proteins by mass spectrometry at high spatial resolution. Analytical Chemistry. 83 (14), 5728-5734 (2011).
  4. Jaafar, H. Intra-operative frozen section consultation: concepts, applications and limitations. The Malaysian Journal of Medical Sciences: MJMS. 13 (1), 4 (2006).
  5. Rastogi, V., et al. Artefacts: a diagnostic dilemma – a review. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 7 (10), 2408-2413 (2013).
  6. Carrasco-Zevallos, O. M., et al. Review of intraoperative optical coherence tomography: technology and applications [Invited]. Biomedical Optics Express. 8 (3), 1607 (2017).
  7. Gareau, D. S., Jeon, H., Nehal, K. S., Rajadhyaksha, M. Rapid screening of cancer margins in tissue with multimodal confocal microscopy. Journal of Surgical Research. 178 (2), 533-538 (2012).
  8. Fereidouni, F., et al. Microscopy with ultraviolet surface excitation for rapid slide-free histology. Nature Biomedical Engineering. 1 (12), 957-966 (2017).
  9. Tanaka, N., et al. Whole-tissue biopsy phenotyping of three-dimensional tumours reveals patterns of cancer heterogeneity. Nature Biomedical Engineering. 1 (10), 796-806 (2017).
  10. Jain, M., et al. Multiphoton microscopy: A potential intraoperative tool for the detection of carcinoma in situ in human bladder. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 139 (6), 796-804 (2015).
  11. Orringer, D. A., et al. Rapid intraoperative histology of unprocessed surgical specimens via fibre-laser-based stimulated Raman scattering microscopy. Nature Biomedical Engineering. 1 (2), 0027 (2017).
  12. Wong, T. T. W., et al. Fast label-free multilayered histology-like imaging of human breast cancer by photoacoustic microscopy. Science Advances. 3 (5), 1602168 (2017).
  13. Shen, C. -. H. Detection and analysis of nucleic acids. Diagnostic Molecular Biology. , 167-185 (2019).
  14. Yao, J., Wang, L. V. Photoacoustic microscopy. Laser & Photonics Reviews. 7 (5), 1-36 (2012).
  15. Li, X., Kang, L., Zhang, Y., Wong, T. T. W. High-speed label-free ultraviolet photoacoustic microscopy for histology-like imaging of unprocessed biological tissues. Optics Letters. 45 (19), 5401 (2020).
  16. Baik, J. W., et al. Intraoperative label-free photoacoustic histopathology of clinical specimens. Laser & Photonics Reviews. 15 (10), 2100124 (2021).
  17. Kang, L., Li, X., Zhang, Y., Wong, T. T. W. Deep learning enables ultraviolet photoacoustic microscopy based histological imaging with near real-time virtual staining. Photoacoustics. 25, 100308 (2022).
  18. . Sterile Tissue Harvest | Protocol Available from: https://www.jove.com/science-education/10298/sterile-tissue-harvest (2022)
  19. . Steps to Tissue Processing for Histopathology Available from: https://www.liecabiosystems.com/knowledge-pathway/an-introduction-to-specimen-processing/ (2022)
  20. . An Intro to H&E Staining: Protocol, Best Practices, Steps & More Available from: https://www.liecabiosystems.com/knowledge-pathway/he-staining-overview-a-guide-to-best-practices/ (2022)
  21. Li, X., et al. Ultraviolet photoacoustic microscopy with tissue clearing for high-contrast histological imaging. Photoacoustics. 25, 100313 (2022).
  22. Leinonen, V., et al. Assessment of β-amyloid in a frontal cortical brain biopsy specimen and by positron emission tomography with carbon 11-labeled pittsburgh compound B. Archives of Neurology. 65 (10), 1304-1309 (2008).
  23. Imai, T., et al. High-throughput ultraviolet photoacoustic microscopy with multifocal excitation. Journal of Biomedical Optics. 23 (03), (2018).

Play Video

Cite This Article
Li, X., Kang, L., Lo, C. T. K., Tsang, V. T. C., Wong, T. T. W. High-Speed Ultraviolet Photoacoustic Microscopy for Histological Imaging with Virtual-Staining assisted by Deep Learning. J. Vis. Exp. (182), e63649, doi:10.3791/63649 (2022).

View Video