Summary
يتم عرض مجهر صوتي فوق بنفسجي عالي السرعة ومفتوح السطح يمكنه توفير صور نسيجية أثناء العملية الجراحية لتحليل الهامش الجراحي ، بما في ذلك تكوين النظام والمحاذاة البصرية وإعداد العينات والإجراءات التجريبية.
Abstract
يتطلب تحليل الهامش الجراحي (SMA) ، وهو إجراء أساسي لتأكيد الاستئصال الكامل للأنسجة السرطانية في جراحة استئصال الورم ، أدوات تشخيصية أثناء الجراحة لتجنب العمليات الجراحية المتكررة بسبب الهامش الجراحي الإيجابي. في الآونة الأخيرة ، من خلال الاستفادة من الامتصاص البصري الجوهري العالي للحمض النووي / الحمض النووي الريبي عند الطول الموجي 266 نانومتر ، تم تطوير المجهر الضوئي الصوتي فوق البنفسجي (UV-PAM) لتوفير صور نسيجية عالية الدقة دون وضع علامات ، مما يدل على وعد كبير كأداة أثناء الجراحة ل SMA. لتمكين تطوير UV-PAM ل SMA ، هنا ، يتم تقديم نظام UV-PAM عالي السرعة ومفتوح السطح ، والذي يمكن تشغيله بشكل مشابه للمجهر الضوئي التقليدي. يوفر نظام UV-PAM دقة جانبية عالية تبلغ 1.2 ميكرومتر ، وسرعة تصوير عالية تبلغ 55 كيلو هرتز معدل A-line مع مسح مرآة الجلفانومتر أحادي المحور. علاوة على ذلك، لضمان إمكانية تفسير صور UV-PAM بسهولة من قبل علماء الأمراض دون تدريب إضافي، فإن صور UV-PAM الأصلية ذات التدرج الرمادي ملطخة تقريبا بواسطة خوارزمية التعلم العميق لمحاكاة الصور القياسية الملطخة بالهيماتوكسيلين والإيوزين، مما يتيح التحليل النسيجي الخالي من التدريب. يتم إجراء تصوير شريحة دماغ الماوس لإظهار الأداء العالي لنظام UV-PAM المفتوح ، مما يوضح إمكاناته الكبيرة لتطبيقات SMA.
Introduction
يعد تحليل الهامش الجراحي (SMA) ، الذي يتطلب فحص عينات الأنسجة تحت المجهر ، إجراء أساسيا لتحديد ما إذا كانت جميع الخلايا السرطانية تتم إزالتها من جسم المريض في جراحة الاستئصال1. لذلك ، فإن المجهر الذي يمكن أن يوفر صورا نسيجية بسرعة أمر بالغ الأهمية ل SMA لتجنب العمليات الجراحية المتكررة الناجمة عن الإزالة غير المكتملة للخلايا السرطانية. ومع ذلك ، وفقا للطريقة الحالية القياسية الذهبية القائمة على الفحص المجهري البصري الساطع المجال ، يلزم تثبيت الأنسجة المستأصلة في الفورمالين ، وتضمينها في البارافين ، وتقسيمها إلى شرائح رقيقة (4-7 ميكرومتر) ، ثم تلطيخها بالهيماتوكسيلين والإيوسين (H & E) قبل التصوير ، وهو أمر يستغرق وقتا طويلا (3-7 أيام) وشاقا 2,3 . القسم المجمد هو بديل سريع ل SMA عن طريق تجميد الأنسجة وتقطيعها وتلطيخها بسرعة ، والتي يمكن أن توفر صورا نسيجية في 20-30 دقيقة4. ومع ذلك ، غالبا ما تكون السمات النسيجية مشوهة وتتطلب تدريبا ماهرا ، مما يعوق تطبيق التقنية على أنواع متعددة من الأعضاء5.
تم تطوير تقنيات الفحص المجهري الضوئي التي يمكن أن توفر صورا خلوية بدون أو مع بضع خطوات من معالجة الأنسجة من أجل SMA. ومع ذلك ، كل واحد منهم يعاني من قضايا مختلفة. على سبيل المثال ، يعاني التصوير المقطعي للتماسك البصري6 والفحص المجهري للانعكاس البؤري7 من خصوصية منخفضة بسبب تباين التشتت الجوهري المنخفض. على الرغم من أن الفحص المجهري مع إثارة السطح فوق البنفسجي8 والمجهر ذو الورقة الضوئية9 يمكن أن يوفر صورا عالية الدقة وعالية التباين ل SMA ، إلا أنه لا يمكن عادة إجراء إجراء التلطيخ السام والمتطاير في غرفة العمليات ، مما يطيل وقت التحول. يمكن أن يوفر المجهر متعدد الفوتونات10 ومجهر رامان11 المحفز معلومات غنية ل SMA. ومع ذلك ، فإن التكلفة العالية لأشعة الليزر فائقة السرعة المطلوبة التي تستخدم لتوليد تأثيرات غير خطية تمنع تطبيقها على نطاق واسع.
في الآونة الأخيرة ، من خلال الاستفادة من الامتصاص البصري الجوهري ، تم تطوير المجهر الضوئي الصوتي فوق البنفسجي الخالي من الملصقات (UV-PAM) لتوفير صور نسيجية عالية الدقة12. في UV-PAM ، يتم امتصاص طاقة الفوتون لضوء الأشعة فوق البنفسجية المثير (على سبيل المثال ، 266 نانومتر) أولا بواسطة الحمض النووي / الحمض النووي الريبي في نوى الخلية13 ثم يتم تحويلها إلى حرارة ، مما يؤدي إلى انبعاث موجة صوتية من خلال التوسع الحراري المرن14. من خلال الكشف عن الموجات الصوتية المتولدة ، يمكن الحصول على صور UV-PAM ثنائية الأبعاد (2D) لنوى الخلايا عن طريق إسقاط أقصى سعة للإشارات الصوتية ، مما يوفر معلومات نسيجية ل SMA. لتمكين التطبيقات السريرية للأشعة فوق البنفسجية PAM ، تم تطوير UV-PAM عالي السرعة يعتمد على مسح مرآة الجلفانومتر لتوفير صور نسيجية لعينة خزعة الدماغ (5 مم × 5 مم) في غضون 18 دقيقة ، مما يدل على إمكانات كبيرة في التطبيقات الحساسة للوقت15. لمزيد من التحقق من إمكانية الأشعة فوق البنفسجية PAM لتصوير الأنسجة السميكة ، تم اقتراح نظام UV-PAM في وضع الانعكاس مع ماسح ضوئي للأنظمة الكهروميكانيكية الدقيقة أحادية المحور للماء ، مما يدل بنجاح على الفحص النسيجي المرضي أثناء العملية الجراحية لأنسجة القولون والكبد البشرية16. نظرا لأن صورة UV-PAM الأصلية باللون الرمادي بينما تكون الصورة الملونة H&E القياسية الذهبية باللونين الوردي والأرجواني ، فمن الصعب على علماء الأمراض تفسير صور UV-PAM مباشرة. لمعالجة هذه المشكلة ، تم اقتراح خوارزمية التعلم العميق لنقل صور UV-PAM ذات التدرج الرمادي إلى صور افتراضية ملطخة ب H & E في الوقت الفعلي تقريبا حتى يتمكن علماء الأمراض من فهم الصور دون أي تدريب إضافي17.
يبلغ هذا العمل عن نظام UV-PAM عالي السرعة ومفتوح السطح يمكن تشغيله على غرار المجهر الضوئي التقليدي ، مما يوفر صورا نسيجية رمادية أصلية وصورا ملطخة تقريبا بمساعدة خوارزمية التعلم العميق. يتم تصوير شريحة دماغ الماوس الثابتة بالفورمالين والبارافين (FFPE) بواسطة نظام UV-PAM لإظهار التشابه بين الأشعة فوق البنفسجية الملطخة تقريبا والصور القياسية الملطخة ب H & E ، مما يدل على إمكاناتها لتطبيقات SMA.
Protocol
تتم الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات التي أجريت في هذا العمل من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان في جامعة هونغ كونغ للعلوم والتكنولوجيا.
1. نظام الأشعة فوق البنفسجية PAM مفتوح (الشكل 1)
- إضاءة بصرية
- استخدم ليزر الحالة الصلبة الذي يتم ضخه بواسطة الصمام الثنائي Q-switch (الطول الموجي 266 نانومتر) كمصدر للإثارة.
- استخدم عدستين محدبتين لتوسيع شعاع الليزر ووضع ثقب بالقرب من النقطة البؤرية للعدسة المحدبة الأولى لإجراء التصفية المكانية.
- عكس شعاع الليزر لأعلى باستخدام مرآة الجلفانومتر 1D (1D GM).
- استخدم عدسة موضوعية لتركيز شعاع الليزر والمرور عبر مركز محول الموجات فوق الصوتية على شكل حلقة (UT) قبل التركيز بإحكام على العينة.
- الكشف بالموجات فوق الصوتية
- استخدم UT مركزا على شكل حلقة للكشف عن الموجات فوق الصوتية. الأقطار الداخلية والخارجية للمنطقة النشطة UT هي 3 مم و 6 مم ، على التوالي. البعد البؤري: 6.3 مم ؛ تردد المركز: 40 ميغاهيرتز ؛ -6 ديسيبل عرض النطاق الترددي: 84٪.
- قم بتثبيت UT في خزان مياه مصنوع في المختبر مع نافذة شفافة بصريا في الأسفل ، مغطاة بغطاء من الكوارتز الرقيق للسماح بمرور الأشعة فوق البنفسجية. تأكد من أن المنطقة النشطة من UT متجهة لأعلى. قم بتوصيل خزان المياه بمرحلة يدوية ذات محورين للتحكم في الموضع الجانبي ل UT.
- قم بتشغيل ليزر الأشعة فوق البنفسجية ، واضبط موضع UT للسماح لشعاع الليزر بالمرور من وسط UT. أوقف تشغيل الليزر فوق البنفسجي. ثم املأ خزان المياه بالماء منزوع الأيونات لغمر UT بالكامل.
- قم بتوصيل خرج UT بمضخمين (إجمالي الكسب = 56 ديسيبل) وقم بتوصيل إخراج مكبر الصوت الثاني ببطاقة الحصول على البيانات (DAQ).
- قم بتوصيل حامل عينة بمرحلة يدوية ذات محور z متصلة بمراحل xy-motorized. يحتوي حامل العينة على ثقب فارغ يسمح بمرور ضوء الأشعة فوق البنفسجية. قم بإرفاق أربع قطع من الشريط على الوجهين المحيط بالحفرة.
- محاذاة النظام
- قم بتوصيل شريط أسود بشريحة زجاجية وضع الشريحة الزجاجية لتغطية ثقب حامل العينة ، مع توجيه الشريط الأسود لأسفل. اضغط على الشريحة الزجاجية للتأكد من تثبيتها على حامل العينة. ثم ، اخفض حامل العينة لغمر الانزلاق الزجاجي في الماء.
- افصل UT على شكل حلقة ومكبرات الصوت ، وقم بتوصيل UT بالنبض / المستقبل ، وقم بتوصيل إخراج النبض / المستقبل بمنظار الذبذبات. قم بتشغيل النبض/جهاز الاستقبال في وضع Pulse-Echo. اضبط سعة النبض وكسب النبض / المستقبل على 6 و 20 ديسيبل ، على التوالي.
- قم بتمكين النبض / المستقبل واضبط موضع z لحامل العينة للعثور على موضع المستوى البؤري الصوتي حيث تكون الإشارات بالموجات فوق الصوتية هي الحد الأقصى.
- قم بتغيير النبض / جهاز الاستقبال إلى وضع الإرسال واضبط الكسب على 60 ديسيبل. تمكين إخراج الليزر. اضبط موضع z للعدسة الموضوعية لزيادة إشارات PA التي يتم قياسها بواسطة منظار الذبذبات.
- اضبط الموضع الجانبي ل UT على شكل حلقة لجعل إشارة PA المتولدة متماثلة وقصوى ، مما يمثل أن البؤر البصرية والصوتية محاذاة في المستوى الجانبي. ثم اضبط موضع z لحامل العينة لزيادة إشارات PA إلى أقصى حد.
- كرر الخطوتين 1.4.3 و1.4.4 لتحسين كل من تناظر وسعة إشارات PA. سجل التأخير الزمني (أي الوقت الذي تستغرقه موجات PA للوصول إلى UT) على منظار الذبذبات عند تحسين إشارات PA.
- حرك حامل العينة لتصوير مواضع مختلفة من الشريط الأسود. اضبط تسطيح حامل العينة بحيث يكون لإشارات PA المتولدة من كل موضع من الشريط الأسود نفس التأخير الزمني الذي تم قياسه في الخطوة 1.4.5.
- قم بإيقاف تشغيل الليزر وتوصيل UT بمضخمي الصوت.
2. إعداد العينات
- FFPE شريحة دماغ الماوس
- التضحية بفأر بجرعة زائدة من التخدير. ثم ، حصاد دماغ الماوس باتباع البروتوكول الموصوف في المرجع18.
- إصلاح الدماغ المحصود في الفورمالين المخزن مؤقتا محايد بنسبة 10٪ لمدة 24 ساعة.
- معالجة الدماغ الثابت عن طريق الجفاف مع الكحول المتدرج ، وإزالة مع الزيلين ، وتضمين مع البارافين كما هو موضح في المرجع19.
ملاحظة: قم بمعالجة العينة في غطاء الدخان. - قم بتقطيع الدماغ المضمن إلى شرائح رقيقة (بسماكة 5 ميكرومتر) باستخدام ميكروتوم. ضع شرائح العينة على شرائح الكوارتز. جفف الشرائح في فرن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- قم بإزالة البارافين من الأقسام باستخدام عامل إزالة (انظر جدول المواد) ، والذي يزيل البارافين لتجنب إشارات الخلفية العالية لأن البارافين يمتص بدرجة عالية مع إثارة الأشعة فوق البنفسجية.
ملاحظة: قم بمعالجة العينة في غطاء الدخان.
- شريحة دماغ الفأر الطازج
- التضحية بفأر بجرعة زائدة من التخدير. ثم ، حصاد دماغ الفأر باتباع البروتوكول المذكور في المرجع18.
- اغسل دماغ الفأر بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لإزالة الدم.
- قطع شريحة من عينة الدماغ (~ 5 مم) باليد ، ثم اغسل العينة باستخدام PBS لإزالة الدم على المقطع العرضي.
3. الإجراءات التجريبية
- موضع العينة
- قم بإعداد خزان عينات مصنوع في المختبر بغشاء شفاف للأشعة فوق البنفسجية (البولي إيثيلين ، ∼10 ميكرومتر في السمك). أضف قطرة ماء إلى الغشاء ثم ضع العينة البيولوجية على خزان العينة لتغطية الماء. في حالة عينة شريحة FFPE ، استخدم الشريط لإصلاح الشريحة الزجاجية على الغشاء.
- ضع خزان العينة المحتوي على العينة على حامل العينة، مع ضمان تغطية الثقب الفارغ لحامل العينة.
- اضبط ليزر الأشعة فوق البنفسجية على وضع الزناد الخارجي. باستخدام برنامج LabVIEW المصمم في المختبر (انظر جدول المواد)، قم بتعيين معلمات المسح الضوئي على النحو التالي.
- اضبط معدل تكرار الليزر على 55 كيلو هرتز ؛ اضبط نوع الإشارةe لبرنامج تشغيل جنرال موتورز على الثلاثي ونطاق جهد القيادة على 0.018 فولت (يمثل ±0.018 فولت؛ عامل المقياس: 1 فولت/°). اضبط GMnum على 22 و dy على 2 بحيث بعد كل 22 مشغل ليزر ، ينهي GM ربع فترة المسح الضوئي ، ويتحرك محرك المحور y بحجم خطوة 0.3125 ميكرومتر. اضبط dx على 192 بحيث عندما يصل محرك المحور y إلى الموضع المحدد مسبقا (على سبيل المثال ، 5 مم) ، يتحرك محرك المحور x بحجم خطوة 30 ميكرومتر.
ملاحظة: يتم تعيين أصغر حجم خطوة تزايدي ليكون 0.15625 ميكرومتر لكل من محركات المحورين x وy. لذلك ، عندما يكون dy = 2 ، فإن حجم الخطوة يساوي 0.15625 × 2 = 0.3125 ميكرومتر ، وعندما يكون dx = 192 ، فإن حجم الخطوة يساوي 0.15625 × 192 = 30 ميكرومتر. لمسح كامل مساحة 5 × 5 مم2 ، سيتحرك محرك المحور x 5000 ميكرومتر / 30 ميكرومتر = 167 مرة ، مما يعني أنه سيتم خياطة 167 صورة فرعية للحصول على صورة كاملة. انظر الشكل 2 للاطلاع على مسار المسح الضوئي لنظام UV-PAM.
- اضبط معدل تكرار الليزر على 55 كيلو هرتز ؛ اضبط نوع الإشارةe لبرنامج تشغيل جنرال موتورز على الثلاثي ونطاق جهد القيادة على 0.018 فولت (يمثل ±0.018 فولت؛ عامل المقياس: 1 فولت/°). اضبط GMnum على 22 و dy على 2 بحيث بعد كل 22 مشغل ليزر ، ينهي GM ربع فترة المسح الضوئي ، ويتحرك محرك المحور y بحجم خطوة 0.3125 ميكرومتر. اضبط dx على 192 بحيث عندما يصل محرك المحور y إلى الموضع المحدد مسبقا (على سبيل المثال ، 5 مم) ، يتحرك محرك المحور x بحجم خطوة 30 ميكرومتر.
- ابدأ المسح التجريبي على منطقة صغيرة عن طريق تعيين عدد الخطوات المتحركة لمحركات المحورين x وy (xn = 10 و yn = 1000). اضبط المرحلة اليدوية للمحور z لوضع العينة على المستوى البؤري للحصول على أقصى قدر من إشارات PA.
- انقل كل من محركات المحورين x وy إلى نقطة البداية المطلوبة، واضبط منطقة المسح الضوئي عن طريق تعيين قيمتي xn وyn، ثم ابدأ تشغيل برنامج الحصول على الصور (راجع جدول المواد).
- بعد الحصول على الصورة ، قم بإيقاف تشغيل الليزر ، وإزالة حامل العينة ، وتخزين العينات البيولوجية.
- بالنسبة للأنسجة البيولوجية الطازجة ، قم بتخزين العينات في الفورمالين المخزن مؤقتا بنسبة 10٪.
- بالنسبة لشرائح دماغ الماوس FFPE ، قم بالبقع باستخدام H & E باتباع البروتوكول المذكور في المرجع20 للحصول على الصور الملطخة ب H & E.
- استخدم إشارات PA التي تم جمعها لإعادة بناء صورة إسقاط الحد الأقصى للسعة باستخدام خوارزمية معالجة الصور التي تم إنشاؤها في المختبر (انظر جدول المواد).
Representative Results
يوضح الشكل 1 مخطط نظام UV-PAM عالي السرعة. في هذا الإعداد ، تكون مسارات الإثارة البصرية والكشف بالموجات فوق الصوتية على نفس الجانب وأسفل العينة ، مما يشكل وضعا عاكسا ونظاما مفتوحا. وبالتالي ، فهي سهلة الاستخدام ومناسبة لتصوير العينات السميكة.
يوضح الشكل 2 مسار المسح الضوئي لنظام UV-PAM أثناء التصوير. يتم إنشاء صورة فرعية لكل قسم (على سبيل المثال ، مساحة 5 مم × 30 ميكرومتر) أولا باستخدام خوارزمية استيفاء متناثرة ، ثم يتم الحصول على صورة كاملة (على سبيل المثال ، مساحة 5 مم × 5 مم) عن طريق خياطة جميع الصور الفرعية باستخدام خوارزمية معالجة الصور المخصصة (انظر جدول المواد).
يوضح الشكل 3A والشكل 3B صور UV-PAM و H & E لشريحة دماغ فأر FFPE ، على التوالي ، وكلاهما له مجال رؤية 5 × 5 مم2. يمكن الوصول إلى خوارزمية معالجة الصور من Github عبر الرابط الموجود في جدول المواد. كان وقت الحصول على الصورة أقل من 18 دقيقة، ويوضح الشكل 3C-F الصور المكبرة للمناطق المحددة في الشكل 3A، حيث يمكن حل نوى الخلايا الفردية بوضوح. الأهم من ذلك ، يمكن العثور على نوى الخلايا المقابلة في الصور القياسية الملطخة ب H & E (الشكل 3G-J) ، مما يدل على الدقة العالية للنظام الحالي للتصوير الخلوي. لنقل صورة UV-PAM ذات التدرج الرمادي إلى صورة افتراضية ملطخة ب H & E ، تم تطبيق خوارزمية التعلم العميق17 (انظر جدول المواد) ، والتي ستستغرق أقل من 30 ثانية لصورة ذات 8000 × 8000 بكسل. تظهر الصور المكبرة المقابلة في الشكل 3K-N. توفر صور UV-PAM الملطخة تقريبا نفس المعلومات الهيكلية تقريبا مثل الصور الملطخة ب H & E ، مما يدل على وعد بالترجمة السريرية لنظام UV-PAM الحالي.
الشكل 1: مخطط نظام الأشعة فوق البنفسجية PAM عالي السرعة والمفتوح السطح. (أ) إعداد النظام. (ب) صورة فوتوغرافية لحامل العينة وخزان مياه متصل بمرحلة يدوية ذات محورين. (ج) صورة فوتوغرافية لمحول الموجات فوق الصوتية على شكل حلقة مثبت في خزان المياه وخزان العينة الذي يغطي ثقب حامل العينة. (د) صورة فوتوغرافية لخزان العينة مع الغشاء والعينة التي سيتم وضعها على حامل العينة. الأشعة فوق البنفسجية: الأشعة فوق البنفسجية. DAQ: بطاقة الحصول على البيانات; جنرال موتورز: مرآة الجلفانومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مسار المسح الضوئي لنظام UV-PAM أثناء التصوير. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: النتائج التجريبية للتصوير بالأشعة فوق البنفسجية - PAM مع تلطيخ افتراضي قائم على التعلم العميق. (أ) صورة UV-PAM لشريحة دماغ فأر FFPE. (B) صورة قياسية ملطخة ب H & E لنفس الشريحة. أشرطة المقياس: 1 مم (C-F) صور مكبرة للمناطق المحددة في A. (G-J) الصور المقابلة الملطخة ب H & E للمناطق المحددة في B. (K-N) مطابقة الصور الملطخة تقريبا باستخدام خوارزمية التعلم العميق. أشرطة المقياس: 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
باختصار ، تم إثبات نظام UV-PAM عالي السرعة ومفتوح السطح للتصوير النسيجي. يتم تقديم التعليمات التفصيلية حول تكوين النظام والمحاذاة البصرية وإعداد العينات والإجراءات التجريبية. يمكن الوصول إلى برنامج الحصول على الصور من Github عبر الرابط الموجود في جدول المواد. تبلغ الدقة الجانبية للنظام الحالي حوالي 1.2 ميكرومتر والتي تم قياسها تجريبيا في منشور حديث21. تم تصوير شريحة دماغ الفأر لإثبات أن النظام الحالي يمكنه الحصول على صورة نسيجية في غضون 18 دقيقة لمنطقة 5 × 5 مم2 ، وهو حجم نموذجي لخزعة الدماغ22. على الرغم من أن الصورة الأصلية بتدرج رمادي ، بمساعدة أداة تلطيخ افتراضية رقمية ممكنة بواسطة خوارزمية التعلم العميق ، يمكن للنظام الحالي توفير صور ملطخة تقريبا في الوقت الفعلي تقريبا ، مما يضمن سهولة التكيف مع علماء الأمراض لتفسير الصور. كتقنية صور خالية من الملصقات ، يمكن لنظام UV-PAM الحالي أيضا توفير صور نسيجية لعينات الأنسجة الطازجة غير المعالجة. تم عرض المزيد من الأمثلة (بما في ذلك عينات الأنسجة المجمدة والطازجة) في منشور سابق17. تظهر النتائج التجريبية الإمكانات العالية لنظام UV-PAM الحالي بمساعدة التعلم العميق في تطبيقات SMA.
واحدة من مزايا نظام UV-PAM هو أن النظام يتم تنفيذه في وضع الانعكاس ، مما يتيح تصوير الأنسجة السميكة. إلى جانب ذلك ، يسمح نظام UV-PAM المفتوح بوضع العينة على نافذة المسح الضوئي (غشاء خزان العينة) ، والتي لها عملية مماثلة للمجهر الضوئي التقليدي. لذلك ، فإن هذا النظام أكثر سهولة في الاستخدام من الأنظمة الأخرى التي تتطلب أن تكون العينات محصورة بغشاءين11,14. علاوة على ذلك ، باستخدام 1D GM مع ليزر الأشعة فوق البنفسجية عالي معدل التكرار ، يمكن لنظام UV-PAM الحالي تحقيق سرعة تصوير عالية مع فعالية أعلى من حيث التكلفة عند مقارنته بالنظام باستخدام الإثارة متعددة البؤر23.
حاليا ، سرعة التصوير محدودة بشكل رئيسي بمعدل تكرار ميزانية الليزر والفوتون. مع الليزر الذي يحتوي على معدل تكرار مرتفع وطاقة نبض عالية ، يمكن تقصير وقت التصوير بشكل أكبر. هناك قيد آخر للنظام وهو أنه لا يمكن ضبط العينة تقريبا إلا على المستوى البؤري للعدسة الموضوعية من خلال إيجاد الحد الأقصى لإشارات PA ، بدلا من عرض صورة في الوقت الفعلي للمستخدمين لتصور ما إذا كانت العينة في بؤرة التركيز. لعرض صورة في الوقت الفعلي تقريبا ، يمكن تطبيق 2D GM.
وهناك خطوتان حاسمتان في البروتوكول: (أ) ينبغي تحسين المتطلبات البؤرية للبؤر البصرية والصوتية إلى أقصى حد ممكن لتحقيق حساسية عالية للكشف؛ (ب) ينبغي تحسين الاحتياجات البؤرية للبؤر البصرية والصوتية إلى الحد الأمثل لتحقيق حساسية عالية للكشف؛ (ب) ينبغي تحسين الاحتياجات البؤرية للبؤر البصرية والصوتية إلى الحد الأمثل لتحقيق حساسية عالية للكشف؛ (ب) ينبغي تحسين الاحتياجات البؤرية للبؤر البصرية والصوتية إلى الحد الأمثل لتحقيق حساسية عالية للكشف (ب) ينبغي أن يكون نطاق المسح الضوئي للآلية العالمية على المحور x أصغر من النقطة البؤرية الصوتية ل UT على شكل حلقة للحفاظ على حساسية كشف عالية مماثلة (في الإعداد الحالي ، يكون نطاق المسح ~ 30 ميكرومتر ±15 ميكرومتر). خلاف ذلك ، ستحدث تأثيرات التظليل الواضحة حول الحواف عندما يتم خياطة صور فرعية متعددة معا للحصول على صورة كاملة.
Disclosures
T. T. W. W. و V. T. C. T. لديهما مصلحة مالية في PhoMedics Limited ، والتي ، مع ذلك ، لم تدعم هذا العمل. ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ويود المؤلفان أن ينوه بالدعم المالي المقدم من لجنة هونغ كونغ للابتكار والتكنولوجيا (ITS/036/19).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol | Sigma Aldrich | PHR1373 | Sample dehydration |
| Amplifier | Mini Circuit | ZFL-500LN-BNC+ | Ultrasonic signal amplification |
| Controller | National Instruments | NI myRIO | System controller |
| Data acquisition card | Alazar Technologies | ATS9350 | Ultrasonic signal collection |
| Deep-learning algorithm | For transfering the grayscale UV-PAM image to a virtual H&E-stained image; https://github.com/TABLAB-HKUST/Deep-PAM | ||
| Formalin | Sigma Aldrich | R04586 | Sample fixation |
| H&E staining kit | Abcam | ab245880 | Sample staining |
| Histo-Clear II | National Diagnostics | HS-202 | Sample deparaffinization |
| Image acquisition program | National Instruments | LabVIEW | Lab-built program using LabVIEW; https://github.com/TABLAB-HKUST/LabVIEW-program-for-UV-PAM |
| Image processing algorithm | Mathworks | MATLAB | Lab-built algorithm using MATLAB; https://github.com/TABLAB-HKUST/ImageRec_GM-UVPAM |
| Kinematic platform mounts | Thorlabs | KM200B | Adjust the sample to be flat |
| Membrane | Glad | Cling wrap | Sandwiched in sample tank |
| Microscope objective lens | Thorlabs | LMU- 5X-NUV | Objective lens |
| Motorized stages | Physik Instrumente | L-509.10SD00 | Scanning stages |
| One-dimensional galvanometer mirror | Thorlabs | GVS411 | Fast scanning mirror |
| Oscilloscope | RIGOL Technologies | DS1102E | Ultrasonic signal readout |
| Phosphate-buffered saline | Sigma Aldrich | P3813 | Sample washing |
| Pinhole | Edmund Optics | #59–257 | Spatial filtering |
| Plano convex lens | Thorlabs | LA-4600-UV | Focusing lens |
| Plano convex lens | Thorlabs | LA-4663-UV | Collimating lens |
| Pulser/receiver | Imaginant | DPR300 | Pulse echo amplifier |
| Q-switch diode-pumped solid-state laser | Bright Solutions | WEDGE HF 266 nm | 266-nm laser |
| Ring-shaped ultrasonic transducer | University of Southern California | Ultrasonic signal detection | |
| Sample holder | Lab-made | Hold the sample tank | |
| Sample tank | Lab-made | Hold biological samples | |
| Single-axis Z-translational stage | Thorlabs | PT1 | Manual stage |
| Two-axis manual stage | Thorlabs | LX20 | Manual stage |
| Water tank | Lab-made | Ultrasonic signal transmission | |
| Xylene | Sigma Aldrich | XX0060 | Sample clearing |
References
- Kunos, C., et al. Breast conservation surgery achieving ≥ 2 mm tumor-free margins results in decreased local-regional recurrence rates. The Breast Journal. 12, 28-36 (2006).
- Rosai, J. Why microscopy will remain a cornerstone of surgical pathology. Laboratory Investigation. 87 (5), 403-408 (2007).
- Yang, J., Caprioli, R. M. Matrix sublimation/recrystallization for imaging proteins by mass spectrometry at high spatial resolution. Analytical Chemistry. 83 (14), 5728-5734 (2011).
- Jaafar, H. Intra-operative frozen section consultation: concepts, applications and limitations. The Malaysian Journal of Medical Sciences: MJMS. 13 (1), 4 (2006).
- Rastogi, V., et al. Artefacts: a diagnostic dilemma - a review. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 7 (10), 2408-2413 (2013).
- Carrasco-Zevallos, O. M., et al. Review of intraoperative optical coherence tomography: technology and applications [Invited]. Biomedical Optics Express. 8 (3), 1607 (2017).
- Gareau, D. S., Jeon, H., Nehal, K. S., Rajadhyaksha, M. Rapid screening of cancer margins in tissue with multimodal confocal microscopy. Journal of Surgical Research. 178 (2), 533-538 (2012).
- Fereidouni, F., et al. Microscopy with ultraviolet surface excitation for rapid slide-free histology. Nature Biomedical Engineering. 1 (12), 957-966 (2017).
- Tanaka, N., et al. Whole-tissue biopsy phenotyping of three-dimensional tumours reveals patterns of cancer heterogeneity. Nature Biomedical Engineering. 1 (10), 796-806 (2017).
- Jain, M., et al. Multiphoton microscopy: A potential intraoperative tool for the detection of carcinoma in situ in human bladder. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 139 (6), 796-804 (2015).
- Orringer, D. A., et al. Rapid intraoperative histology of unprocessed surgical specimens via fibre-laser-based stimulated Raman scattering microscopy. Nature Biomedical Engineering. 1 (2), 0027 (2017).
- Wong, T. T. W., et al. Fast label-free multilayered histology-like imaging of human breast cancer by photoacoustic microscopy. Science Advances. 3 (5), 1602168 (2017).
- Shen, C. -H. Detection and analysis of nucleic acids. Diagnostic Molecular Biology. , 167-185 (2019).
- Yao, J., Wang, L. V.
- Li, X., Kang, L., Zhang, Y., Wong, T. T. W. High-speed label-free ultraviolet photoacoustic microscopy for histology-like imaging of unprocessed biological tissues. Optics Letters. 45 (19), 5401 (2020).
- Baik, J. W., et al. Intraoperative label-free photoacoustic histopathology of clinical specimens. Laser & Photonics Reviews. 15 (10), 2100124 (2021).
- Kang, L., Li, X., Zhang, Y., Wong, T. T. W. Deep learning enables ultraviolet photoacoustic microscopy based histological imaging with near real-time virtual staining. Photoacoustics. 25, 100308 (2022).
- Sterile Tissue Harvest | Protocol. , Available from: https://www.jove.com/science-education/10298/sterile-tissue-harvest (2022).
- Steps to Tissue Processing for Histopathology. , Available from: https://www.liecabiosystems.com/knowledge-pathway/an-introduction-to-specimen-processing/ (2022).
- An Intro to H&E Staining: Protocol, Best Practices, Steps & More. , Available from: https://www.liecabiosystems.com/knowledge-pathway/he-staining-overview-a-guide-to-best-practices/ (2022).
- Li, X., et al. Ultraviolet photoacoustic microscopy with tissue clearing for high-contrast histological imaging. Photoacoustics. 25, 100313 (2022).
- Leinonen, V., et al. Assessment of β-amyloid in a frontal cortical brain biopsy specimen and by positron emission tomography with carbon 11-labeled pittsburgh compound B. Archives of Neurology. 65 (10), 1304-1309 (2008).
- Imai, T., et al. High-throughput ultraviolet photoacoustic microscopy with multifocal excitation. Journal of Biomedical Optics. 23 (03), (2018).
