Summary
Ett höghastighets och öppet ultraviolett fotoakustiskt mikroskop som kan tillhandahålla histologiska bilder intraoperativt för kirurgisk marginalanalys demonstreras, inklusive systemkonfiguration, optisk inriktning, provberedning och experimentella procedurer.
Abstract
Kirurgisk marginalanalys (SMA), ett viktigt förfarande för att bekräfta fullständig excision av cancervävnad vid tumörresektionskirurgi, kräver intraoperativa diagnostiska verktyg för att undvika upprepade operationer på grund av en positiv kirurgisk marginal. Nyligen, genom att dra nytta av den höga inneboende optiska absorptionen av DNA / RNA vid 266 nm våglängd, har ultraviolett fotoakustisk mikroskopi (UV-PAM) utvecklats för att ge högupplösta histologiska bilder utan märkning, vilket visar stort löfte som ett intraoperativt verktyg för SMA. För att möjliggöra utvecklingen av UV-PAM för SMA presenteras här ett höghastighets- och öppet UV-PAM-system som kan användas på samma sätt som konventionella optiska mikroskopior. UV-PAM-systemet ger en hög sidoupplösning på 1,2 μm och en hög bildhastighet på 55 kHz A-linjehastighet med enaxlig galvanometerspegelskanning. Dessutom, för att säkerställa att UV-PAM-bilder enkelt kan tolkas av patologer utan ytterligare utbildning, är de ursprungliga gråskala UV-PAM-bilderna praktiskt taget färgade av en djupinlärningsalgoritm för att efterlikna de vanliga hematoxylin- och eosinfärgade bilderna, vilket möjliggör träningsfri histologisk analys. Mushjärnskivavbildning utförs för att visa den höga prestandan hos det öppna UV-PAM-systemet, vilket illustrerar dess stora potential för SMA-applikationer.
Introduction
Kirurgisk marginalanalys (SMA), som kräver en undersökning av vävnadsprover under ett mikroskop, är ett viktigt förfarande för att avgöra om alla cancerceller tas bort från en patients kropp i en resektionsoperation1. Därför är ett mikroskop som snabbt kan ge histologiska bilder mycket viktigt för SMA för att undvika upprepade operationer orsakade av ofullständig borttagning av cancerceller. Enligt den nuvarande guldstandardmetoden baserad på ljusfältsoptisk mikroskopi måste emellertid den exciserade vävnaden fixeras i formalin, inbäddad i paraffin, delas upp i tunna skivor (4-7 μm) och sedan färgas av hematoxylin och eosin (H & E) före avbildning, vilket är tidskrävande (3-7 dagar) ochmödosamt 2,3 . En frusen sektion är ett snabbt alternativ för SMA genom att snabbt frysa, skära och färga vävnaden, vilket kan ge histologiska bilder på 20-30 min4. De histologiska egenskaperna är emellertid ofta förvrängda och kräver skicklig träning, vilket hindrar teknikens tillämplighet på flera typer av organ5.
Optiska mikroskopitekniker som kan ge cellulära bilder utan eller med några steg av vävnadsbehandling har utvecklats för SMA. Men var och en av dem lider av olika problem. Till exempel lider optisk koherenstomografi6 och konfokal reflektansmikroskopi7 av låg specificitet på grund av deras låga inneboende spridningskontrast. Även om mikroskopi med ultraviolett yt excitation8 och ljusarkmikroskopi9 kan ge högupplösta och högkontrastbilder för SMA, kan den giftiga och flyktiga färgningen vanligtvis inte utföras i en operationssal, vilket förlänger vändningstiden. Multifotonmikroskopi10 och stimulerad Raman-mikroskopi11 kan ge rik information för SMA. Ändå förhindrar den höga kostnaden för de nödvändiga ultrasnabba lasrarna som används för att generera olinjära effekter deras breda tillämplighet.
Nyligen, genom att dra nytta av inneboende optisk absorption, har etikettfri ultraviolett fotoakustisk mikroskopi (UV-PAM) utvecklats för att ge högupplösta histologiska bilder12. I UV-PAM absorberas fotonenergin i excitations-UV-ljuset (t.ex. 266 nm) först av DNA / RNA i cellkärnor13 och omvandlas sedan till värme, vilket inducerar akustisk vågemission genom termisk elastisk expansion14. Genom att detektera de genererade akustiska vågorna kan tvådimensionella (2D) UV-PAM-bilder av cellkärnor erhållas via maximal amplitudprojektion av de akustiska signalerna, vilket ger histologisk information för SMA. För att möjliggöra kliniska tillämpningar av UV-PAM har höghastighets UV-PAM baserat på galvanometerspegelskanning utvecklats för att ge histologiska bilder för ett hjärnbiopsiprov (5 mm x 5 mm) inom 18 minuter, vilket visar stor potential i tidskänsliga applikationer15. För att ytterligare validera möjligheten till UV-PAM för tjockvävnadsavbildning föreslogs ett reflektionsläge UV-PAM-system med en vattentät enaxlig mikroelektromekanisk systemskanner, som framgångsrikt demonstrerade intraoperativ histopatologisk undersökning av mänskliga kolon- och levervävnader16. Eftersom den ursprungliga UV-PAM-bilden är i gråskala medan den gyllene H&E-färgade bilden är i rosa och lila färger är det svårt för patologer att tolka UV-PAM-bilder direkt. För att lösa problemet föreslogs en djupinlärningsalgoritm för att överföra GRÅSKALA UV-PAM-bilder till virtuella H & E-färgade bilder i nästan realtid så att patologer kan förstå bilderna utan ytterligare utbildning17.
Detta arbete rapporterar ett höghastighets och öppet UV-PAM-system som kan användas på samma sätt som konventionella optiska mikroskopior, vilket ger både ursprungliga gråskale histologiska bilder och praktiskt taget färgade bilder med hjälp av en djupinlärningsalgoritm. En formalin-fixerad och paraffininbäddad (FFPE) mushjärnskiva avbildas av UV-PAM-systemet för att visa likheten mellan våra praktiskt taget färgade UV-PAM och vanliga H &E-färgade bilder, vilket visar dess potential för SMA-applikationer.
Protocol
Alla djurförsök som utförs i detta arbete är godkända av djuretiska kommittén vid Hong Kong University of Science and Technology.
1. UV-PAM-system med öppen topp (Figur 1)
- Optisk belysning
- Använd en Q-switch-diodpumpad solid state-laser (266 nm våglängd) som excitationskälla.
- Använd två konvexa linser för att expandera laserstrålen och placera ett nålhål nära brännpunkten för den första konvexa linsen för att utföra rumslig filtrering.
- Reflektera laserstrålen uppåt med en 1D galvanometerspegel (1D GM).
- Använd en objektivlins för att fokusera laserstrålen och passera genom mitten av en ringformad ultraljudsgivare (UT) innan du är tätt fokuserad på ett prov.
- Ultraljud upptäckt
- Använd en ringformad fokuserad UT för att upptäcka ultraljudsvågor. De inre och yttre diametrarna för det aktiva området UT är 3 mm respektive 6 mm. Brännvidd: 6,3 mm; mittfrekvens: 40 MHz; -6 dB bandbredd: 84%.
- Fäst UT i en laboratorietillverkad vattentank med ett optiskt transparent fönster längst ner, täckt av en tunn kvartsöverdrag för att tillåta UV-ljus att passera igenom. Se till att det aktiva området i UT är vänt uppåt. Fäst vattentanken i ett tvåaxligt manuellt steg för att styra UT: s laterala läge.
- Slå på UV-lasern, justera UT: s position så att laserstrålen kan passera från mitten av UT. Stäng av UV-lasern. Fyll sedan vattentanken med avjoniserat vatten för att helt fördjupa UT.
- Anslut utgången från UT till två förstärkare (total förstärkning = 56 dB) och anslut utgången från den andra förstärkaren till ett datainsamlingskort (DAQ).
- Fäst en provhållare till ett manuellt steg på z-axeln som är anslutet till xy-motoriserade steg. Provhållaren har ett tomt hål som tillåter UV-ljus att passera igenom. Fäst fyra bitar dubbelsidig tejp som omger hålet.
- Systeminriktning
- Fäst svart tejp på en glasskiva och placera glasskivan för att täcka hålet på provhållaren, med den svarta tejpen vänd nedåt. Tryck på glasskivan för att säkerställa att den är fastsatt på provhållaren. Sänk sedan ner provhållaren för att sänka ner glasrutschbanan i vattnet.
- Koppla bort den ringformade UT och förstärkarna, anslut UT till pulsern/mottagaren och anslut pulsörens/mottagarens utgång till ett oscilloskop. Använd pulsern/mottagaren i Pulse-Echo-läget. Ställ in pulsamplituden och förstärkningen av pulsern/mottagaren på 6 respektive 20 dB.
- Aktivera pulsern/mottagaren och justera provhållarens z-position för att hitta positionen för det akustiska fokalplanet där ultraljudssignalerna är maximala.
- Byt pulser/mottagare till överföringsläge och ställ in förstärkningen på 60 dB. Aktivera laserutgången. Justera objektivlinsens z-position för att maximera PA-signalerna som mäts av oscilloskopet.
- Justera sidoläget för den ringformade UT för att göra den genererade PA-signalen symmetrisk och maximal, vilket representerar att de optiska och akustiska foci är koalignerade i sidoplanet. Justera sedan provhållarens z-position för att maximera PA-signalerna.
- Upprepa steg 1.4.3 och 1.4.4 för att optimera både PA-signalernas symmetri och amplitud. Registrera tidsfördröjningen (dvs. den tid det tar för PA-vågorna att nå UT) på oscilloskopet när PA-signalerna är optimerade.
- Flytta provhållaren för att avbilda olika positioner på den svarta tejpen. Justera provhållarens planhet så att PA-signalerna som genereras från varje position i den svarta tejpen har samma tidsfördröjning som den som uppmätts i steg 1.4.5.
- Stäng av lasern och anslut UT till de två förstärkarna.
2. Provberedning
- FFPE mus hjärnskiva
- Offra en mus med en överdos av anestesi. Skörda sedan mushjärnan enligt protokollet som beskrivs i referens18.
- Fixa den skördade hjärnan i 10% neutralt buffrat formalin i 24 timmar.
- Bearbeta den fasta hjärnan genom uttorkning med graderad alkohol, rensning med xylen och inbäddning med paraffin enligt beskrivningen i referens19.
OBS: Bearbeta provet i en dragskåpa. - Skär den inbäddade hjärnan i tunna skivor (5 μm i tjocklek) med hjälp av en mikrotom. Placera provskivorna på kvartsbilder. Torka rutschkanorna i en ugn vid 60 °C i 1 timme.
- Deparaffinisera sektionerna med hjälp av ett clearingmedel (se Materialtabell), som tar bort paraffinet för att undvika höga bakgrundssignaler eftersom paraffin absorberar mycket med UV-excitation.
OBS: Bearbeta provet i en dragskåpa.
- Färsk mus hjärnskiva
- Offra en mus med en överdos av anestesi. Skörda sedan mushjärnan enligt protokollet som anges i referens18.
- Tvätta mushjärnan med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att ta bort blodet.
- Skär en skiva av hjärnprovet (~ 5 mm tjockt) för hand och tvätta sedan provet med PBS för att ta bort blodet på tvärsnittet.
3. Experimentella förfaranden
- Exempel på placering
- Förbered en laboratorietillverkade provtank med ett UV-transparent membran (polyeten, ∼10 μm i tjocklek). Tillsätt en droppe vatten till membranet och placera sedan det biologiska provet på provtanken för att täcka vattnet. När det gäller FFPE-skivprovet, använd tejp för att fixera glasskivan på membranet.
- Placera provbehållaren på provhållaren och se till att provhållarens tomma hål täcks.
- Ställ in UV-lasern på det externa triggerläget. Använd vårt labbbyggda LabVIEW-program (se Materialtabell) och ställ in skanningsparametrarna enligt följande.
- Ställ in laserupprepningshastigheten till 55 kHz; ställ in signaltype för GM-drivrutinen på triangulär och drivspänningsområdet till 0,018 V (vilket motsvarar ±0,018 V; skalfaktor: 1 V / °). Ställ in GMnum på 22 och dy till 2 så att GM efter varje 22 laserutlösare avslutar en fjärdedel av skanningsperioden och y-axelmotorn flyttar en stegstorlek på 0,3125 μm. Ställ in dx på 192 så att när y-axelmotorn når det förinställda läget (t.ex. 5 mm) flyttar x-axelmotorn en stegstorlek på 30 μm.
OBS: Den minsta inkrementella stegstorleken är inställd på 0,15625 μm för både x- och y-axelmotorerna. Därför, när dy = 2, är stegstorleken lika med 0,15625 x 2 = 0,3125 μm, och när dx = 192 är stegstorleken lika med 0,15625 x 192 = 30 μm. För att skanna hela området på 5 x 5 mm2 kommer x-axelmotorn att röra sig 5000 μm / 30 μm = 167 gånger, vilket innebär att 167 underbilder skulle sys för att få en hel bild. Se figur 2 för skanningsbanan för UV-PAM-systemet.
- Ställ in laserupprepningshastigheten till 55 kHz; ställ in signaltype för GM-drivrutinen på triangulär och drivspänningsområdet till 0,018 V (vilket motsvarar ±0,018 V; skalfaktor: 1 V / °). Ställ in GMnum på 22 och dy till 2 så att GM efter varje 22 laserutlösare avslutar en fjärdedel av skanningsperioden och y-axelmotorn flyttar en stegstorlek på 0,3125 μm. Ställ in dx på 192 så att när y-axelmotorn når det förinställda läget (t.ex. 5 mm) flyttar x-axelmotorn en stegstorlek på 30 μm.
- Starta provskanning på ett litet område genom att ställa in antalet rörliga steg för x- och y-axelmotorerna (xn = 10 och yn = 1000). Justera z-axelns manuella steg för att placera provet på fokalplanet för att erhålla maximala PA-signaler.
- Flytta både x- och y-axelmotorer till önskad startpunkt, ställ in skanningsområdet genom att ställa in xn - och yn-värdena och starta sedan bildinsamlingsprogrammet (se Materialtabell).
- Stäng av lasern efter bildupptagningen, ta bort provhållaren och förvara de biologiska proverna.
- För färska biologiska vävnader, förvara proverna i 10% neutralt buffrat formalin.
- För FFPE-musens hjärnskivor, fläck med H & E enligt protokollet som anges i referens20 för att få motsvarande H & E-färgade bilder.
- Använd de insamlade PA-signalerna för att rekonstruera den maximala amplitudprojektionsbilden med hjälp av en laboratoriebyggd bildbehandlingsalgoritm (se Materialtabell).
Representative Results
Figur 1 visar schemat för höghastighets UV-PAM-systemet. I denna inställning är de optiska excitations- och ultraljudsdetekteringsvägarna på samma sida och under provet och bildar ett reflekterande läge och öppet system. Således är den användarvänlig och lämplig för avbildning av tjocka prover.
Figur 2 visar skanningsbanan för UV-PAM-systemet under avbildning. Delbild av varje sektion (t.ex. en yta på 5 mm x 30 μm) genereras först med hjälp av en spridd interpoleringsalgoritm, och sedan erhålls en hel bild (t.ex. en yta på 5 mm x 5 mm) genom att sy alla underbilder med hjälp av anpassad bildbehandlingsalgoritm (se Materialtabell).
Figur 3A och figur 3B visar UV-PAM- och H&E-bilderna av en FFPE-mushjärnskiva, som båda har ett synfält på 5 x 5 mm2. Bildbehandlingsalgoritmen kan nås från Github via länken i materialförteckningen. Bildinsamlingstiden var mindre än 18 min. Figur 3C-F visar de inzoomade bilderna av de markerade regionerna i figur 3A, där de enskilda cellkärnorna tydligt kan lösas. Ännu viktigare är att motsvarande cellkärnor finns i de vanliga H & E-färgade bilderna (figur 3G-J), som visar den höga noggrannheten hos det nuvarande systemet för cellulär avbildning. För att överföra uv-PAM-bilden i gråskala till en virtuell H&E-färgad bild tillämpades en djupinlärningsalgoritm17 (se Materialtabell), vilket skulle ta mindre än 30 s för en bild med 8000 x 8000 pixlar. Motsvarande inzoomade bilder visas i figur 3K-N. De praktiskt taget färgade UV-PAM-bilderna ger nästan samma strukturella information som de H&E-färgade bilderna, vilket visar löfte om klinisk översättning av det nuvarande UV-PAM-systemet.
Figur 1: Schemat för uv-PAM-systemet med hög hastighet och öppen topp. (A) Systeminställningen. B) Fotografi av provhållaren och en vattentank som är fäst vid ett tvåaxligt manuellt steg. (C) Fotografi av den ringformade ultraljudsgivaren som är fixerad i vattentanken och provtanken som täcker provhållarens hål. (D) Fotografi av provtanken med membranet och provet som skulle placeras på provhållaren. UV: Ultraviolett; DAQ: Datainsamlingskort; GM: Galvanometerspegel. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Skanningsbanan för UV-PAM-systemet under avbildning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Experimentella resultat av UV-PAM-avbildning med djupinlärningsbaserad virtuell färgning. (A) UV-PAM-bild av en FFPE-mus hjärnskiva. (B) Standard H&E-färgad bild av samma skiva. Skalstänger: 1 mm. (C-F) Inzoomade bilder av de markerade områdena i A. (G-J) Motsvarande H&E-färgade bilder av de markerade regionerna i B. (K-N) Motsvarande praktiskt taget färgade bilder med hjälp av en djupinlärningsalgoritm. Skalstänger: 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Sammanfattningsvis har ett höghastighets- och öppet UV-PAM-system demonstrerats för histologisk avbildning. De detaljerade instruktionerna om systemkonfiguration, optisk inriktning, provberedning och experimentella procedurer presenteras. Bildförvärvsprogrammet kan nås från Github via länken i materialförteckningen. Den laterala upplösningen av det nuvarande systemet är ~ 1,2 μm som experimentellt har mätts i en ny publikation21. En mushjärnskiva avbildades för att visa att det nuvarande systemet kan få en histologisk bild inom 18 minuter för ett område på 5 x 5 mm2, vilket är en typisk storlek på hjärnbiopsi22. Även om den ursprungliga bilden är i gråskala, med hjälp av ett digitalt virtuellt färgningsverktyg som möjliggörs av en djupinlärningsalgoritm, kan det nuvarande systemet ytterligare tillhandahålla praktiskt taget färgade bilder i nästan realtid, vilket säkerställer enkel anpassning för patologer att tolka bilderna. Som en etikettfri bildteknik kan det nuvarande UV-PAM-systemet också tillhandahålla histologiska bilder för obearbetade färska vävnadsprover. Fler exempel (inklusive frysta och färska vävnadsprover) har visats i en tidigare publikation17. De experimentella resultaten visar den höga potentialen hos det nuvarande djupinlärningsassisterade UV-PAM-systemet i SMA-applikationer.
En av fördelarna med UV-PAM-systemet är att systemet implementeras i reflektionsläge, vilket möjliggör avbildning av tjocka vävnader. Dessutom tillåter det öppna UV-PAM-systemet att provet placeras på skanningsfönstret (provtankens membran), som har en liknande funktion som traditionella optiska mikroskopior. Därför är detta system mer användarvänligt än andra system som kräver att prover klämmers in av två membran11,14. Dessutom, genom att använda en 1D GM med en UV-laser med hög repetitionshastighet, kan det nuvarande UV-PAM-systemet uppnå hög bildhastighet med högre kostnadseffektivitet jämfört med systemet som använder multifokal excitation23.
För närvarande är bildhastigheten huvudsakligen begränsad av laser- och fotonbudgetens repetitionshastighet. Med en laser som har en hög repetitionshastighet och hög pulsenergi kan avbildningstiden förkortas ytterligare. En annan begränsning av systemet är att provet endast kan justeras grovt till objektivlinsens fokalplan genom att hitta de maximala PA-signalerna, istället för att visa en realtidsbild för användare att visualisera om provet är i fokus. För att visa en bild i nära realtid kan 2D GM tillämpas.
Det finns två kritiska steg i protokollet: a) Det konfokala kravet på optiska och akustiska fokusområden bör optimeras för att uppnå en hög detektionskänslighet. b) Skanningsområdet för den genetiskt modifierade produkten på x-axeln bör vara mindre än den akustiska brännpunkten för den ringformade UT för att bibehålla liknande hög detektionskänslighet (i den aktuella inställningen är skanningsområdet ~ 30 μm ±15 μm). Annars skulle uppenbara vinjetteringseffekter runt kanterna uppstå när flera underbilder sys ihop för att få en hel bild.
Disclosures
T. T. W. W. och V. T. C. T. har ett ekonomiskt intresse i PhoMedics Limited, som dock inte stödde detta arbete. Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Författarna vill uppmärksamma det ekonomiska stödet från Hongkongs innovations- och teknikkommission (ITS/036/19).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol | Sigma Aldrich | PHR1373 | Sample dehydration |
| Amplifier | Mini Circuit | ZFL-500LN-BNC+ | Ultrasonic signal amplification |
| Controller | National Instruments | NI myRIO | System controller |
| Data acquisition card | Alazar Technologies | ATS9350 | Ultrasonic signal collection |
| Deep-learning algorithm | For transfering the grayscale UV-PAM image to a virtual H&E-stained image; https://github.com/TABLAB-HKUST/Deep-PAM | ||
| Formalin | Sigma Aldrich | R04586 | Sample fixation |
| H&E staining kit | Abcam | ab245880 | Sample staining |
| Histo-Clear II | National Diagnostics | HS-202 | Sample deparaffinization |
| Image acquisition program | National Instruments | LabVIEW | Lab-built program using LabVIEW; https://github.com/TABLAB-HKUST/LabVIEW-program-for-UV-PAM |
| Image processing algorithm | Mathworks | MATLAB | Lab-built algorithm using MATLAB; https://github.com/TABLAB-HKUST/ImageRec_GM-UVPAM |
| Kinematic platform mounts | Thorlabs | KM200B | Adjust the sample to be flat |
| Membrane | Glad | Cling wrap | Sandwiched in sample tank |
| Microscope objective lens | Thorlabs | LMU- 5X-NUV | Objective lens |
| Motorized stages | Physik Instrumente | L-509.10SD00 | Scanning stages |
| One-dimensional galvanometer mirror | Thorlabs | GVS411 | Fast scanning mirror |
| Oscilloscope | RIGOL Technologies | DS1102E | Ultrasonic signal readout |
| Phosphate-buffered saline | Sigma Aldrich | P3813 | Sample washing |
| Pinhole | Edmund Optics | #59–257 | Spatial filtering |
| Plano convex lens | Thorlabs | LA-4600-UV | Focusing lens |
| Plano convex lens | Thorlabs | LA-4663-UV | Collimating lens |
| Pulser/receiver | Imaginant | DPR300 | Pulse echo amplifier |
| Q-switch diode-pumped solid-state laser | Bright Solutions | WEDGE HF 266 nm | 266-nm laser |
| Ring-shaped ultrasonic transducer | University of Southern California | Ultrasonic signal detection | |
| Sample holder | Lab-made | Hold the sample tank | |
| Sample tank | Lab-made | Hold biological samples | |
| Single-axis Z-translational stage | Thorlabs | PT1 | Manual stage |
| Two-axis manual stage | Thorlabs | LX20 | Manual stage |
| Water tank | Lab-made | Ultrasonic signal transmission | |
| Xylene | Sigma Aldrich | XX0060 | Sample clearing |
References
- Kunos, C., et al. Breast conservation surgery achieving ≥ 2 mm tumor-free margins results in decreased local-regional recurrence rates. The Breast Journal. 12, 28-36 (2006).
- Rosai, J. Why microscopy will remain a cornerstone of surgical pathology. Laboratory Investigation. 87 (5), 403-408 (2007).
- Yang, J., Caprioli, R. M. Matrix sublimation/recrystallization for imaging proteins by mass spectrometry at high spatial resolution. Analytical Chemistry. 83 (14), 5728-5734 (2011).
- Jaafar, H. Intra-operative frozen section consultation: concepts, applications and limitations. The Malaysian Journal of Medical Sciences: MJMS. 13 (1), 4 (2006).
- Rastogi, V., et al. Artefacts: a diagnostic dilemma - a review. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 7 (10), 2408-2413 (2013).
- Carrasco-Zevallos, O. M., et al. Review of intraoperative optical coherence tomography: technology and applications [Invited]. Biomedical Optics Express. 8 (3), 1607 (2017).
- Gareau, D. S., Jeon, H., Nehal, K. S., Rajadhyaksha, M. Rapid screening of cancer margins in tissue with multimodal confocal microscopy. Journal of Surgical Research. 178 (2), 533-538 (2012).
- Fereidouni, F., et al. Microscopy with ultraviolet surface excitation for rapid slide-free histology. Nature Biomedical Engineering. 1 (12), 957-966 (2017).
- Tanaka, N., et al. Whole-tissue biopsy phenotyping of three-dimensional tumours reveals patterns of cancer heterogeneity. Nature Biomedical Engineering. 1 (10), 796-806 (2017).
- Jain, M., et al. Multiphoton microscopy: A potential intraoperative tool for the detection of carcinoma in situ in human bladder. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 139 (6), 796-804 (2015).
- Orringer, D. A., et al. Rapid intraoperative histology of unprocessed surgical specimens via fibre-laser-based stimulated Raman scattering microscopy. Nature Biomedical Engineering. 1 (2), 0027 (2017).
- Wong, T. T. W., et al. Fast label-free multilayered histology-like imaging of human breast cancer by photoacoustic microscopy. Science Advances. 3 (5), 1602168 (2017).
- Shen, C. -H. Detection and analysis of nucleic acids. Diagnostic Molecular Biology. , 167-185 (2019).
- Yao, J., Wang, L. V.
- Li, X., Kang, L., Zhang, Y., Wong, T. T. W. High-speed label-free ultraviolet photoacoustic microscopy for histology-like imaging of unprocessed biological tissues. Optics Letters. 45 (19), 5401 (2020).
- Baik, J. W., et al. Intraoperative label-free photoacoustic histopathology of clinical specimens. Laser & Photonics Reviews. 15 (10), 2100124 (2021).
- Kang, L., Li, X., Zhang, Y., Wong, T. T. W. Deep learning enables ultraviolet photoacoustic microscopy based histological imaging with near real-time virtual staining. Photoacoustics. 25, 100308 (2022).
- Sterile Tissue Harvest | Protocol. , Available from: https://www.jove.com/science-education/10298/sterile-tissue-harvest (2022).
- Steps to Tissue Processing for Histopathology. , Available from: https://www.liecabiosystems.com/knowledge-pathway/an-introduction-to-specimen-processing/ (2022).
- An Intro to H&E Staining: Protocol, Best Practices, Steps & More. , Available from: https://www.liecabiosystems.com/knowledge-pathway/he-staining-overview-a-guide-to-best-practices/ (2022).
- Li, X., et al. Ultraviolet photoacoustic microscopy with tissue clearing for high-contrast histological imaging. Photoacoustics. 25, 100313 (2022).
- Leinonen, V., et al. Assessment of β-amyloid in a frontal cortical brain biopsy specimen and by positron emission tomography with carbon 11-labeled pittsburgh compound B. Archives of Neurology. 65 (10), 1304-1309 (2008).
- Imai, T., et al. High-throughput ultraviolet photoacoustic microscopy with multifocal excitation. Journal of Biomedical Optics. 23 (03), (2018).
