Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

उच्च गति पराबैंगनी Photoacoustic माइक्रोस्कोपी आभासी के साथ हिस्टोलॉजिकल इमेजिंग के लिए धुंधला गहरी सीखने द्वारा सहायता प्राप्त

Published: April 28, 2022 doi: 10.3791/63649
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Translational and Advanced Bioimaging Laboratory, Department of Chemical and Biological Engineering, Hong Kong University of Science and Technology

Summary

एक उच्च गति और ओपन-टॉप पराबैंगनी फोटोअकोस्टिक माइक्रोस्कोप जो सर्जिकल मार्जिन विश्लेषण के लिए हिस्टोलॉजिकल छवियों को इंट्राऑपरेटिव रूप से प्रदान कर सकता है, का प्रदर्शन किया जाता है, जिसमें सिस्टम कॉन्फ़िगरेशन, ऑप्टिकल संरेखण, नमूना तैयारी और प्रयोगात्मक प्रक्रियाएं शामिल हैं।

Abstract

सर्जिकल मार्जिन विश्लेषण (एसएमए), ट्यूमर लकीर सर्जरी में कैंसर के ऊतकों के पूर्ण उच्छेदन की पुष्टि करने के लिए एक आवश्यक प्रक्रिया, एक सकारात्मक सर्जिकल मार्जिन के कारण बार-बार सर्जरी से बचने के लिए इंट्राऑपरेटिव नैदानिक उपकरणों की आवश्यकता होती है। हाल ही में, 266 एनएम तरंग दैर्ध्य पर डीएनए / आरएनए के उच्च आंतरिक ऑप्टिकल अवशोषण का लाभ उठाकर, पराबैंगनी फोटोएकोस्टिक माइक्रोस्कोपी (यूवी-पीएएम) को लेबलिंग के बिना उच्च-रिज़ॉल्यूशन हिस्टोलॉजिकल छवियों को प्रदान करने के लिए विकसित किया गया है, जो एसएमए के लिए एक इंट्राऑपरेटिव टूल के रूप में महान वादा दिखा रहा है। एसएमए के लिए यूवी-पीएएम के विकास को सक्षम करने के लिए, यहां, एक उच्च गति और ओपन-टॉप यूवी-पीएएम सिस्टम प्रस्तुत किया गया है, जिसे पारंपरिक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के समान संचालित किया जा सकता है। यूवी-पीएएम सिस्टम 1.2 μm का एक उच्च पार्श्व रिज़ॉल्यूशन प्रदान करता है, और एक-अक्ष गैल्वेनोमीटर दर्पण स्कैनिंग के साथ 55 kHz A-line दर की एक उच्च इमेजिंग गति प्रदान करता है। इसके अलावा, यह सुनिश्चित करने के लिए कि यूवी-पीएएम छवियों को अतिरिक्त प्रशिक्षण के बिना पैथोलॉजिस्ट द्वारा आसानी से व्याख्या की जा सकती है, मूल ग्रेस्केल यूवी-पीएएम छवियों को मानक हेमेटोक्सिलिन- और ईओसिन-सना हुआ छवियों की नकल करने के लिए एक गहरी-सीखने वाले एल्गोरिथ्म द्वारा वस्तुतः दाग दिया जाता है, जिससे प्रशिक्षण-मुक्त हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण सक्षम होता है। माउस मस्तिष्क स्लाइस इमेजिंग ओपन-टॉप यूवी-पीएएम सिस्टम के उच्च प्रदर्शन को प्रदर्शित करने के लिए किया जाता है, जो एसएमए अनुप्रयोगों के लिए अपनी महान क्षमता को दर्शाता है।

Introduction

सर्जिकल मार्जिन विश्लेषण (एसएमए), जिसके लिए माइक्रोस्कोप के तहत ऊतक के नमूनों की जांच की आवश्यकता होती है, यह निर्धारित करने के लिए एक आवश्यक प्रक्रिया है कि क्या सभी कैंसर कोशिकाओं को एक लकीर सर्जरीमें रोगी के शरीर से हटा दिया जाता है। इसलिए, एक माइक्रोस्कोप जो तेजी से हिस्टोलॉजिकल छवियों को प्रदान कर सकता है, एसएमए के लिए कैंसर कोशिकाओं के अधूरे हटाने के कारण बार-बार सर्जरी से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, उज्ज्वल-क्षेत्र ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के आधार पर वर्तमान स्वर्ण-मानक विधि के अनुसार, उत्पादित ऊतक को फॉर्मेलिन में तय करने की आवश्यकता होती है, पैराफिन में एम्बेडेड, पतले स्लाइस (4-7 μm) में विभाजित किया जाता है, और फिर इमेजिंग से पहले हेमेटोक्सिलिन और ईोसिन (एच एंड ई) द्वारा दाग दिया जाता है, जो समय लेने वाला (3-7 दिन) और श्रमसाध्य 2,3 है। . एक जमे हुए अनुभाग एसएमए के लिए एक तेजी से विकल्प है, जो ऊतक को जल्दी से ठंडा, टुकड़ा करने और धुंधला करके, जो 20-30 मिनट 4 में हिस्टोलॉजिकल छवियां प्रदान कर सकताहै। हालांकि, हिस्टोलॉजिकल विशेषताओं को अक्सर विकृत किया जाता है और कुशल प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है, जो कई प्रकार के अंगों के लिए तकनीक की प्रयोज्यता में बाधा डालताहै।

ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी तकनीकें जो ऊतक प्रसंस्करण के बिना या कुछ चरणों के साथ सेलुलर छवियां प्रदान कर सकती हैं, एसएमए के लिए विकसित की गई हैं। हालांकि, उनमें से प्रत्येक अलग-अलग मुद्दों से पीड़ित है। उदाहरण के लिए, ऑप्टिकल सुसंगतता टोमोग्राफी6 और कॉन्फोकल परावर्तकता माइक्रोस्कोपी7 अपने कम आंतरिक प्रकीर्णन विपरीत के कारण कम विशिष्टता से पीड़ित हैं। यद्यपि पराबैंगनी सतह उत्तेजना8 और प्रकाश-शीट माइक्रोस्कोपी9 के साथ माइक्रोस्कोपी एसएमए के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन और उच्च-विपरीत छवियां प्रदान कर सकती है, विषाक्त और वाष्पशील धुंधला प्रक्रिया आमतौर पर एक ऑपरेटिंग रूम में नहीं की जा सकती है, जो टर्नअराउंड समय को बढ़ाती है। मल्टी-फोटॉन माइक्रोस्कोपी10 और उत्तेजित रमन माइक्रोस्कोपी11 एसएमए के लिए समृद्ध जानकारी प्रदान कर सकते हैं। फिर भी, nonlinear प्रभाव उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया जाता है कि आवश्यक ultrafast लेजर की उच्च लागत उनकी व्यापक प्रयोज्यता को रोकता है।

हाल ही में, आंतरिक ऑप्टिकल अवशोषण का लाभ उठाकर, लेबल-मुक्त पराबैंगनी फोटोएकॉस्टिक माइक्रोस्कोपी (यूवी-पीएएम) को उच्च-रिज़ॉल्यूशन हिस्टोलॉजिकल छवियों को प्रदान करने के लिए विकसित किया गयाहै। यूवी-पीएएम में, उत्तेजना यूवी प्रकाश (जैसे, 266 एनएम) की फोटॉन ऊर्जा को पहले सेल नाभिक13 में डीएनए / आरएनए द्वारा अवशोषित किया जाता है और फिर गर्मी में परिवर्तित किया जाता है, थर्मल-लोचदार विस्तार14 के माध्यम से ध्वनिक तरंग उत्सर्जन को प्रेरित करता है। उत्पन्न ध्वनिक तरंगों का पता लगाकर, सेल नाभिक की दो-आयामी (2 डी) यूवी-पीएएम छवियों को ध्वनिक संकेतों के अधिकतम आयाम प्रक्षेपण के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है, जो एसएमए के लिए हिस्टोलॉजिकल जानकारी प्रदान करता है। यूवी-पीएएम के नैदानिक अनुप्रयोगों को सक्षम करने के लिए, गैल्वेनोमीटर दर्पण स्कैनिंग के आधार पर उच्च गति यूवी-पीएएम को 18 मिनट के भीतर मस्तिष्क बायोप्सी नमूने (5 मिमी x 5 मिमी) के लिए हिस्टोलॉजिकल छवियां प्रदान करने के लिए विकसित किया गया है, जो समय-संवेदनशील अनुप्रयोगोंमें महान क्षमता दिखाता है। मोटी ऊतक इमेजिंग के लिए यूवी-पीएएम की संभावना को और अधिक मान्य करने के लिए, एक जलरोधक एक-अक्ष माइक्रोइलेक्ट्रोमैकेनिकल सिस्टम स्कैनर के साथ एक प्रतिबिंब-मोड यूवी-पीएएम प्रणाली प्रस्तावित की गई थी, जो मानव बृहदान्त्र और यकृत ऊतकों की इंट्राऑपरेटिव हिस्टोपैथोलॉजिकल परीक्षा का सफलतापूर्वक प्रदर्शन करतीहै। चूंकि मूल यूवी-पीएएम छवि ग्रेस्केल में है, जबकि सोने का मानक एच एंड ई-दाग वाली छवि गुलाबी और बैंगनी रंगों में है, इसलिए पैथोलॉजिस्ट के लिए यूवी-पीएएम छवियों की सीधे व्याख्या करना मुश्किल है। इस मुद्दे को हल करने के लिए, एक गहरी-सीखने वाली एल्गोरिथ्म को ग्रेस्केल यूवी-पीएएम छवियों को वर्चुअल एच एंड ई-दाग वाली छवियों में स्थानांतरित करने का प्रस्ताव किया गया था ताकि पैथोलॉजिस्ट किसी भी अतिरिक्त प्रशिक्षण17 के बिना छवियों को समझ सकें।

यह काम एक उच्च गति और ओपन-टॉप यूवी-पीएएम सिस्टम की रिपोर्ट करता है जिसे पारंपरिक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के समान संचालित किया जा सकता है, जो मूल ग्रेस्केल हिस्टोलॉजिकल छवियों और लगभग दाग वाली छवियों को एक गहरी-सीखने वाले एल्गोरिथ्म द्वारा सहायता प्रदान करता है। एक फॉर्मेलिन-फिक्स्ड और पैराफिन-एम्बेडेड (एफएफपीई) माउस ब्रेन स्लाइस को यूवी-पीएएम सिस्टम द्वारा हमारे लगभग दाग वाले यूवी-पीएएम और मानक एच एंड ई-दाग वाली छवियों के बीच समानता प्रदर्शित करने के लिए चित्रित किया गया है, जो एसएमए अनुप्रयोगों के लिए अपनी क्षमता दिखाता है।

Protocol

इस काम में किए गए सभी पशु प्रयोगों को हांगकांग विज्ञान और प्रौद्योगिकी विश्वविद्यालय में पशु नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया जाता है।

1. ओपन-टॉप यूवी-पीएएम सिस्टम (चित्रा 1)

  1. ऑप्टिकल रोशनी
    1. एक उत्तेजना स्रोत के रूप में एक क्यू-स्विच डायोड-पंप ठोस-राज्य लेजर (266 एनएम तरंग दैर्ध्य) का उपयोग करें।
    2. लेजर बीम का विस्तार करने के लिए दो उत्तल लेंस का उपयोग करें और स्थानिक फ़िल्टरिंग करने के लिए पहले उत्तल लेंस के केंद्र बिंदु के करीब एक पिनहोल रखें।
    3. एक 1 डी गैल्वेनोमीटर दर्पण (1 डी जीएम) का उपयोग करके लेजर बीम को ऊपर की ओर प्रतिबिंबित करें।
    4. लेजर बीम पर ध्यान केंद्रित करने के लिए एक उद्देश्य लेंस का उपयोग करें और एक नमूने पर कसकर ध्यान केंद्रित करने से पहले एक अंगूठी के आकार के अल्ट्रासोनिक ट्रांसड्यूसर (यूटी) के केंद्र से गुजरें।
  2. अल्ट्रासोनिक डिटेक्शन
    1. अल्ट्रासोनिक तरंगों का पता लगाने के लिए एक अंगूठी के आकार के केंद्रित यूटी का उपयोग करें। यूटी सक्रिय क्षेत्र के आंतरिक और बाहरी व्यास क्रमशः 3 मिमी और 6 मिमी हैं। फोकल लंबाई: 6.3 मिमी; केंद्र आवृत्ति: 40 मेगाहर्ट्ज; -6 डीबी बैंडविड्थ: 84%.
    2. यूटी को नीचे एक ऑप्टिकल रूप से पारदर्शी खिड़की के साथ एक प्रयोगशाला-निर्मित पानी के टैंक में ठीक करें, जो यूवी प्रकाश को पारित करने की अनुमति देने के लिए एक पतली क्वार्ट्ज कवरस्लिप द्वारा कवर किया गया है। सुनिश्चित करें कि केंद्र शासित प्रदेश का सक्रिय क्षेत्र ऊपर की ओर सामना कर रहा है। यूटी की पार्श्व स्थिति को नियंत्रित करने के लिए पानी की टंकी को दो-अक्ष मैनुअल चरण में संलग्न करें।
    3. यूवी लेजर को चालू करें, लेजर बीम को यूटी के केंद्र से गुजरने की अनुमति देने के लिए यूटी की स्थिति को समायोजित करें। यूवी लेजर बंद करें। फिर, यूटी को पूरी तरह से विसर्जित करने के लिए विआयनीकृत पानी के साथ पानी की टंकी को भरें।
    4. यूटी के आउटपुट को दो एम्पलीफायरों (कुल लाभ = 56 डीबी) से कनेक्ट करें और दूसरे एम्पलीफायर के आउटपुट को डेटा अधिग्रहण कार्ड (DAQ) से कनेक्ट करें।
  3. एक नमूना धारक को एक z-अक्ष मैनुअल चरण में संलग्न करें जो xy-motorized चरणों से जुड़ा हुआ है। नमूना धारक में एक खाली छेद होता है जो यूवी प्रकाश को पारित करने की अनुमति देता है। छेद के चारों ओर डबल-साइडेड टेप के चार टुकड़े संलग्न करें।
  4. सिस्टम संरेखण
    1. एक ग्लास स्लाइड में काला टेप संलग्न करें और नमूना धारक के छेद को कवर करने के लिए ग्लास स्लाइड रखें, जिसमें काले टेप नीचे की ओर सामना कर रहे हैं। यह सुनिश्चित करने के लिए ग्लास स्लाइड दबाएँ कि यह नमूना धारक पर तय किया गया है। फिर, कांच की स्लाइड को पानी में विसर्जित करने के लिए नमूना धारक को कम करें।
    2. रिंग के आकार के यूटी और एम्पलीफायरों को डिस्कनेक्ट करें, यूटी को पल्सर / रिसीवर से कनेक्ट करें, और पल्सर / रिसीवर के आउटपुट को एक ऑसिलोस्कोप से कनेक्ट करें। पल्सर/रिसीवर को पल्स-इको मोड में संचालित करें। पल्स आयाम और पल्सर / रिसीवर के लाभ को क्रमशः 6 और 20 डीबी पर सेट करें।
      1. पल्सर / रिसीवर को सक्षम करें और ध्वनिक फोकल विमान की स्थिति खोजने के लिए नमूना धारक की जेड-स्थिति को समायोजित करें जहां अल्ट्रासोनिक सिग्नल अधिकतम हैं।
    3. पल्सर/रिसीवर को ट्रांसमिशन मोड में बदलें और लाभ को 60 डीबी पर सेट करें। लेजर आउटपुट सक्षम करें। OScilloscope द्वारा मापा जाता है कि पीए संकेतों को अधिकतम करने के लिए उद्देश्य लेंस की z-स्थिति समायोजित करें।
    4. उत्पन्न पीए सिग्नल को सममित और अधिकतम बनाने के लिए रिंग के आकार के यूटी की पार्श्व स्थिति को समायोजित करें, जो दर्शाता है कि ऑप्टिकल और ध्वनिक फोकी पार्श्व विमान में संयोजित हैं। उसके बाद, PA संकेतों को अधिकतम करने के लिए नमूना धारक की z-स्थिति समायोजित करें।
    5. PA संकेतों की समरूपता और आयाम दोनों को ऑप्टिमाइज़ करने के लिए चरण 1.4.3 और 1.4.4 दोहराएँ। समय देरी रिकॉर्ड करें (यानी, पीए तरंगों को यूटी तक पहुंचने के लिए समय लगता है) जब पीए सिग्नल अनुकूलित होते हैं तो ऑसिलोस्कोप पर।
    6. नमूना धारक को काले टेप की विभिन्न स्थितियों की छवि पर ले जाएँ. नमूना धारक की सपाटता को समायोजित करें जैसे कि काले टेप की प्रत्येक स्थिति से उत्पन्न पीए संकेतों में चरण 1.4.5 में मापा गया एक के समान समय विलंब होता है।
    7. लेजर को बंद करें और यूटी को दो एम्पलीफायरों से कनेक्ट करें।

2. नमूना तैयारी

  1. FFPE माउस मस्तिष्क टुकड़ा
    1. संज्ञाहरण की अधिक मात्रा के साथ एक माउस बलिदान. फिर, संदर्भ18 में वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करते हुए माउस मस्तिष्क की कटाई करें।
    2. 24 घंटे के लिए 10% तटस्थ बफ़र्ड फॉर्मेलिन में काटे गए मस्तिष्क को ठीक करें।
    3. वर्गीकृत अल्कोहल के साथ निर्जलीकरण द्वारा निश्चित मस्तिष्क को संसाधित करें, जाइलीन के साथ समाशोधन करें, और पैराफिन के साथ एम्बेड करें जैसा कि संदर्भ19 में वर्णित है।
      नोट:: एक धुएं हुड में नमूना संसाधित करें।
    4. एक माइक्रोटोम का उपयोग करके पतले स्लाइस (मोटाई में 5 μm) में एम्बेडेड मस्तिष्क को स्लाइस करें। क्वार्ट्ज स्लाइड्स पर नमूना स्लाइस रखें. स्लाइड को ओवन में 1 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर सुखाएं।
    5. एक समाशोधन एजेंट का उपयोग करके अनुभागों को deparaffinize ( सामग्री की तालिका देखें), जो उच्च पृष्ठभूमि संकेतों से बचने के लिए पैराफिन को हटा देता है क्योंकि पैराफिन यूवी उत्तेजना के साथ अत्यधिक अवशोषित होता है।
      नोट:: एक धुएं हुड में नमूना संसाधित करें।
  2. ताजा माउस मस्तिष्क टुकड़ा
    1. संज्ञाहरण की अधिक मात्रा के साथ एक माउस बलिदान. फिर, संदर्भ18 में बताए गए प्रोटोकॉल का पालन करते हुए माउस मस्तिष्क की कटाई करें।
    2. रक्त को हटाने के लिए माउस मस्तिष्क को फॉस्फेट-बफ़र्ड सलाइन (पीबीएस) के साथ धोएं।
    3. हाथ से मस्तिष्क के नमूने (~ 5 मिमी मोटी) का एक टुकड़ा काटें, और फिर क्रॉस सेक्शन पर रक्त को हटाने के लिए पीबीएस के साथ नमूने को धोएं।

3. प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं

  1. नमूना प्लेसमेंट
    1. एक यूवी पारदर्शी झिल्ली (polyethylene, मोटाई में ~10 μm) के साथ एक प्रयोगशाला-निर्मित नमूना टैंक तैयार करें। झिल्ली में पानी की एक बूंद जोड़ें और फिर पानी को कवर करने के लिए नमूना टैंक पर जैविक नमूने को रखें। एफएफपीई स्लाइस नमूने के मामले में, झिल्ली पर ग्लास स्लाइड को ठीक करने के लिए टेप का उपयोग करें।
    2. नमूना धारक पर नमूना युक्त नमूना टैंक रखें, नमूना धारक के खाली छेद को कवर करना सुनिश्चित करें।
  2. यूवी लेजर को बाहरी-ट्रिगर मोड पर सेट करें। हमारे प्रयोगशाला-निर्मित LabVIEW प्रोग्राम का उपयोग करके ( सामग्री की तालिका देखें), स्कैनिंग पैरामीटर को निम्नानुसार सेट करें।
    1. 55 kHz करने के लिए लेजर पुनरावृत्ति दर सेट; जीएम ड्राइवर के सिग्नल टाइपई को त्रिकोणीय और ड्राइविंग वोल्टेज रेंज को 0.018 वी पर सेट करें (±0.018 वी का प्रतिनिधित्व करते हुए; स्केल फैक्टर: 1 वी / GMnum को 22 पर सेट करें और 2 पर dy करें ताकि प्रत्येक 22 लेजर ट्रिगर्स के बाद, जीएम स्कैनिंग अवधि का एक चौथाई पूरा हो जाए, और y-अक्ष मोटर 0.3125 μm के चरण आकार को ले जाए। DX को 192 पर सेट करें ताकि जब y-अक्ष मोटर पूर्व निर्धारित स्थिति (जैसे, 5 मिमी) तक पहुंच जाए, तो x-अक्ष मोटर 30 μm के चरण आकार को स्थानांतरित कर दे।
      नोट:: सबसे छोटा वृद्धिशील चरण आकार x- और y-अक्ष मोटर्स दोनों के लिए 0.15625 μm होने के लिए सेट किया गया है। इसलिए, जब dy = 2, चरण का आकार 0.15625 x 2 = 0.3125 μm के बराबर होता है, और जब dx = 192, चरण का आकार 0.15625 x 192 = 30 μm के बराबर होता है। 5 x 5 मिमी2 के पूरे क्षेत्र को स्कैन करने के लिए, एक्स-अक्ष मोटर 5000 μm / 30 μm = 167 बार स्थानांतरित होगा, जिसका अर्थ है कि 167 उप-छवियों को एक पूरी छवि प्राप्त करने के लिए सिला जाएगा। यूवी-पीएएम सिस्टम के स्कैनिंग प्रक्षेपवक्र के लिए चित्र2 देखें।
  3. x- और y-अक्ष मोटर्स (xn = 10 और yn = 1000) के चलती चरणों की संख्या सेट करके एक छोटे से क्षेत्र पर परीक्षण स्कैनिंग प्रारंभ करें। अधिकतम पीए सिग्नल प्राप्त करने के लिए फोकल प्लेन पर नमूना रखने के लिए जेड-अक्ष मैनुअल चरण को समायोजित करें।
  4. x- और y-अक्ष मोटर्स दोनों को वांछित प्रारंभिक बिंदु पर ले जाएँ, xn और yn मानों को सेट करके स्कैनिंग क्षेत्र सेट करें, और तब छवि अधिग्रहण प्रोग्राम प्रारंभ करें ( सामग्री की तालिका देखें).
  5. छवि अधिग्रहण के बाद, लेजर को बंद करें, नमूना धारक को हटा दें, और जैविक नमूनों को संग्रहीत करें।
  6. ताजा जैविक ऊतकों के लिए, नमूनों को 10% तटस्थ बफ़र्ड फॉर्मेलिन में स्टोर करें।
  7. एफएफपीई माउस मस्तिष्क स्लाइस के लिए, संबंधित एच एंड ई-दाग छवियों को प्राप्त करने के लिए संदर्भ20 में बताए गए प्रोटोकॉल का पालन करते हुए एच एंड ई के साथ दाग।
  8. एक प्रयोगशाला-निर्मित छवि प्रसंस्करण एल्गोरिथ्म का उपयोग करके अधिकतम आयाम प्रक्षेपण छवि का पुनर्निर्माण करने के लिए एकत्र किए गए पीए संकेतों का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें)।

Representative Results

चित्रा 1 उच्च गति यूवी-पीएएम प्रणाली की योजनाबद्धता को दर्शाता है। इस सेटअप में, ऑप्टिकल उत्तेजना और अल्ट्रासोनिक डिटेक्शन पथ एक ही तरफ और नमूने के नीचे हैं, जो एक चिंतनशील मोड और ओपन-टॉप सिस्टम बनाते हैं। इस प्रकार, यह उपयोगकर्ता के अनुकूल है और मोटे नमूनों की इमेजिंग के लिए उपयुक्त है।

चित्रा 2 इमेजिंग के दौरान यूवी-पीएएम सिस्टम के स्कैनिंग प्रक्षेपवक्र को दर्शाता है। प्रत्येक अनुभाग की उप-छवि (उदाहरण के लिए, 5 मिमी x 30 μm का क्षेत्र) पहले एक बिखरे हुए इंटरपोलेशन एल्गोरिथ्म का उपयोग करके उत्पन्न की जाती है, और फिर, एक पूरी छवि (उदाहरण के लिए, 5 मिमी x 5 मिमी का क्षेत्र) कस्टम छवि प्रसंस्करण एल्गोरिथ्म का उपयोग करके सभी उप-छवियों को सिलाई करके प्राप्त की जाती है ( सामग्री की तालिका देखें)।

चित्रा 3A और चित्रा 3B क्रमशः एक FFPE माउस मस्तिष्क स्लाइस की यूवी-पीएएम और एच एंड ई छवियों को दिखाते हैं, जिनमें से दोनों में 5 x 5 मिमी2 का फील्ड-ऑफ-व्यू होता है। छवि प्रसंस्करण एल्गोरिथ्म सामग्री की तालिका में प्रदान किए गए लिंक के माध्यम से Github से पहुँचा जा सकता है. छवि अधिग्रहण का समय 18 मिनट से कम था। चित्र 3C-F चित्र 3A में चिह्नित क्षेत्रों की ज़ूम-इन छवियों को दर्शाता है, जहां व्यक्तिगत सेल नाभिक को स्पष्ट रूप से हल किया जा सकता है। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि संबंधित सेल नाभिक को मानक एच एंड ई-दाग वाली छवियों (चित्रा 3 जी-जे) में पाया जा सकता है, जो सेलुलर इमेजिंग के लिए वर्तमान प्रणाली की उच्च सटीकता दिखाता है। ग्रेस्केल यूवी-पीएएम छवि को वर्चुअल एच एंड ई-दाग वाली छवि में स्थानांतरित करने के लिए, एक गहरी-सीखने वाली एल्गोरिथ्म17 (सामग्री की तालिका देखें) लागू किया गया था, जो 8000 x 8000 पिक्सेल के साथ एक छवि के लिए 30 सेकंड से कम समय लेगा। संबंधित ज़ूम-इन छवियों को चित्र 3K-N में दिखाया गया है। वस्तुतः सना हुआ यूवी-पीएएम छवियां एच एंड ई-दाग वाली छवियों के रूप में लगभग एक ही संरचनात्मक जानकारी प्रदान करती हैं, जो वर्तमान यूवी-पीएएम सिस्टम के नैदानिक अनुवाद के लिए वादा दिखाती हैं।

Figure 1
चित्रा 1: उच्च गति और खुले शीर्ष यूवी-पीएएम प्रणाली की योजनाबद्ध। (ए) सिस्टम सेटअप। (बी) नमूना धारक और एक पानी की टंकी की तस्वीर जो दो-अक्ष मैनुअल चरण से जुड़ी हुई है। (सी) अंगूठी के आकार के अल्ट्रासोनिक ट्रांसड्यूसर पानी की टंकी और नमूना टैंक है कि नमूना धारक के छेद को कवर में तय की तस्वीर. (घ) झिल्ली और नमूने के साथ नमूना टैंक की तस्वीर जो नमूना धारक पर रखी जाएगी। यूवी: पराबैंगनी; DAQ: डेटा अधिग्रहण कार्ड; जीएम: गैल्वेनोमीटर दर्पण. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: इमेजिंग के दौरान यूवी-पीएएम सिस्टम का स्कैनिंग प्रक्षेपवक्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: गहरी सीखने आधारित आभासी धुंधला के साथ यूवी-पीएएम इमेजिंग के प्रयोगात्मक परिणाम। (ए) एक एफएफपीई माउस मस्तिष्क स्लाइस की यूवी-पीएएम छवि। (बी) एक ही स्लाइस की मानक एच एंड ई-सना हुआ छवि। स्केल सलाखों: 1 मिमी (सी-एफ) ज़ूम-इन छवियों में ए में चिह्नित क्षेत्रों की छवियां। (G-J) बी में चिह्नित क्षेत्रों की इसी एच एंड ई-दाग वाली छवियां। (K-N) इसी वस्तुतः एक गहरी सीखने एल्गोरिथ्म का उपयोग कर छवियों दाग. स्केल बार: 50 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Discussion

संक्षेप में, हिस्टोलॉजिकल इमेजिंग के लिए एक उच्च गति और ओपन-टॉप यूवी-पीएएम सिस्टम का प्रदर्शन किया गया है। सिस्टम कॉन्फ़िगरेशन, ऑप्टिकल संरेखण, नमूना तैयारी और प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के बारे में विस्तृत निर्देश प्रस्तुत किए गए हैं। छवि अधिग्रहण कार्यक्रम सामग्री की तालिका में प्रदान की गई लिंक के माध्यम से Github से पहुँचा जा सकता है. वर्तमान प्रणाली का पार्श्व संकल्प ~ 1.2 μm है जिसे हाल ही में प्रकाशन21 में प्रयोगात्मक रूप से मापा गया है। एक माउस मस्तिष्क स्लाइस को यह प्रदर्शित करने के लिए चित्रित किया गया था कि वर्तमान प्रणाली 5 x 5 मिमी2 के क्षेत्र के लिए 18 मिनट के भीतर एक हिस्टोलॉजिकल छवि प्राप्त कर सकती है, जो मस्तिष्क बायोप्सी22 का एक विशिष्ट आकार है। यद्यपि मूल छवि ग्रेस्केल में है, एक गहरी-सीखने के एल्गोरिथ्म द्वारा सक्षम डिजिटल वर्चुअल स्टेनिंग टूल की सहायता से, वर्तमान प्रणाली आगे वास्तविक समय में लगभग दाग वाली छवियां प्रदान कर सकती है, जिससे छवियों की व्याख्या करने के लिए पैथोलॉजिस्ट के लिए आसान अनुकूलन सुनिश्चित किया जा सकता है। एक लेबल-मुक्त छवि तकनीक के रूप में, वर्तमान यूवी-पीएएम प्रणाली भी असंसाधित ताजा ऊतक नमूनों के लिए हिस्टोलॉजिकल छवियां प्रदान कर सकती है। अधिक उदाहरण (जमे हुए-अनुभागित और ताजा ऊतक के नमूनों सहित) पिछले प्रकाशन17 में प्रदर्शित किए गए हैं। प्रयोगात्मक परिणाम एसएमए अनुप्रयोगों में वर्तमान गहरी-सीखने-सहायता प्राप्त यूवी-पीएएम प्रणाली की उच्च क्षमता दिखाते हैं।

यूवी-पीएएम सिस्टम के फायदों में से एक यह है कि सिस्टम को प्रतिबिंब मोड में लागू किया जाता है, जिससे मोटे ऊतकों की इमेजिंग सक्षम होती है। इसके अलावा, ओपन-टॉप यूवी-पीएएम सिस्टम नमूने को स्कैनिंग विंडो (नमूना टैंक की झिल्ली) पर रखने की अनुमति देता है, जिसमें पारंपरिक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के समान ऑपरेशन होता है। इसलिए, यह प्रणाली अन्य प्रणालियों की तुलना में अधिक उपयोगकर्ता के अनुकूल है, जिसके लिए नमूनों को दो झिल्ली11,14 द्वारा सैंडविच करने की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, एक उच्च-पुनरावृत्ति-दर यूवी लेजर के साथ 1 डी जीएम का उपयोग करके, वर्तमान यूवी-पीएएम सिस्टम मल्टीफोकल उत्तेजना23 का उपयोग करके सिस्टम की तुलना में उच्च लागत-प्रभावशीलता के साथ उच्च इमेजिंग गति प्राप्त कर सकता है।

वर्तमान में, इमेजिंग गति मुख्य रूप से लेजर और फोटॉन बजट की पुनरावृत्ति दर से सीमित है। एक लेजर के साथ जिसमें उच्च पुनरावृत्ति दर और उच्च नाड़ी ऊर्जा होती है, इमेजिंग समय को और छोटा किया जा सकता है। सिस्टम की एक और सीमा यह है कि नमूने को केवल अधिकतम पीए संकेतों को खोजकर उद्देश्य लेंस के फोकल प्लेन में मोटे तौर पर समायोजित किया जा सकता है, बजाय उपयोगकर्ताओं के लिए एक वास्तविक समय की छवि प्रदर्शित करने के लिए कि नमूना फोकस में है या नहीं। एक निकट वास्तविक समय छवि प्रदर्शित करने के लिए, 2 डी जीएम लागू किया जा सकता है।

प्रोटोकॉल में दो महत्वपूर्ण चरण हैं: (ए) ऑप्टिकल और ध्वनिक फोकी की कॉन्फोकल आवश्यकता को उच्च पहचान संवेदनशीलता प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए; (बी) एक्स-अक्ष पर जीएम की स्कैनिंग रेंज समान उच्च पहचान संवेदनशीलता को बनाए रखने के लिए रिंग के आकार के यूटी के ध्वनिक फोकल स्पॉट से छोटी होनी चाहिए (वर्तमान सेटअप में, स्कैनिंग रेंज ~ 30 μm ±15 μm) है)। अन्यथा, किनारों के चारों ओर स्पष्ट विगनेटिंग प्रभाव तब होगा जब एक पूरी छवि प्राप्त करने के लिए कई उप-छवियों को एक साथ सिला जाता है।

Disclosures

T. T. W. W. और V. T. C. T. PhoMedics Limited में वित्तीय रुचि रखते हैं, जो हालांकि, इस काम का समर्थन नहीं करता था। लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

लेखक हांगकांग नवाचार और प्रौद्योगिकी आयोग (ITS/ 036/19) से वित्तीय सहायता को स्वीकार करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alcohol Sigma Aldrich PHR1373 Sample dehydration
Amplifier Mini Circuit ZFL-500LN-BNC+ Ultrasonic signal amplification
Controller National Instruments NI myRIO System controller
Data acquisition card Alazar Technologies ATS9350 Ultrasonic signal collection
Deep-learning algorithm For transfering the grayscale UV-PAM image to a virtual H&E-stained image; https://github.com/TABLAB-HKUST/Deep-PAM
Formalin Sigma Aldrich R04586 Sample fixation
H&E staining kit Abcam ab245880 Sample staining
Histo-Clear II National Diagnostics HS-202 Sample deparaffinization
Image acquisition program National Instruments LabVIEW Lab-built program using LabVIEW; https://github.com/TABLAB-HKUST/LabVIEW-program-for-UV-PAM
Image processing algorithm Mathworks MATLAB Lab-built algorithm using MATLAB; https://github.com/TABLAB-HKUST/ImageRec_GM-UVPAM
Kinematic platform mounts Thorlabs KM200B Adjust the sample to be flat
Membrane Glad Cling wrap Sandwiched in sample tank
Microscope objective lens Thorlabs LMU- 5X-NUV Objective lens
Motorized stages Physik Instrumente L-509.10SD00 Scanning stages
One-dimensional galvanometer mirror Thorlabs GVS411 Fast scanning mirror
Oscilloscope RIGOL Technologies DS1102E Ultrasonic signal readout
Phosphate-buffered saline Sigma Aldrich P3813 Sample washing
Pinhole Edmund Optics #59–257 Spatial filtering
Plano convex lens Thorlabs LA-4600-UV Focusing lens
Plano convex lens Thorlabs LA-4663-UV Collimating lens
Pulser/receiver Imaginant DPR300 Pulse echo amplifier
Q-switch diode-pumped solid-state laser Bright Solutions WEDGE HF 266 nm 266-nm laser
Ring-shaped ultrasonic transducer University of Southern California Ultrasonic signal detection
Sample holder Lab-made Hold the sample tank
Sample tank Lab-made Hold biological samples
Single-axis Z-translational stage Thorlabs PT1 Manual stage
Two-axis manual stage Thorlabs LX20 Manual stage
Water tank Lab-made Ultrasonic signal transmission
Xylene Sigma Aldrich XX0060 Sample clearing

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kunos, C., et al. Breast conservation surgery achieving ≥ 2 mm tumor-free margins results in decreased local-regional recurrence rates. The Breast Journal. 12, 28-36 (2006).
  2. Rosai, J. Why microscopy will remain a cornerstone of surgical pathology. Laboratory Investigation. 87 (5), 403-408 (2007).
  3. Yang, J., Caprioli, R. M. Matrix sublimation/recrystallization for imaging proteins by mass spectrometry at high spatial resolution. Analytical Chemistry. 83 (14), 5728-5734 (2011).
  4. Jaafar, H. Intra-operative frozen section consultation: concepts, applications and limitations. The Malaysian Journal of Medical Sciences: MJMS. 13 (1), 4 (2006).
  5. Rastogi, V., et al. Artefacts: a diagnostic dilemma - a review. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 7 (10), 2408-2413 (2013).
  6. Carrasco-Zevallos, O. M., et al. Review of intraoperative optical coherence tomography: technology and applications [Invited]. Biomedical Optics Express. 8 (3), 1607 (2017).
  7. Gareau, D. S., Jeon, H., Nehal, K. S., Rajadhyaksha, M. Rapid screening of cancer margins in tissue with multimodal confocal microscopy. Journal of Surgical Research. 178 (2), 533-538 (2012).
  8. Fereidouni, F., et al. Microscopy with ultraviolet surface excitation for rapid slide-free histology. Nature Biomedical Engineering. 1 (12), 957-966 (2017).
  9. Tanaka, N., et al. Whole-tissue biopsy phenotyping of three-dimensional tumours reveals patterns of cancer heterogeneity. Nature Biomedical Engineering. 1 (10), 796-806 (2017).
  10. Jain, M., et al. Multiphoton microscopy: A potential intraoperative tool for the detection of carcinoma in situ in human bladder. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 139 (6), 796-804 (2015).
  11. Orringer, D. A., et al. Rapid intraoperative histology of unprocessed surgical specimens via fibre-laser-based stimulated Raman scattering microscopy. Nature Biomedical Engineering. 1 (2), 0027 (2017).
  12. Wong, T. T. W., et al. Fast label-free multilayered histology-like imaging of human breast cancer by photoacoustic microscopy. Science Advances. 3 (5), 1602168 (2017).
  13. Shen, C. -H. Detection and analysis of nucleic acids. Diagnostic Molecular Biology. , 167-185 (2019).
  14. Yao, J., Wang, L. V. Photoacoustic microscopy. Laser & Photonics Reviews. 7 (5), 1-36 (2012).
  15. Li, X., Kang, L., Zhang, Y., Wong, T. T. W. High-speed label-free ultraviolet photoacoustic microscopy for histology-like imaging of unprocessed biological tissues. Optics Letters. 45 (19), 5401 (2020).
  16. Baik, J. W., et al. Intraoperative label-free photoacoustic histopathology of clinical specimens. Laser & Photonics Reviews. 15 (10), 2100124 (2021).
  17. Kang, L., Li, X., Zhang, Y., Wong, T. T. W. Deep learning enables ultraviolet photoacoustic microscopy based histological imaging with near real-time virtual staining. Photoacoustics. 25, 100308 (2022).
  18. Sterile Tissue Harvest | Protocol. , Available from: https://www.jove.com/science-education/10298/sterile-tissue-harvest (2022).
  19. Steps to Tissue Processing for Histopathology. , Available from: https://www.liecabiosystems.com/knowledge-pathway/an-introduction-to-specimen-processing/ (2022).
  20. An Intro to H&E Staining: Protocol, Best Practices, Steps & More. , Available from: https://www.liecabiosystems.com/knowledge-pathway/he-staining-overview-a-guide-to-best-practices/ (2022).
  21. Li, X., et al. Ultraviolet photoacoustic microscopy with tissue clearing for high-contrast histological imaging. Photoacoustics. 25, 100313 (2022).
  22. Leinonen, V., et al. Assessment of β-amyloid in a frontal cortical brain biopsy specimen and by positron emission tomography with carbon 11-labeled pittsburgh compound B. Archives of Neurology. 65 (10), 1304-1309 (2008).
  23. Imai, T., et al. High-throughput ultraviolet photoacoustic microscopy with multifocal excitation. Journal of Biomedical Optics. 23 (03), (2018).

Tags

Bioengineering अंक 182
उच्च गति पराबैंगनी Photoacoustic माइक्रोस्कोपी आभासी के साथ हिस्टोलॉजिकल इमेजिंग के लिए धुंधला गहरी सीखने द्वारा सहायता प्राप्त
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, X., Kang, L., Lo, C. T. K.,… More

Li, X., Kang, L., Lo, C. T. K., Tsang, V. T. C., Wong, T. T. W. High-Speed Ultraviolet Photoacoustic Microscopy for Histological Imaging with Virtual-Staining assisted by Deep Learning. J. Vis. Exp. (182), e63649, doi:10.3791/63649 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter