Summary
يتم توفير طرق للتحريض البسيط والسريع لنموذج آلام الظهر في الفئران هنا باستخدام حقن داخل الرباط لمنشط البلازمينوجين البولي.
Abstract
يمكن إحداث نموذج لآلام أسفل الظهر المستمرة في الفئران باستخدام المنهجية البسيطة الموضحة هنا. يتم توفير طرق خطوة بخطوة للتحريض البسيط والسريع لنموذج آلام الظهر المستمرة في الفئران هنا باستخدام حقن منشط البلازمينوجين من نوع urokinase (urokinase) ، وهو بروتياز سيرين موجود في البشر الأخرى. تتضمن منهجية تحريض آلام أسفل الظهر المستمرة في الفئران حقنا بسيطا من urokinase على طول منطقة الإدخال الرباطي للعمود الفقري القطني. ينشط عامل التهاب اليوروكيناز البلازمينوجين إلى البلازمين. عادة ، يمكن تحفيز النموذج في غضون 10 دقائق ويستمر فرط الحساسية لمدة 8 أسابيع على الأقل.
يمكن اختبار فرط الحساسية واضطراب المشي وغيرها من التدابير القياسية الشبيهة بالقلق والاكتئاب في النموذج المستمر. آلام الظهر هي أكثر أنواع الألم انتشارا. لتحسين الوعي بآلام الظهر ، أطلقت الرابطة الدولية لدراسة الألم (IASP) على عام 2021 "السنة العالمية لآلام الظهر" و 2022 "السنة العالمية لترجمة معرفة الألم إلى ممارسة". أحد قيود التقدم العلاجي لعلاجات الألم هو عدم وجود نماذج مناسبة لاختبار الألم المستمر والمزمن. ميزات هذا النموذج مناسبة لاختبار العلاجات المحتملة التي تهدف إلى الحد من آلام الظهر وخصائصها المساعدة ، مما يساهم في تسمية IASP 2022 باعتباره العام العالمي لترجمة معرفة الألم إلى ممارسة.
Introduction
آلام أسفل الظهر هي واحدة من أكثر أسباب الإعاقة شيوعا حيث يعاني 1 من كل 5 أشخاص في جميع أنحاء العالم1. على الرغم من هذه الجهود ، هناك عدد قليل من النماذج الحيوانية الموثوقة لآلام الظهر المستخدمة بشكل شائع في الأبحاث الحيوانية في مجال الألم ، وخاصة في الفئران. استخدمت النماذج السابقة بشكل حصري تقريبا الفئران لتحريض آلام الظهر المزمنة (CBP) مثل تلك التي يسببها حقن منشط البلازمينوجين البولي (uPA) في مفصل الوجه القطني 2,3 ، أو حقن عامل نمو الأعصاب (NGF) في عضلات الجذع4 ، أو يودواسيتات أحادي الصوديوم (MIA) 5 أو إنترلوكين -1بيتا6 الحقن في القرص الفقري. بالطبع ، تفضل الفئران لهذه النماذج ويرجع ذلك أساسا إلى حجمها الأكبر وسهولة الوصول لحقن العوامل الالتهابية.
لكي نكون واضحين ، توجد نماذج فأر لآلام الظهر مثل نموذج الفأر SPARC-null لتنكس القرص الفقري المستخدم لسنواتعديدة 7 ، ولكن هذه أكثر تكلفة وتستغرق وقتا طويلا في إنشائها من النماذج القائمة على الحقن. أنشأت دراسة حديثة على الفئران نموذجا لآلام أسفل الظهر من خلال الجمع بين حقن NGF في عضلات أسفل الظهر مع إجهاد ضبط النفس المزمنالرأسي 8. في البروتوكول التالي ، قمنا بتكييف نموذج CBP الناجم عن uPA من الفئرانللفئران 2. يتم تأسيس فرط الحساسية في غضون 1 أسبوع ويستمر حتى 6-8 أسابيع. بالإضافة إلى ذلك ، أثبتنا أن الفئران تطور سلوكيات تشبه القلق والاكتئاب. نظرا لانتشار آلام الظهر والاستخدام الأكثر شيوعا للفئران في أبحاث الألم الجزيئي ، تم إنشاء هذا النموذج المتين بسهولة للاستخدام في تطوير استراتيجيات علاج جديدة لتخفيف آلام الظهر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع الإجراءات الحيوانية الموصوفة تتوافق مع دليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر. تمت الموافقة على الدراسات من قبل لجنة الرعاية المؤسسية والاستخدام المحلية (IACUC # 23-201364-HSC) التابعة لمركز العلوم الصحية بجامعة نيو مكسيكو. تتوافق جميع الدراسات مع السياسات تحت رعاية ضمان الامتثال OLAW (A3002-01) بشأن استخدام في البحث ، كما هو موضح في الجزء الثالث. II. الضمانات والشهادات. يتم إيواء في مرفق إسكان مركز الموارد الحيوانية (ARC) الذي يديره موظفو المختبر وموظفو قسم المختبرات والموارد الحيوانية (DLAR). طريقة القتل الرحيم (100 ميكرولتر من حقن بنتوباربيتال 59 مجم / مل) سريعة وموثوقة وتسمح بتشريح وجمع الأنسجة المختلفة لمزيد من البحث.
1.
- منزل بالغ (~ 3-4 أسابيع من العمر) ذكور وإناث BALB / c الفئران (20-25 جم) على عكس 12 ساعة: 12 ساعة دورة الضوء: الظلام ، لذلك يحدث وقت نشاطهم في الظلام أثناء ساعات العمل في المختبر.
ملاحظة: سيسمح هذا بتقييم جميع المعلمات خلال الوقت الطبيعي النشط للحيوانات لأن القوارض ليلية بشكل طبيعي. هذا يقلل من مساهمة التعديلات في الساعة البيولوجية بحيث يمكن اختبار خلال وقتها النشط الذي أصبح الآن نهارا. - مراقبة مرتين يوميا.
- حافظ على الفئران على تشاو مربي الفئران العادي ، وهو أقل في محتوى بروتين الصويا مقارنة بتشاو القوارض القياسي (المعروف بتغيير فرط الحساسية) إذا كان تقييم آثار الدواء على السلوكيات المرتبطة بالألم.
- وزن مرة واحدة في الأسبوع لضمان الحفاظ على زيادة الوزن الصحية.
ملاحظة: لم يلاحظ أي اختلافات جماعية في الوزن خلال الدراسات التي استمرت 8-10 أسابيع ، مما سمح بدراسة التعمية.
2. نموذج التعريفي
- قم بإجراء تحريض النموذج على سطح مستو معقم دافئ مزود بوسيلة لربط قيود التثبيت لتثبيت الماوس في مكانه (الشكل 1 أ). إجراء الجراحة باستخدام مجهر تشريح على سطح معقم.
ملاحظة: استخدم غطاء دخان من الدرجة الكيميائية في حالة عدم توفر التقاط التخدير. - استخدم الحرير الجراحي أو حتى الغزل بأشرطة مطاطية معقودة في نهاية الخيوط المعلقة بالحواف المضلعة للوحة كقيود في حالة استخدام لوحة القاعدة الموصى بها في جدول المواد.
- ضع محطة استعادة وسادة التدفئة على سطح مجاور لإعداد الجراحة لنقل الفئران إلى المحطة مباشرة بعد الحقن (الشكل 1 ب).
ملاحظة: ضع قفص مبيت فارغ على وسادة التدفئة قبل 10 دقائق على الأقل من الحقن للسماح للقفص بالتسخين إلى درجة حرارة مريحة (37 درجة مئوية). ضع نصف القفص من الوسادة ، للسماح للماوس المستيقظ بتفضيل درجات حرارة الاسترداد. - تحضير urokinase تمييعه في الماء المعقم. الكحول تنظيف حقنة هاميلتون وشطف في الماء المعقم. ارسم المحلول مقدما حتى يكون الماوس تحت التخدير لأقصر وقت ممكن. استخدام 5 ميكرولتر من 2 ملغ / مل منشط البلازمينوجين البولي للنموذج ؛ بالنسبة للشمس ، استخدم 5 ميكرولتر من المحلول الملحي المعقم.
- قم بإعداد محطة التخدير isoflurane على مستوى 4٪ أو أقل لهذا الإجراء القصير. ضع الماوس في غرفة الحث ؛ عادة ، يتباطأ معدل التنفس السريع للفأر في غضون 1-2 دقيقة ، وينتقل من حركة الصدر العلوية إلى أسفل الصدر.
- استخدم مستوى أكسجين يبلغ 1.5 لتر / دقيقة وعلبة فحم نشط F أو اعمل تحت تدفق بيولوجي أو غطاء إخلاء علوي لفرك الأيزوفلوران لتجنب التعرض لجراح. إذا لم يكن متاحا ، فقم بتنفيذ الإجراء في غطاء أمان كيميائي.
- قم بتبديل تدفق الماوس والمخدر بسرعة إلى منطقة الجراحة على وسادة تسخين 37 درجة مئوية ، ووضع أنف الفأر في مخروط الأنف للحفاظ على مستوى التخدير (الشكل 1 ج ، د). تحقق للتأكد من أن الماوس لا يحتوي على حركة انعكاسية لقرص إصبع القدم ثم قم بتقييد الماوس على لوحة القاعدة.
ملاحظة: إذا كانت هناك حركة على الإطلاق ، فضع الماوس مرة أخرى في غرفة الحث وكرر ذلك. - نظف منطقة الجلد الخلفي بمسحة كحولية. اضبط إضاءة LED حسب الحاجة للحصول على رؤية واضحة لظهر الماوس المخدر.
ملاحظة: إذا لزم الأمر ، استخدم ماكينة حلاقة كهربائية لإزالة الشعر من ظهر الماوس حتى يكون هناك رؤية خالية من العوائق لحواف العمود الفقري تحت الجلد. إذا تم حلق الفئران التجريبية ، فقم أيضا بحلق ظهر الفئران الساذجة والوهمية لدراسة العمى. - حقن الماوس أثناء تخديره بالكامل وشل حركته (بدون رد فعل تصحيح وسحب قرصة إصبع القدم). استخدم إصبعين لتشعر بلطف بالمكان الذي يلتقي فيه الجزء السفلي من القفص الصدري للماوس بالعمود الفقري (الشكل 2 أ). تحت هذه النقطة هي قطاعات العمود الفقري الخشبي. تهدف الحقن هنا في L2-L3.
- ضع طرف حقنة هاملتون بجوار العمود الفقري (الشكل 2B ، C). وجه المحقنة بزاوية ~ 45 درجة إلى الرباط بين الشوكة المجاور للعظم مباشرة.
ملاحظة: اعتمادا على صلابة جلد الماوس ، يمكن أن يعمل الاعتماد أحيانا على الجاذبية بدلا من الضغط النشط وزاوية 90 درجة بشكل أفضل. - أدخل طرف الإبرة برفق ولكن بثبات في الرباط بين الشوكة (الشكل 3B ، C).
ملاحظة: الهدف ليس اختراق تجويف البطن ولكن حقن الرباط. - أفرغ محتويات الإبرة ببطء. إذا كان هناك سائل في أي وقت عند الطرف ، فإن الإبرة ليست من خلال الجلد. استمر حتى يتم حقن كل 5 ميكرولتر.
- امسك الإبرة في مكانها لمدة ~ 5 ثوان لمنع التدفق العكسي من الحقن. يوصى باستخدام الصبغة الزرقاء في التجارب التجريبية النهائية أو الحادة.
ملاحظة: إذا تم القيام به بشكل صحيح ، يجب أن ينتشر السائل في الرباط كما هو موضح (الشكل 3 أ). - قم بإزالة الإبرة برفق وببطء. تأكد من عدم وجود دم أو إفرازات.
- ضع الماوس في محطة استرداد الحرارة مع أعلى القفص حتى يستيقظ ويكون متحركا قبل إعادته إلى القفص المنزلي.
ملاحظة: بافتراض أن الإجراء قد تم تنفيذه بسرعة ، يجب ألا يستغرق أكثر من دقيقة قبل استيقاظ الماوس. - تحقق من الفئران خلال 1 ساعة بعد الجراحة لضمان استمرار جميع الوظائف الحركية الطبيعية كإجراء وقائي.
ملاحظة: إذا تم القيام به بشكل صحيح ، يجب ألا يكون هناك أي مضاعفات من هذا الإجراء. - افحص الفئران يوميا للأسبوع التالي للجراحة ، بما في ذلك تقييم الوزن وفحص موقع الحقن للتأكد من عدم حدوث عدوى أو مضاعفات. لا تستخدم الماوس لمزيد من التجارب إذا كان هناك تغيير في السلوك ، مثل فقدان الوزن والخمول.
الشكل 1: إعداد تحريض urokinase CBP. (أ) صفيحة أدوات العلوم الدقيقة الموصى بها لجراحات الفئران. يمكن أن تحتوي الحواف المضلعة على خيط معلق عليها لتثبيت الماوس في مكانه. (ب) محطة الاسترداد. يوصى باستخدام قفص سكني فارغ ، نصفه على وسادة التدفئة ، ونصفه الآخر. يتم وضع قطعة قماش نظيفة في الأسفل لمنح الماوس منطقة راحة مريحة. (ج) توصية إعداد آلة التخدير. باستخدام نظام توصيل ثنائي القناة ، قم بإعداد خرطوم واحد إلى غرفة الحث وآخر إلى محطة الجراحة. (د) منظر لمساند الفأر. يتم عقد خيطين على الحواف المضلعة للوحة القاعدة ، ثم يتم سحبهما برفق عبر عنق الماوس ومؤخرته على التوالي. تأكد من عدم تقييد الماوس بإحكام شديد حتى يتمكن من التنفس بشكل طبيعي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحريض حقن اليوروكيناز في CBP. (أ) منظر لوضع موقع الحقن. كما هو موضح ، تحسس بالأصابع للعثور على الجزء السفلي من القفص الصدري للماوس للحصول على نقطة مرجعية ل L4-L5. (ب) منظر لعملية الحقن، يوضح زاوية الحقن المناسب. (ج) يفضل هنا استخدام زاوية 45 درجة، ولكن اضبطها حسب الحاجة لضمان وصول الإبرة إلى المكان الذي تحتاج إليه. إذا لزم الأمر ، احلق موقع الحقن للحصول على تصور أفضل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: رسم تخطيطي لموقع الحقن. أ: صورة فوتوغرافية لموقع موقع الحقن. يستخدم الحبر هنا للإشارة إلى مكان دخول السائل إلى الرباط بين الفقرات L2 و L3. (ب) شكل يوضح الموضع الصحيح للإبرة وموقع موقع الحقن، موضحا من منظر جانبي. ج: شكل يوضح منظرا من أعلى لأسفل للفقرات، ومواقع حقن الأربطة بين الشوكة. عادة ما تكون الحقن على الأربطة بين الشوكة بجوار العمود الفقري ، ولكن يمكن إدخال الإبرة في الفراغ بين الفقرات والفقرات المستعرضة أيضا. يوصى باستخدام الصبغة الزرقاء في التجارب التجريبية كما هو موضح في (أ). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
3. المقايسات السلوكية
- اختبار عتبة استجابة رد الفعل الميكانيكي فون فراي
ملاحظة: عتبة السحب الميكانيكية هي الحد الأدنى من القوة اللازمة لاستنباط استجابة بنسبة 50٪ من الوقت مع سلسلة من 8 خيوط أحادية فون فراي متدرجة في القطر مع زيادة ~ 0.2 جم ، مما يوفر تغييرات خطوة السجل في القوة الميكانيكية (جدول المواد).- اختبار التحفيز الميكانيكي مع ألياف فون فراي المطبقة على backdpaw ، منطقة التعصيب للأعصاب القطنية العجزية. تحديد قيم انسحاب المخلب الأساسية قبل الجراحة. بعد الجراحة ، حدد العتبة الميكانيكية مرة واحدة في الأسبوع أثناء التجربة المزمنة.
- نقل من غرفة السكن والتأقلم معها في غرفة الاختبار لمدة 30 دقيقة في أقفاص منازلهم قبل الاختبار. من هناك ، حرك لتقييدها بشكل فردي في مقصورات صغيرة شفافة على طاولة الاختبار المغطاة بالشاشة لمدة 15-20 دقيقة حسب مستوى نشاطها.
ملاحظة: يمكن أن يبدأ الاختبار بعد أن تستقر الفئران في وضع الراحة ولا تدور وتتحرك في الغرفة. يقلل التأقلم مع حجرة التقييد من التأثيرات الناجمة عن الإجهاد. إذا تم الحفاظ على الفئران في دورة الضوء العكسي ، فيجب إجراء الاختبار في ظل ظروف الضوء الأحمر. - تابع الاختبار باستخدام سلسلة متدرجة من ألياف فون فراي كما هو موضح أدناه وفي Chaplan et al.9.
- دقق في وسادة القدم في مكان ثابت على كل باستخدام خيوط 3.61 فون فراي والتي عند ثنيها تثير قوة 0.4 جم (جدول المواد). اتبعه بالتحفيز باستخدام خيوط 4.08 von Frey التي تثير قوة 1.0 g .
ملاحظة: لا يثير أي من هذه الألياف استجابات في الساذجة والمتأقلمة. - ضع كل خيوط 5x على فترات >5 ثانية بشكل عمودي على وسادة القدم ، مع الحرص على عدم لمس الطي / الشق أو الشعر. الاستجابة الإيجابية هي انسحاب القدم إلى ثلاثة من خمسة محفزات. ضع الفتيل الأضعف التالي في السلسلة حتى لا يستجيب للتحفيز الميكانيكي ؛ عند هذه النقطة ، استخدم الخيوط الأعلى التالية. إذا أثار استجابة ، استخدم الفتيل السفلي مرة أخرى حتى يتم تطبيق أربع تجارب بعد تغيير الاستجابة للتحفيز الميكانيكي لوسادة القدم.
- استخدم نمط الاستجابة الناتج لحساب عتبة السحب الميكانيكية ، وهو الحد الأدنى من القوة اللازمة لاستنباط استجابة بنسبة 50٪ من الوقت ، باستخدام خوارزمية تركيب المنحنى9. يشير انخفاض القوة المطلوبة لاستنباط استجابة انسحاب القدم مقارنة بالفئران الساذجة أو خط الأساس الخاص بالحيوان إلى زيادة حساسية.
- دقق في وسادة القدم في مكان ثابت على كل باستخدام خيوط 3.61 فون فراي والتي عند ثنيها تثير قوة 0.4 جم (جدول المواد). اتبعه بالتحفيز باستخدام خيوط 4.08 von Frey التي تثير قوة 1.0 g .
- اختبار عتبة استجابة المنعكس الحراري
ملاحظة: يتم التحقق من عتبات الاستجابة للحرارة والبرودة من خلال اختبارات Hargreaves واللوحة الباردة ، على التوالي.- اختبار هارجريفز
- ضع الفئران في مقصورات على سطح زجاجي يتم تسخينه باستخدام باعث الأشعة تحت الحمراء من الأسفل. سجل زمن الوصول لسحب القدم كوقت بالثواني من تطبيق محفز ضوء الأشعة تحت الحمراء (50 درجة مئوية) الذي يوفره الجهاز على مخلب الفأر الخلفي حتى الانسحاب من التحفيز.
- اختبار اللوحة الباردة
- ضع الفئران على جهاز اللوحة الباردة المبردة إلى -9 درجة مئوية. سجل زمن الوصول لسحب القدم كوقت بالثواني من وضع الماوس على الجهاز حتى يبدأ الماوس في رفع قدمه.
- بدلا من ذلك ، ضع مسبارا باردا مبردا إلى -9 درجة مئوية أسفل مخلب الفأر الخلفي أثناء وضع الماوس في قفص فوق شبكة سلكية. سجل زمن الانتقال للانسحاب كوقت بالثواني من وضع الجهاز تحت المخلب الخلفي حتى يبدأ الماوس في رفع القدم أو لعقها أو اهتزازها. لتجنب إثارة استجابة مسبب للألم ، تأقلم الفأر مع لمسه بواسطة المسبار في درجة حرارة الغرفة.
- اختبار هارجريفز
- المقايسات السلوكية المعتمدة على الإدراك والعاطفة
ملاحظة: فرط الحساسية طويل الأمد في ينتج عنه خلل وظيفي عاطفي ومعرفي. يتم قياسها عادة مرة واحدة فقط في الأسبوع 6 بعد تحريض نموذج الألم لتجنب آثار الممارسة.- اختبارات القلق
ملاحظة: يمكن أيضا اختبار القلق والاكتئاب بشكل موثوق للتأكد من فعالية النموذج. من الأفضل الانتظار حتى أسابيع 4-6 على الأقل بعد الحقن التعريفي للسماح للأمراض المصاحبة بالتطور. تفضيل الظلام بدلا من غرفة الضوء هو مقياس للقلق المرتبط بالألم. في اختبار المتاهة صفر أو زائد ، تقضي الفئران النموذجية للألم وقتا أقل في الأرباع المفتوحة مقارنة بالحيوانات الساذجة ، وهو عرض للسلوك الشبيه بالقلق10,11.- اختبار تفضيل المكان الفاتح / الداكن: ضع كل في صندوق اختبار تفضيل المكان مع ممر بين غرفتين (10 × 10 × 10 سم3). غرفة واحدة من الجهاز مضاءة بشكل مشرق ، بينما يظل الجانب الآخر مظلما. خلال كل اختبار مدته 10 دقائق ، راقب موقع عن طريق الكمبيوتر لتحديد أوقات إشغال الضوء والظلام وعدد الانتقالات.
ملاحظة: بدلا من ذلك ، قم بتركيب كاميرا فيديو فوق غرفة الاختبار وقم بتسجيل الوقت المستغرق في كل غرفة يدويا. - متاهات مرتفعة زائد أو صفر: ضع القوارض النموذجية أو الساذجة على المتاهة واستخدم ساعة توقيت لتقييم الوقت الذي يقضيه في الأجزاء المغلقة من المتاهة. حدد الوقت المستغرق في المنطقتين "الآمنتين" المسورة ومنطقتين مفتوحتين "غير آمنتين". مع الألم تفضل المناطق الآمنة المغلقة.
ملاحظة: يمكن اختبار السلوك الشبيه بالقلق إما في متاهة صفر أو زائد (10 دقائق). متاهة الصفر هي مسار دائري على عكس متاهة زائد ، وهي "على شكل علامة زائد". كلاهما يحتوي على ربعين مفتوحين واثنين من الربعين المغلقين اللذين يسمحان بالسلوك الاستكشافي المستمر. كلاهما مرتفع 1 متر عن الأرض ، إما ممر دائري أو زائد الشكل مقسم إلى أربعة أرباع متساوية الحجم.
- اختبار تفضيل المكان الفاتح / الداكن: ضع كل في صندوق اختبار تفضيل المكان مع ممر بين غرفتين (10 × 10 × 10 سم3). غرفة واحدة من الجهاز مضاءة بشكل مشرق ، بينما يظل الجانب الآخر مظلما. خلال كل اختبار مدته 10 دقائق ، راقب موقع عن طريق الكمبيوتر لتحديد أوقات إشغال الضوء والظلام وعدد الانتقالات.
- اختبار الاكتئاب سكروز سبلاش
ملاحظة: يستخدم اختبار رش السكروز لتحديد السلوك الشبيه بالاكتئاب. يسمح اختبار البداية بقياس عدم وجود سلوك استمالة طبيعي كعرض من أعراض الاكتئاب الناتج عن الألم المزمن.- سجل تكرار ومدة وزمن انتقال الاستمالة لمدة 10 دقائق بعد رش محلول السكروز بنسبة 10-30٪ على الغلاف الظهري (~ 250 ميكرولتر بالقرب من قاعدة الذيل). وقد أعمى المراقبون عد عدد مناورات الاستمالة من تسجيلات أشرطة الفيديو12.
ملاحظة: تم الإبلاغ عن تأثر هذا المؤشر في نماذج القوارض لاضطرابات المزاج ، مثل الإجهاد الخفيف المزمن ، ويتم تصحيحه عن طريق العلاج المزمن المضادللاكتئاب 13.
- سجل تكرار ومدة وزمن انتقال الاستمالة لمدة 10 دقائق بعد رش محلول السكروز بنسبة 10-30٪ على الغلاف الظهري (~ 250 ميكرولتر بالقرب من قاعدة الذيل). وقد أعمى المراقبون عد عدد مناورات الاستمالة من تسجيلات أشرطة الفيديو12.
- اختبار كائن جديد
ملاحظة: يمكن قياس الخلل المعرفي باستخدام اختبار الكائن الجديد.- تأقلم الفئران بشكل فردي مع قفص بلاستيكي شفاف مع قمة مفتوحة (56 × 30 × 20 سم) لمدة 1 ساعة. أضف شخصيتين صغيرتين متطابقتين في زوايا متقابلة من القفص لمدة 5 دقائق.
- في يوم الاختبار ، تأقلم مع القفص الصافي مرة أخرى لمدة 1 ساعة قبل وضع الشكلين الصغيرين المتطابقين في نفس مواضع القفص لمدة 5 دقائق قبل إعادتهما إلى القفص المنزلي.
- استبدل أحد الأشكال الأصلية بكائن جديد مختلف تماما ، وأعد الفئران إلى قفص الاختبار بعد 4 ساعات ، وسجل الوقت المستغرق في استكشاف الكائنات.
- احسب مؤشر التعرف (RI) المبلغ عنه باعتباره النسبة المئوية للوقت المستغرق في استكشاف الكائن الجديد لإجمالي وقت استكشافالكائن 14.
- تقييم الوظيفة الحركية
ملاحظة: يقوم اختبار حركة بقع الحبر واضطراب المشي15 بتقييم الوظيفة الحركية في نموذج آلام الظهر.- قم ببناء نفق من أنبوب منشفة ورقية مقطوع بالطول على حافة واحدة. انشر النفق على قطعة نظيفة من ورق الطابعة.
- امسك الفئران ملفوفة برفق في منشفة حتى تهدأ. ضع الكفوف على وسادة طوابع مبللة بحبر هندي غير سام لتغطيتها بالحبر أو طلاء الحبر الموجود أسفل أقدام الماوس باستخدام قطعة قطن. حرر الفئران عند مدخل النفق واتركها تمر عبر النفق ، والتقاطها في النهاية.
- سجل مطبوعات الكفوف بناء على ثلاثة معلمات: طول الخطوة (المسافة الرأسية من النهاية الخلفية لطباعة واحدة إلى أخرى) ، وعرض الخطوة (المسافة الأفقية بين المطبوعات) ، وانتشار إصبع القدم (المسافة بين أصابع القدم على الجانبين المتقابلين من المخلب).
ملاحظة: يمكن أيضا استخدام المكافآت المعتمدة لتشجيع الماوس على المرور عبر النفق. إذا كانت بصمات الكفوف ملطخة أو غير واضحة ، فيجب تكرار التجربة.
- اختبارات القلق
الشكل 4: فرط الحساسية الميكانيكية والحرارية بعد تحريض CBP. يمكن قياس الألم بعد أسبوع من تحريض النموذج ويستمر لمدة 8 أسابيع. (أ) اختبار فون فراي. يتم إجراء اختبار العتبة الميكانيكية باستخدام خيوط فون فراي المطبقة على وسادة القدم من خلال طاولة علوية شبكية بطريقة أعلى لأسفل كما هو موضح هنا على مدار 4 أسابيع. يتم إخفاء عتبة الذكور الساذجة (الخضراء) تحت الخط الأزرق للفئران الإناث الساذجة. أظهرت فئران CBP (ن = 4 ذكور ، 4 إناث) زيادة كبيرة في الحساسية الميكانيكية مقارنة بالضوابط الساذجة (ن = 2 ذكور ، 2 إناث). تم إجراء ANOVA ثنائي الاتجاه (اختبار مقارنات Dunnett المتعددة) على هذه البيانات: n = 4 لكل مجموعة. في التحليلات اللاحقة ، أسفر تعديل Bonferroni لجميع قيم P للمقارنات الأسبوعية ل CBP مقابل Naïve عن جميع القيم ال 11 < 0.0011. ص < 0.0001. ب: اختبار هارجريفز. تم اختبار عتبة الحرارة على وسادة القدم باستخدام اختبار Hargreaves (50 درجة مئوية). أظهرت فئران CBP (ن = 12 ذكرا و 12 أنثى) زيادة كبيرة في الحساسية للحرارة مقارنة بالضوابط الساذجة (ن = 6 ذكور و 6 إناث). تم إجراء اختبار Mann-Whitney ثنائي الذيل لاختبار الأهمية (p < 0.0001). ج: حساسية البرد. تم إجراء اختبار المسبار البارد عن طريق وضع الفئران على جهاز اللوحة الباردة المبردة إلى -9 درجة مئوية. تم تسجيل زمن الانتقال للانسحاب على أنه الوقت بالثواني من وضع الماوس على الجهاز حتى يبدأ الماوس في رفع القدم أو لعقها أو اهتزازها. في البيانات الموضحة ، تم وضع مسبار بارد مبرد إلى -9 درجة مئوية تحت مخلب الفأر الخلفي بينما يتم وضع الفأر في قفص فوق شبكة سلكية. تم اختبار جميع الفئران بعد 1-3 أسابيع من الحقن. أظهرت الفئران CBP (ن = 4 ذكور ، 6 إناث) زيادة ملحوظة في حساسية البرد مقارنة بالضوابط الساذجة (ن = 2 ذكور ، 4 إناث). تم إجراء اختبار Mann-Whitney ثنائي الذيل لاختبار الأهمية (p = 0.0002). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الاختبارات السلوكية المتعلقة بمسببات الألم وتحليل البيانات
التدابير المستثارة
تتطور فرط الحساسية على وسادة القدم في غضون يوم واحد من حقن اليوروكيناز. في غضون 1 أسبوع ، يتم تخفيض عتبة الانسحاب بشكل كبير وتستمر حتى القتل الرحيم. يظهر هذا خلال الأسبوع 4 بعد الجراحة (الشكل 4 أ). يتم تحليل زمن انتقال انسحاب Paw باستخدام طريقة von Frey من أعلى إلى أسفل9 واختبار Hargreaves. في المثال المرسوم ، أظهرت الفئران ذات CBP (n = 4 ذكور ، 4 إناث) زيادة كبيرة في الحساسية الميكانيكية مقارنة بالضوابط (n = 2 ذكور ، 2 إناث). يتبدد النموذج في الأسابيع 6-7. تسمح هذه الدورة الزمنية بتقييم المركبات لتخفيف فرط الحساسية في النقاط الزمنية المزمنة ، أي ما يعادل سنوات من الخبرة في الألم لدى المرضى السريريين. يمكن تكرار اختبار فون فراي الانعكاسي عدة مرات في يوم واحد عندما يتم تحديد فعالية مركب قصير الأمد.
اختبار الحساسية الميكانيكية فون فراي
يتم قياس حساسية وسادة القدم ، وبالتالي شدة نموذج آلام الظهر من خلال عدد أحداث الانسحاب من خيوط فون فراي المتدرجة ذات قوة الشد المحددة. عادة ما يكون التحفيز بأقل الألياف (0.008 جم ، 1.65) غير قابل للكشف إلا في الحالات الشديدة من الألم الخيفي. أكبر الألياف (6.0 جم ، 4.74) بحجم نهاية مشبك الورق الحاد ، وعلى الرغم من أنه يمكن الشعور بها بواسطة الماوس ، إلا أن الماوس الساذج لن يتوانى عادة عند التطبيق. حرة في تحريك قدمها طواعية بعيدا عن التحفيز. يتم التعبير عن متوسط حدوث أحداث السحب على أنه عدد الردود من أصل خمسة ، حيث يشير الصفر إلى عدم السحب ، ويشير خمسة إلى الحد الأقصى لعدد عمليات السحب. تشير الاستجابات للألياف المنخفضة مقارنة بالضوابط إلى زيادة الحساسية. بعد تحريض هذا النموذج ، تتطور فرط الحساسية الميكانيكية ذات الدلالة الإحصائية في غضون أسبوع وتستمر لعدة أسابيع بعد الحقن (الشكل 4 أ).
اختبار عتبة الحساسية الحرارية هارجريفز
تتم مقارنة انسحاب القدم في ثوان بعد التعرض للتحفيز الحراري الناجم عن الأشعة تحت الحمراء بين المجموعات (بين). يشير انخفاض زمن انتقال الانسحاب بالثواني إلى فرط الحساسية للحرارة (الشكل 4 ب). حرة في تحريك قدمها طواعية بعيدا عن التحفيز.
فرط الحساسية الحرارية للمسبار البارد
يحفز نموذج آلام الظهر فرط الحساسية الباردة على وسادة القدم. حرة في تحريك قدمها طواعية بعيدا عن التحفيز. يشير انخفاض زمن انتقال الانسحاب بالثواني إلى فرط الحساسية الباردة (الشكل 4C). تم أخذ زمن انتقال الانسحاب باستخدام ساعة توقيت من وقت تطبيق التحفيز البارد على الماوس الذي يظهر سلوك انسحاب أو لعق أو نقر أو رفع متكرر للمخلب الخلفي المصاب.
تدابير الألم العفوية غير المستثارة
الشكل 5: التدابير السلوكية المتغيرة غير المستحثة. (أ) القلق في نموذج CBP. إجمالي الوقت المستغرق في غرفة الضوء في الصندوق الفاتح / الداكن وعدد أحداث التربية أقل بكثير في الفئران المصابة ب CBP ، مما يشير إلى القلق. تم إجراء ANOVA أحادي الاتجاه (اختبار مقارنات Dunnett المتعددة) على هذه البيانات: (n = 4 CBP ، n = 6 ساذج). تم إجراء اختبار Tukey اللاحق لتأكيد الاختلافات بين وسائل المجموعة المحددة. * ص < 0.05 ، ** ص < 0.01. (ب) الاكتئاب في نموذج CBP. إجمالي الوقت المستغرق في الاستمالة وعدد المرات التي تم فيها الاعتناء بها أثناء اختبار رش السكروز أقل بكثير في الفئران المصابة ب CBP ، في حين أن مقدار الوقت قبل بدء الاستمالة زاد بشكل كبير. تم إجراء ANOVA أحادي الاتجاه (اختبار مقارنات Dunnett المتعددة) على هذه البيانات: (n = 4 CBP ، n = 6 ساذج). تم إجراء اختبار Tukey اللاحق لتأكيد الاختلافات بين وسائل المجموعة المحددة. * ص < 0.05 ، *** ص < 0.001. (ج) تغيرات الخطوة في الفئران باستخدام نموذج CBP. كان طول الخطوة بين الفئران المصابة ب CBP والفئران الساذجة مختلفا بشكل كبير. تم إجراء ANOVA أحادي الاتجاه (اختبار مقارنات Dunnett المتعددة) على هذه البيانات: n = 4 لكل مجموعة. تم إجراء اختبار Tukey اللاحق لتأكيد الاختلافات بين وسائل المجموعة المحددة. ** ص < 0.01. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
اختبار الضوء / الظلام
يمكن استخدام غرفة الضوء / الظلام القياسية لتحليل القلق10. من غير المرجح أن تقضي الفئران التي لديها نموذج آلام الظهر وقتا في غرفة الضوء ولديها سلوكيات تربية أقل ، مما يدل على القلق وشدة النموذج. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام متاهات الصفر أو زائد المرتفعة لقياس السلوكيات الشبيهة بالقلق. تدخل القوارض ذات نموذج الألم الذي يعرض سلوكا شبيها بالقلق وتقضي وقتا أقل في الأرباع المفتوحة مقارنة بالحيوانات الساذجة (الشكل 5 أ).
سلوك شبيه بالاكتئاب
يمكن استخدام اختبار رذاذ السكروز لتقييم السلوك الشبيه بالاكتئاب في نموذج آلام الظهر11. يقيم الاختبار غياب سلوك الاستمالة كعلامة على الاكتئاب الناتج عن نموذج الألم المستحث12,13. الفئران التي تعاني من آلام الظهر تعتني مرات أقل بكثير ولوقت أقل بشكل عام ، وكذلك تستغرق وقتا أطول لبدء الاستمالة (الكمون إلى العريس) (الشكل 5B).
السلوك الحركي الحركي
أخيرا ، يمكن استخدام اختبار بقع الحبر للتمييز بين اختلافات المشي بين النموذج والفئرانالضابطة 15. تظهر الفئران المصابة بآلام الظهر خطوات أقصر وأوسع بكثير مقارنة بالضوابط (الشكل 5C). قم بقياس طول الخطوة لمقارنات المجموعة ، مع ملاحظة الاختلافات في مظهر الخطوة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا النموذج من آلام الظهر المزمنة سهل الحث ، ويمكن أن تستمر فرط الحساسية التي تم إنشاؤها في غضون أسبوع 1 لمدة تصل إلى (وربما بعد) 8 أسابيع. وهذا يسمح بدراسة دقيقة لحالة الألم المزمن على عكس النماذج الحادة الأخرى التي تستمر لمدة أسبوع أو أسبوعين فقط. بينما نعرض النموذج في الفئران ، يمكن أيضا إنشاء نموذج CBP الناجم عن uPA في الفئران2. ميزة النموذج هي أن الدورة الزمنية الطويلة تثير تطور السلوكيات الشبيهة بالقلق والاكتئاب ، والتي لوحظت في المرضى الذين يعانون من آلام أسفل الظهر المزمنة. بالنظر إلى انتشار آلام الظهر16 ، فإن القدرة على الأداء في نماذج الفئران الأكثر استخداما في أبحاث الألم الجزيئي هي ميزة.
تم إجراء هذا الحث لنموذج الألم باستخدام uPA بشكل مشابه مع الحقن داخل المفصل للحث على هشاشة العظام3 ، ولكن الطريقة الموضحة هنا (الرباط) يمكن إجراؤها بشكل أسرع وبخطر أقل بكثير من تلف الفأر. لا توجد حاجة للخياطة ، ولا يوجد خطر من النزيف بسبب ثقب التجويف المفصلي. نظرا لأنها حقنة واحدة مع القليل من العمل التحضيري ، فمن السهل أيضا تعمية الفنيين عن المجموعات للحصول على نتائج أكثر دقة.
يتضمن القيد الرئيسي لهذا النموذج التأقلم المناسب للفئران مع اختبار فون فراي. في الواقع ، يوصى بتأقلم الفئران مع حجرتها وخيوطها قبل أسبوع على الأقل من تحريض النموذج للتأكد من أن استجابة Flinch ليست بسبب حداثة البيئة التي تعيش فيها أو بسبب رؤية شيء يتحرك تحت أقدامها.
من الأهمية بمكان أن يتم الحقن في الأربطة لضمان أقصى استجابة لليوروكيناز وليس في العضلات التي تنتج حوالي نصف الاستجابة. نظرا لأن الحقن قريب من العمود الفقري ، فلا يزال من المهم مراقبة جميع الفئران يوميا بعد الحقن لمدة أسبوع 1 على الأقل لضمان عدم وجود مضاعفات من الإجراء. إذا أظهر أي فأر علامات الخمول أو فقدان الوزن أو الشلل أو السلوك غير الطبيعي أو الاستمالة المفرطة لموقع الحقن ، ففكر في إزالة الفأر من الدراسة.
ستفحص الدراسات المستقبلية العقد الجذرية الظهرية (DRG) مع تسجيلات المشبك في المختبر . سيحدد تحليل التدفق استجابة المناعة العصبية ووجود الخلايا الالتهابية الغازية في DRG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة. تقر KNW بالتشاور غير المدفوع مع NeuroChronix و Bessor Pharma و USA Elixeria BioPharm، Inc.
Acknowledgments
تم توفير تمويل المنحة من قبل NIH HEAL UG3 NS123958. تم تفتيش المرافق السكنية واعتمادها من قبل AAALAC. تم إيواء في مرفق إسكان مركز الثروة الحيوانية (ARC) الذي يديره موظفو المختبر وموظفو قسم المختبرات والموارد الحيوانية (DLAR). إجراءات الاختبار السلوكي هي طرق قياسية في هذا المجال على النحو المعتمد من قبل جمعية الألم الأمريكية والرابطة الدولية لدراسة الألم. تتوافق طريقة القتل الرحيم مع توصيات الفريق المعني بالقتل الرحيم التابع للجمعية الطبية البيطرية الأمريكية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals and Consumables | |||
| 70% ethanol | Local Source | ||
| BALB/c mice | Envigo | 20-25 g | |
| Cotton balls | Fisher Scientific | 19-090-702 | |
| Cotton-tipped applicators | Fisher Scientific | 19-062-616 | |
| Isoflurane inhalant anesthetic | MedVet | RXISO-250 | |
| Labeling tape | Fisher Scientific | NGFP7002 | |
| Nitrile exam gloves | Fisher Scientific | ||
| Oxygen tank | Local Source | ||
| Surgical drape, Steri-Drape Utility Sheet, Absorbent Prevention | VWR | 76246-788 | cut into 15 x 15 cm pieces |
| Tygon tubing with 3 mm inner diameter | Grainger | 22XH87 | |
| Equipment | |||
| #11 carbon steel scalpel blades | VWR | 21909-612 | |
| Anesthesia induction chamber | Summit Medical Equipment Company | AS-01-0530-LG | |
| Autoclave | Local Unit | ||
| Biology Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Glass bead sterilizer Germinator 500 | VWR | 102095-946 | |
| IITC Life Sciences Series 8 Model PE34 Hot/Cold Plate Analgesia Meter | IITC | PE34 | |
| Integra Miltex cotton & dressing pliers | Safco Dental Supply | 66-317 | |
| OPTIKA CL31 double arm LED illuminator | New York Microscope Company | OPCL-31 | |
| Plantar Test System with InfraRed Emitter, i. e. Hargreaves Apparatus | Ugo Basile | 37370-001 and 37370-002 | |
| Scalpel Handle No. 3 | VWR | 25607-947 | |
| Small animal heating pad | Valley Vet Supply | 47375 | |
| Student Vannas spring scissors, straight blade | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Table top animal research portable anesthesia workstation “PAM” | Patterson Scientific | AS-01-0007 | |
| Von Frey Filaments | Ugo Basile | 37450-275 |
References
- O'Sullivan, P. B., et al. Back to basics: 10 facts every person should know about back pain. British Journal of Sports Medicine. 54 (12), 698-699 (2020).
- Nauta, H. J., McIlwrath, S. L., Westlund, K. N. Punctate midline myelotomy reduces pain responses in a rat model of lumbar spine pain: evidence that the postsynaptic dorsal column pathway conveys pain from the axial spine. Cureus. 10 (3), 2371 (2018).
- Shuang, F., et al. Establishment of a rat model of lumbar facet joint osteoarthritis using intraarticular injection of urinary plasminogen activator. Scientific Reports. 5 (1), 9828 (2015).
- Reed, N. R., et al. Somatosensory behavioral alterations in a NGF-induced persistent low back pain model. Behavioural Brain Research. 418, 113617 (2022).
- Suh, H. R., Cho, H. -Y., Han, H. C. Development of a novel model of intervertebral disc degeneration by the intradiscal application of monosodium iodoacetate (MIA) in rat. The Spine Journal. 22 (1), 183-192 (2022).
- Kim, H., Hong, J. Y., Lee, J., Jeon, W. -J., Ha, I. -H. IL-1β promotes disc degeneration and inflammation through direct injection of intervertebral disc in a rat lumbar disc herniation model. The Spine Journal. 21 (6), 1031-1041 (2021).
- Millecamps, M., Tajerian, M., Sage, E. H., Stone, L. S. Behavioral signs of chronic back pain in the SPARC-null mouse. Spine. 36 (2), 95-102 (2011).
- La Porta, C., Tappe-Theodor, A. Differential impact of psychological and psychophysical stress on low back pain in mice. Pain. 161 (7), 1442-1458 (2020).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of Neuroscience Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Takao, K., Miyakawa, T. Light/dark transition test for mice. Journal of Visualized Experiments JoVE. (1), e104 (2006).
- Deuis, J. R., Dvorakova, L. S., Vetter, I. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 284 (2017).
- David, D. J., et al. Neurogenesis-dependent and -independent effects of fluoxetine in an animal model of anxiety/depression. Neuron. 62 (4), 479-493 (2009).
- Yalcin, I., et al. A time-dependent history of mood disorders in a murine model of neuropathic pain. Biological Psychiatry. 70 (10), 946-953 (2011).
- Madathil, S. K., et al. Astrocyte-specific overexpression of insulin-like growth factor-1 protects hippocampal neurons and reduces behavioral deficits following traumatic brain injury in mice. PloS One. 8 (6), e67204 (2013).
- Sugimoto, H., Kawakami, K. Low-cost protocol of footprint analysis and hanging box test for mice applied the chronic restraint stress. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e59027 (2019).
- Hassan, S., et al. Identifying chronic low back pain phenotypic domains and characteristics accounting for individual variation: a systematic review. Pain. , (2023).
