Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Collecte de données cryo-EM à particule unique avec inclinaison de scène à l’aide de Leginon

Published: July 1, 2022 doi: 10.3791/64136
Automatic Translation
1, 1, 2, 2,3, 1,4,5
1Laboratory of Genetics, The Salk Institute for Biological Studies, 2Jack H. Skirball Center for Chemical Biology and Proteomics, The Salk Institute for Biological Studies, 3Department of Chemistry and Biochemistry, University of California San Diego, 4Graduate School of Biological Sciences, Section of Molecular Biology, University of California San Diego, 5Department of Integrative Structural and Computational Biology, The Scripps Research Institute

Summary

Le présent protocole décrit un schéma généralisé et facile à mettre en œuvre pour la collecte de données à une seule particule inclinée dans les expériences cryo-EM. Une telle procédure est particulièrement utile pour obtenir une carte EM de haute qualité pour les échantillons souffrant d’un biais d’orientation préférentielle dû au respect de l’interface air-eau.

Abstract

L’analyse monoparticulaire (SPA) par cryo-microscopie électronique (cryo-EM) est maintenant une technique courante pour la biologie structurale à haute résolution. La détermination de la structure par SPA repose sur l’obtention de plusieurs vues distinctes d’un objet macromoléculaire vitrifié dans une fine couche de glace. Idéalement, une collection d’orientations de projection aléatoires uniformément réparties équivaudrait à toutes les vues possibles de l’objet, donnant lieu à des reconstructions caractérisées par une résolution directionnelle isotrope. Cependant, en réalité, de nombreux échantillons souffrent de particules orientées préférentiellement adhérant à l’interface air-eau. Cela conduit à des distributions d’orientation angulaire non uniformes dans l’ensemble de données et à un échantillonnage inhomogène de l’espace de Fourier dans la reconstruction, se traduisant par des cartes caractérisées par une résolution anisotrope. L’inclinaison de l’étage de l’échantillon fournit une solution généralisable pour surmonter l’anisotropie de résolution en améliorant l’uniformité des distributions d’orientation, et donc l’isotropie de l’échantillonnage de l’espace de Fourier. Le présent protocole décrit une stratégie de collecte automatisée de données à étapes inclinées à l’aide de Leginon, un logiciel d’acquisition automatisée d’images. La procédure est simple à mettre en œuvre, ne nécessite aucun équipement ou logiciel supplémentaire et est compatible avec la plupart des microscopes électroniques à transmission (MET) standard utilisés pour l’imagerie des macromolécules biologiques.

Introduction

L’avènement des détecteurs d’électrons directs au cours de la dernière décennie 1,2,3 a entraîné une augmentation exponentielle du nombre de structures à haute résolution de macromolécules et d’assemblages macromoléculaires résolus à l’aide de cryo-EM 4,5,6 à particule unique. Presque toutes les espèces macromoléculaires purifiées devraient pouvoir être déterminées par cryo-EM, à l’exception des plus petites protéines ~10 kDa de taille ou inférieure à7. La quantité de matière de départ nécessaire pour la préparation de la grille et la détermination de la structure est inférieure d’au moins un ordre de grandeur à celle d’autres techniques de détermination de structure, telles que la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire et la cristallographie aux rayons X 4,5,6.

Cependant, l’un des principaux défis pour la détermination de la structure par cryo-EM implique une préparation de grille appropriée pour l’imagerie. Une étude approfondie évaluant divers échantillons à l’aide de différentes stratégies et grilles de vitrification a suggéré que la plupart des approches de vitrification d’échantillons sur des grilles cryo-EM conduisent à une adhésion préférentielle des macromolécules à l’interface air-eau8. Une telle observance peut potentiellement entraîner quatre résultats sous-optimaux : (1) l’échantillon macromoléculaire se dénature complètement, auquel cas aucune collecte et traitement de données réussis n’est possible ; (2) l’échantillon se dénature partiellement, auquel cas il peut être possible d’obtenir des informations structurelles à partir de régions de la macromolécule qui ne sont pas endommagées; (3) l’échantillon conserve sa structure native, mais un seul ensemble d’orientations de particules par rapport à la direction du faisceau d’électrons est représenté dans les images; (4) L’échantillon conserve sa structure native, et certaines orientations possibles des particules par rapport à la direction du faisceau d’électrons sont représentées dans les images. Pour les cas (3) et (4), la collecte de données inclinée aidera à minimiser l’anisotropie de résolution directionnelle affectant la carte cryo-EM reconstruite et fournira une solution généralisable pour une grande variété d’échantillons9. Techniquement, l’inclinaison peut également bénéficier au cas (2), puisque la dénaturation se produit vraisemblablement à l’interface air-eau et limite de la même manière le nombre d’orientations distinctes représentées dans les données. L’étendue du biais d’orientation dans l’ensemble de données peut potentiellement être modifiée en expérimentant avec des additifs de solution, mais un manque d’applicabilité générale entrave ces approches par essais et erreurs. L’inclinaison de l’étage de l’échantillon à un seul angle d’inclinaison optimisé est suffisant pour améliorer la distribution des orientations en modifiant la géométrie de l’expérience d’imagerie9 (Figure 1). En raison de la configuration géométrique de l’échantillon préférentiellement orienté par rapport au faisceau d’électrons, pour chaque groupe d’orientations préférentielles, l’inclinaison de la grille génère un cône d’angles d’éclairage par rapport au centroïde de l’amas. Par conséquent, cela répartit les vues et améliore par conséquent l’échantillonnage de l’espace de Fourier et l’isotropie de la résolution directionnelle.

Il y a, dans la pratique, certains inconvénients à incliner la scène. L’inclinaison de l’étage de l’échantillon introduit un dégradé de mise au point dans le champ de vision, ce qui peut affecter la précision des estimations de la fonction de transfert de contraste (CTF). La collecte de données inclinée peut également entraîner une augmentation du mouvement des particules induit par le faisceau causée par des effets de charge accrus lors de l’imagerie d’échantillons inclinés. L’inclinaison de la grille entraîne également une augmentation de l’épaisseur apparente de la glace, ce qui entraîne des micrographies plus bruyantes et peut finalement avoir un impact sur la résolution des reconstructions 5,9,10. Il peut être possible de surmonter ces problèmes en appliquant des schémas de traitement informatique avancés qui sont brièvement décrits dans les sections protocole et discussion. Enfin, l’inclinaison peut entraîner une augmentation du chevauchement des particules, ce qui entrave le pipeline de traitement d’image ultérieur. Bien que cela puisse être atténué dans une certaine mesure en optimisant la concentration de particules sur le réseau, il s’agit néanmoins d’une considération importante. Ici, un protocole simple à mettre en œuvre est décrit pour la collecte de données inclinées à l’aide de la suite logicielle Leginon (un logiciel d’acquisition d’images automatisé), disponible en libre accès et compatible avec une large gamme de microscopes11,12,13,14. La méthode nécessite au moins la version 3.0 ou supérieure, avec les versions 3.3 et ultérieures contenant des améliorations dédiées pour permettre la collecte de données inclinée. Aucun logiciel ou équipement supplémentaire n’est nécessaire pour ce protocole. Des instructions détaillées sur l’infrastructure informatique et des guides d’installation sont fournis ailleurs15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Préparation de l’échantillon

  1. Utilisez des grilles contenant une feuille d’or et un support de grille d’or16 (voir le tableau des matériaux), car la collecte de données inclinée peut accentuer le mouvement induit par le faisceau17.
    NOTE: Pour la présente étude, des échantillons sur grilles ont été vitrifiés à l’aide de la technique manuelle de plongeon et de buvardage18 dans une chambre froide humidifiée (plus de 80%) (~4 °C).
  2. Éviter d’utiliser des grilles contenant un support en cuivre et une feuille de carbone ou une couche continue de carbone amorphe, sauf en cas d’absolue nécessité, car ces grilles peuvent entraîner un mouvement plus important induit par le faisceau16 lorsque l’étage de l’échantillon est incliné.
    NOTE: D’autres couches de support, telles que le graphène/oxyde de graphène, semblent réduire le mouvement induit par le faisceau par rapport au carbone amorphe19,20.
  3. Précribler les grilles et identifier les régions caractérisées par une épaisseur de glace et une distribution des particules acceptables. Les grilles contenant des particules trop serrées entraîneront un chevauchement des particules lors de la collecte de données inclinées, ce qui peut affecter les étapes de traitement des données en aval.
    REMARQUE: Ces étapes sont subjectives puisque l’identification des bonnes zones de glace est effectuée en inspectant visuellement les images défocalisées pour les régions où le contraste des particules est clair. Cela peut ne pas être possible pour tous les échantillons, car certains échantillons ne se répartissent pas efficacement dans les zones de glace mince, ce qui entraîne des difficultés lors de la collecte des données (décrites dans la section Discussion).
  4. Vitrifiez les grilles contenant votre échantillon de protéines. Ici, à des fins de démonstration, nous utilisons la protéine de protection de l’ADN pendant la famine (DPS) (voir le tableau des matériaux) à une plage de 0,1 à 0,5 mg / mL avec une feuille d’or et des grilles de support en or.
    NOTE: La protéine a été purifiée comme décrit précédemment, sauf qu’aucun clivage de la protéase TEV n’a été effectué21. La plage de concentration en protéines pour un échantillon d’intérêt devra être optimisée individuellement, car il est difficile d’évaluer une plage idéale qui soit universellement applicable et qui variera presque certainement entre les différents échantillons.

2. Mise en place d’une collecte de données inclinée

  1. Aligner le microscope pour assurer un éclairage parallèle de l’échantillon et minimiser les aberrations de coma22.
    REMARQUE: Le microscope doit être bien aligné pour la collecte de données SPA standard sans inclinaison de la scène. Aucun alignement spécial n’est nécessaire pour la collecte de données inclinées, mais un bon alignement garantira le bon déroulement du ciblage et de l’imagerie. Un schéma général comparant la collecte de données inclinées et non inclinées est présenté à la figure 2.
  2. Enregistrez un atlas de grille sans inclinaison de la scène pour identifier les carrés adaptés à la collecte de données ou inspectez manuellement les carrés au grossissement utilisé dans le nœud d’acquisition de carrés. Recherchez des carrés où la feuille est intacte, n’a pas l’air déshydratée et a une épaisseur de glace idéale.
    REMARQUE: Square Acquisition Node est le nœud à faible grossissement utilisé pour l’imagerie multi-échelle dans Leginon.
    1. Pour la collecte automatisée de données non inclinée typique, enregistrez un atlas de grille, qui fournit un aperçu de la qualité globale de la grille et une indication initiale des zones appropriées pour la collecte de données.
    2. Ensuite, sélectionnez les carrés appropriés dans l’atlas et soumettez-les à la file d’attente. Ensuite, soit par la sélection manuelle des trous, soit par le biais du détecteur automatisé de trous EM, mettez en file d’attente et soumettez les cibles de trous.
    3. Enfin, utilisez le détecteur de trous EM automatisé pour soumettre des cibles d’exposition à fort grossissement.
      REMARQUE: Pour la collecte de données inclinées, les carrés peuvent avoir besoin d’être mis en file d’attente manuellement pour des résultats cohérents, en particulier si l’angle d’inclinaison optimal n’a pas été prédéterminé et est susceptible d’être ajusté pendant la collecte de données. L’atlas de grille pourrait également être enregistré à l’aide d’une inclinaison de scène prédéfinie si l’angle d’inclinaison utilisé pour la collecte de données avait été préalablement établi.
  3. Déplacez le stade du spécimen vers un carré d’intérêt.
  4. Déterminez la hauteur eucentrique de la position de la scène à l’aide d’α-wobbler à ±inclinaison de la scène de 15°. Ajustez la hauteur Z pour amener la scène à la hauteur eucentrique à l’aide du clavier du microscope. Assurez-vous que le décalage d’image est minimal pendant la routine de α-oscillation.
    REMARQUE: Si la hauteur eucentrique n’est pas correctement identifiée, un grand décalage de l’image sera observé lors de l’inclinaison de la scène au grossissement carré. Cela peut également se produire s’il y a des déformations locales sur la grille, par exemple, si la grille est cassée ou fortement pliée à proximité de la zone imagée. Bien qu’il soit préférable d’éviter de telles régions pour la collecte de données, il est impératif d’estimer avec précision la hauteur eucentrique si elles représentent l’une des rares régions prometteuses pour la collecte de données. La figure 3 montre comment le ciblage sans identifier correctement la hauteur eucentrique peut provoquer de grands décalages d’image dans le grossissement carré.
  5. Trouvez une hauteur Z plus précise, utilisez le nœud Focuser et appuyez sur Simuler.
    1. En règle générale, estimez la hauteur Z dans le nœud Focuser au grossissement utilisé dans le nœud d’acquisition carré.
      REMARQUE : La séquence de mise au point du nœud Focuser peut également inclure une estimation fine de la mise au point Z au niveau du nœud Acquisition de trous (un outil du logiciel Leginon ) lors de la collecte de données.
    2. Ajustez les paramètres du nœud Focuser et activez/désactivez l’option de mise au point Z fine lors de la mise en file d’attente initiale des carrés.
      REMARQUE : Il est important de s’assurer que la hauteur eucentrique est identifiée avec précision lorsque la collecte automatisée de données commence, ce qui peut nécessiter de réactiver la mise au point Z fine (étape 2.10).
  6. Inclinez l’étage de l’échantillon à l’angle d’inclinaison souhaité pour la collecte de données à la hauteur eucentrique réelle et recentrez l’étage si nécessaire. Des angles d’inclinaison de 0°, 30° et 60° ont été utilisés pour cette étude. Appuyez sur Simuler dans le nœud Acquisition Square pour commencer à mettre en file d’attente les cibles pour les expositions de nœuds d’acquisition de trous .
    NOTE: Comme indiqué à l’étape 2.2.1, l’atlas de la grille peut être enregistré à l’aide d’une inclinaison de scène prédéfinie, ce qui éviterait d’avoir à incliner à nouveau la scène à cette étape. Cela fonctionne bien et accélère le processus si l’angle d’inclinaison utilisé pour la collecte de données est prédéfini. Le protocole actuel est écrit avec de nouveaux spécimens à l’esprit, dans lesquels l’utilisateur peut souhaiter tester différents angles d’inclinaison pour la collecte de données.
  7. Sélectionnez une cible de mise au point Z et des régions avec des trous adaptés aux expositions à fort grossissement.
  8. Appuyez sur Soumettre les cibles à mettre en file d’attente pour la création d’images. N’appuyez pas sur Soumettre les cibles en file d’attente tant que vous n’avez pas terminé de mettre en file d’attente tous les carrés.
  9. Ramenez le stade de l’échantillon à son état non incliné. Passez à la case suivante et répétez les étapes 2.3-2.8 jusqu’à ce qu’un nombre suffisant d’expositions de trous ait été mis en file d’attente.
  10. Accédez au nœud de ciblage de trous et appuyez sur Soumettre les cibles en file d’attente une fois que tous les carrés sont mis en file d’attente .
    REMARQUE : Si le focus Z fin a été désactivé précédemment pour gagner du temps (étape 2.5), il doit être réactivé avant de soumettre la file d’attente.
  11. Inspectez manuellement les cibles sélectionnées par le nœud d’acquisition d’exposition à fort grossissement pour vérifier si le détecteur automatisé de trous EM peut identifier avec précision les régions appropriées pour l’acquisition d’images lorsque l’étage de l’échantillon est incliné.
    1. Au cours de cette procédure, sélectionnez « Autoriser la vérification par l’utilisateur des cibles sélectionnées » dans les paramètres du nœud d’acquisition d’exposition . Une fois que l’utilisateur est satisfait de la précision du ciblage, désélectionnez cette option pour la collecte automatisée des données.
      REMARQUE: Les cibles dans un nœud d’acquisition d’exposition à fort grossissement sont généralement imagées à l’aide d’une stratégie de décalage d’image inclinée et inclinée, qui fonctionne aussi bien pour la collecte de données inclinée que non inclinée23,24,25,26. Pour une estimation précise du CTF dans les étapes de traitement des données en aval, l’étalonnage de l’aberration lentille-coma doit être effectué pour la stratégie de collecte des données de décalage d’image faisceau-inclinaison.

3. Traitement des données

  1. Initiez le traitement des données à la volée 10,27,28,29 avec correction de mouvement des films enregistrés, estimation CTF, sélection des particules et génération de reconstructions initiales pendant la collecte des données.
    NOTE: Pour la présente étude, cryoSPARC Live10 (voir le tableau des matériaux) a été utilisé pour le prétraitement. Le traitement des données à la volée fournit une reconstruction cryo-EM initiale et une approximation de la distribution angulaire, ce qui peut informer l’utilisateur sur l’étendue de l’anisotropie de résolution. Ceux-ci peuvent, à leur tour, être utilisés pour guider l’utilisateur quant à savoir si l’angle d’inclinaison utilisé pour la collecte de données est suffisamment élevé ou non.
  2. Visualisez la carte reconstruite et tracez la distribution des angles d’Euler pour évaluer l’étendue des orientations préférées des particules.
    NOTE: Les distributions d’angle d’Euler peuvent être converties directement en distributions d’échantillonnage de l’espace de Fourier pour déterminer l’étendue potentielle de l’anisotropie de résolution. Une interface utilisateur graphique (GUI) a été développée pour aider l’utilisateur à évaluer la qualité d’une distribution d’angle d’Euler et à déterminer un angle d’inclinaison optimal30,31. L’outil peut être obtenu à partir du référentiel Github, https://github.com/LyumkisLab/SamplingGui.
  3. Si nécessaire, ajustez l’angle d’inclinaison de la scène auquel les données sont collectées pour surmonter les effets de l’orientation préférentielle. L’angle peut être augmenté si l’orientation préférentielle reste un problème, comme en témoignent la carte et la distribution d’Euler en 3.2. L’utilisateur peut également souhaiter diviser la collecte de données en groupes et enregistrer en utilisant plusieurs angles d’inclinaison différents, tels que 20°, 30° et 40°.
    NOTE: Bien que la plupart des TEM doivent avoir la capacité d’incliner la scène à 70°, les inclinaisons de scène courantes (que nous avons utilisées) vont de 20° à 40°.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Le DPS à 0,3 mg/mL a été utilisé pour démontrer l’imagerie à des inclinaisons de 0°, 30° et 60°. Des données provenant de différents angles d’inclinaison ont été recueillies sur la même grille dans différentes régions du réseau. La résolution CTF adaptée aux inclinaisons d’angle plus élevées a tendance à être plus faible, comme ce fut le cas lors de la comparaison des trois ensembles de données de cette étude. La figure 4 montre des images représentatives comparatives et des moyennes de classification 2D. Bien que la concentration de protéines soit inchangée selon les différents angles d’inclinaison, un angle d’inclinaison plus élevé rend la zone imagée plus encombrée en termes de concentration de particules. Cela peut être problématique pour le traitement des données car le chevauchement des particules peut compliquer les reconstructions 3D et les raffinements angulaires. La classification 2D itérative produisait régulièrement une pile de particules propre avec les ensembles de données inclinées de 0° et 30°, tandis que l’ensemble de données de 60° nécessitait un nettoyage minutieux des empilements de particules pour s’assurer que les moyennes de classe montrent un chevauchement minimal pour les particules adjacentes. La moyenne de classe de la figure 4C dans l’encadré rouge représente un exemple de chevauchement de particules. Bien que le recentrage pendant la classification puisse entraîner une moyenne du signal des particules voisines, un chevauchement important des particules peut compromettre la précision des paramètres d’alignement des particules, ce qui donne lieu à des reconstructions caractérisées par une résolution inférieure. La meilleure solution pour éviter le chevauchement des particules est de pré-cribler les grilles avec une épaisseur de glace et une distribution des particules optimales. Un aperçu quantitatif complet des paramètres permettant d’évaluer les améliorations découlant de la collecte de données inclinées est décrit ailleurs32.

Figure 1
Figure 1 : Aperçu des avantages et des défis de la collecte de données inclinée. Le panneau supérieur montre une vue rapprochée d’un trou de grille. Les barres de grille sont en or, bleu glace vitreux et particules macromoléculaires rouges. Les flèches indiquent la direction du faisceau d’électrons. Le panneau inférieur représente une collection de trous avec le même schéma de coloration que dans le panneau supérieur. L’étoile noire représente la cible de mise au point fine avant l’acquisition de l’image d’exposition à fort grossissement. L’angle d’inclinaison est indiqué par la mention « α ». Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Diagramme de flux de travail comparant la stratégie de collecte de données non inclinée et inclinée. La comparaison par étapes de la collecte de données non inclinée et inclinée montre l’étape supplémentaire consistant à estimer manuellement la hauteur eucentrique et à recentrer pour chaque carré incliné (2 et 3 pour la collecte de données inclinées). Le reste du flux de travail est similaire entre les deux stratégies. Il s’agit notamment de sélectionner un carré approprié pour l’imagerie (1 pour la collecte de données inclinée et non inclinée), de lancer un schéma de file d’attente en choisissant un carré pour l’imagerie (appelé simuler; 2 et 4 pour la collecte de données non inclinée et inclinée, respectivement), de fournir une cible de focalisation en hauteur eucentrique et des cibles d’acquisition de grossissement de trou de file d’attente (3 et 5 pour la collecte de données non inclinées et inclinées, respectivement). et enfin la soumission de la file d’attente des cibles d’exposition à fort grossissement sélectionnées (4 et 6 pour la collecte de données non inclinées et inclinées, respectivement). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Images représentatives de la grille à un grossissement carré avec différents angles d’inclinaison. Les images collectées près et loin de la hauteur Z eucentrique sont montrées sur les panneaux supérieur et inférieur, respectivement. L’axe optique du faisceau est indiqué par le centre des anneaux concentriques rouges. La flèche verte indique le carré d’intérêt. Il y a une grille brisée adjacente au carré d’intérêt pour référence. L’ouverture de l’objectif est supprimée pour faciliter la visualisation. Barre d’échelle = 20 μM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Expositions représentatives des trous et moyennes de classe 2D recueillies à différents angles d’inclinaison. Les panneaux (A), (B) et (C) font référence à l’imagerie réalisée avec l’étage de l’échantillon non incliné à 0° ou incliné à 30° et 60°. Les moyennes des classes 2D affectées par le surpeuplement sont indiquées dans l’encadré rouge en (C). Barre d’échelle = 100 nm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

L’orientation préférée des particules causée par l’adhérence de l’échantillon à l’interface air-eau est l’un des derniers goulots d’étranglement majeurs à la détermination de routine de la structure à haute résolution à l’aide de cryo-EM SPA 4,5,6. Le schéma de collecte de données présenté ici fournit une stratégie facile à mettre en œuvre pour améliorer la distribution d’orientation des particules dans un ensemble de données. Nous notons que le protocole ne nécessite aucun équipement ou logiciel supplémentaire et n’affecte pas la vitesse de collecte des données. Les considérations suivantes sont importantes lors de l’acquisition de données pour les spécimens inclinés.

Tout d’abord, le carré imagé doit être à hauteur eucentrique pour un ciblage optimal. La hauteur eucentrique est ajustée en enregistrant des images de paires inclinées à de petits angles d’inclinaison de scène (généralement de 0,5 ° à 2 °) et en identifiant la mise au point en fonction d’une relation prédéfinie entre le décalage et la mise au point de l’image. Si le carré ciblé nécessite un ajustement important de la hauteur eucentrique, cela entraînera un décalage significatif de l’image carrée, de sorte que lorsque la scène est à nouveau inclinée, le champ de vision peut être bloqué par l’ouverture de l’objectif.

Deuxièmement, le trou normalement circulaire devient de plus en plus oblong avec des inclinaisons plus élevées à un grossissement moyen (grossissement du nœud d’acquisition de trous ). En l’absence d’étalonnages précis par décalage d’image, il est possible qu’une partie de la feuille soit imagée avec des particules incorporées dans la glace vitreuse pour un grossissement d’exposition donné. Par conséquent, idéalement, les étalonnages de décalage d’image doivent être précis. Une alternative consiste à augmenter le grossissement de sorte que la surface imagée par rapport à la taille du trou diminue. À un grossissement plus élevé, les erreurs de décalage d’image induites par l’inclinaison du faisceau auraient un effet moindre sur la capacité d’un utilisateur à naviguer vers une zone de glace vitrée. Cependant, cela se fait au détriment de la diminution du nombre de particules dans les micrographies résultantes, proportionnellement à une augmentation du grossissement.

Troisièmement, l’autofocus a plus de chances d’échouer pour la collecte de données inclinée en raison de l’augmentation du mouvement induit par le faisceau et de l’épaisseur accrue de l’échantillon. Ainsi, l’obtention d’une mise au point précise peut, parfois, présenter certains défis pour la collecte de données inclinées, en particulier si la cible de mise au point est la feuille d’or au centre de quatre trous, ce qui est une pratique standard pour la collecte de données non inclinées. En cas d’échecs fréquents d’estimation de la mise au point, une alternative consiste à définir le bord d’un trou comme cible de mise au point. Cela doit fournir un signal suffisant pour une corrélation de phase précise entre les paires d’images induites par l’inclinaison du faisceau et le réglage ultérieur de la mise au point. D’après notre expérience, la mise au point sur le bord d’un trou entraîne rarement une défaillance de l’autofocus.

Enfin, lorsque des images à fort grossissement sont sélectionnées loin du centre de la grille, la différence de mise au point entre les images ciblées sur les côtés opposés de l’axe d’inclinaison peut être significative. L’amplitude de cette différence dépend de l’angle d’inclinaison et de la distance par rapport au point de focalisation. Par exemple, à un angle d’inclinaison de 30°, deux cibles distantes de 6 μm sur la surface de la grille et sélectionnées exactement perpendiculairement à l’axe d’inclinaison auront une différence de défocalisation de 3 μm entre elles (la relation est: delta defocus = sin (angle d’inclinaison) * (distance par rapport à l’axe d’inclinaison)). Les cibles sélectionnées le long de l’axe d’inclinaison auront la même défocalisation, tandis que d’autres se situeront quelque part entre les deux. Si l’axe d’inclinaison est défini dans Leginon pendant l’étalonnage, le logiciel compense automatiquement le changement de défocalisation. Cependant, les utilisateurs doivent être conscients que la possibilité d’avoir des gradients de mise au point plus importants pendant l’imagerie à fort grossissement existe néanmoins. Les grands dégradés de mise au point devraient affecter le moins possible la reconstruction finale33, mais il peut être nécessaire d’utiliser des tailles de boîte plus grandes pendant le traitement des données pour éviter les effets de repliement. Dans ces circonstances, l’utilisation d’une plage de défocalisation plus étroite lors de l’acquisition de données peut être justifiée, et la randomisation de la défocalisation vient naturellement de l’inclinaison de la scène. Les ajustements de défocalisation par particule pendant le traitement des données peuvent améliorer la résolution des reconstructions finales. Cependant, étant donné que la modélisation précise des ajustements CTF peut être difficile pour les angles d’inclinaison de scène élevés, il faut prendre soin de surveiller la qualité des données, et les ajustements CTF pendant la conservation de l’exposition. En général, une épaisseur de glace sous-optimale entraîne une moins grande précision dans la modélisation des ajustements d’estimation CTF. Par conséquent, il faut prendre soin d’imager dans les zones où la glace est mince, en supposant que la distribution des particules est suffisamment bonne dans ces zones.

Une distribution d’orientation améliorée et plus uniforme conduit à une amélioration correspondante de la résolution directionnelle des cartes cryo-EM reconstruites. En outre, une distribution d’orientation plus uniforme améliore le facteur de compensation d’échantillonnage, qui est directement lié à la résolution globale30,31. Ainsi, l’amélioration collective de la distribution d’orientation devrait améliorer la précision de la modélisation atomique et du raffinement 9,30,31. En principe, cela constituerait un argument solide en faveur de la mise en œuvre systématique de la collecte de données orientée. Cependant, il y a plusieurs mises en garde dont l’utilisateur doit être conscient. Premièrement, l’augmentation du gradient de mise au point et de l’épaisseur de la glace peut avoir une incidence sur la résolution globale globale, probablement en raison d’une combinaison d’augmentation du bruit de fond et d’augmentation du mouvement induit par le faisceau, combinée à d’autres problèmes indirects qui en résultent17. Cet effet devrait être plus prononcé dans les cas où la glace est intrinsèquement plus épaisse. Cependant, étant donné que la plupart des échantillons souffrent d’une certaine orientation préférée, ce qui peut à son tour conduire à une non-uniformité de l’échantillonnage, la collecte de données inclinée peut être généralement bénéfique tant que les effets néfastes sont minimisés ou atténués. Deuxièmement, il peut être nécessaire d’incliner la scène jusqu’à 60° pour certains échantillons caractérisés par une orientation préférentielle sévère. Des preuves anecdotiques non publiées provenant de nos travaux et des rapports de nos collègues suggèrent que même des inclinaisons de ~40° sont insuffisantes pour surmonter l’anisotropie de résolution pour certains spécimens. Des efforts sont en cours pour identifier un angle d’inclinaison optimal pour un ensemble de distributions, sur la base des idées énoncées dans Baldwin et al.31. Enfin, il convient de noter qu’en principe, une reconstruction à partir d’un échantillon caractérisé par une orientation privilégiée unique parfaitement pathologique aurait toujours un cône manquant de 30° même lorsque les données sont collectées à un angle d’inclinaison de 60°. Dans les expériences simulées, il est peu probable qu’un cône manquant à 30° affecte grandement les interprétations expérimentales. Une inclinaison de 60° est probablement suffisante même pour les spécimens les plus pathologiquement orientés de préférence. Cependant, dans les cas où l’étage peut devoir être incliné jusqu’à 60°, la concentration des particules dans le champ de vision doit être soigneusement optimisée, car le chevauchement des particules compliquera le traitement des données. Il n’est pas possible d’incliner à plus de 60° (ou 70° sur certains stades de microscope) sur des TEM standard, en raison des limites de la conception de l’étage de l’échantillon. Dans de tels cas, une optimisation supplémentaire avec des additifs et la biochimie des échantillons peut être nécessaire.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions Bill Anderson, Charles Bowman et Jean-Christophe Ducom (TSRI) pour leur aide en matière de microscopie, d’installations Leginon et d’infrastructure de transfert de données. Nous remercions également Gordon Louie (Salk Institute) et Yong Zi Tan (Université nationale de Singapour) pour la lecture critique du manuscrit. Nous remercions Chris Russo (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge) de nous avoir fourni le plasmide pour l’expression du DPS. Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health des États-Unis (U54AI150472, U54 AI170855 et R01AI136680 à DL), de la National Science Foundation (NSF MCB-2048095 à DL), des Hearst Foundations (à DL) et Arthur and Julie Woodrow Chair (à J. P. N.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cryosparc Live v3.1.0+210216 Structura Biotechnology
DPS protein Purification adapted from protocol described in K.Naydenova et al IUCrJ. 2019 Nov 1; 6(Pt 6): 1086–1098.
K2 Summit Direct Electron Detector Gatan
Leginon software suite C Suloway et al Journal of Structural Biology 151 (1): pp. 41-60.
Manual plunging device Homemade guillotine-like device for vitrification of EM grids
Talos Arctica FEI/Thermo Fisher
UltrAufoil R1.2/1.3 300 mesh grids Quantifoil N1-A14nAu30-01

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Campbell, M. G., et al. Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
  2. Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. Elife. 2, 00461 (2013).
  3. Li, X. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
  4. Chua, E. Y. D., et al. cheaper: recent advances in cryo-electron microscopy. Annual Review of Biochemistry. , (2022).
  5. Lyumkis, D. Challenges and opportunities in cryo-EM single-particle analysis. Journal of Biological Chemistry. 294 (13), 5181-5197 (2019).
  6. Wu, M., Lander, G. C. Present and emerging methodologies in Cryo-EM single-particle analysis. Biophysical Journal. 119 (7), 1281-1289 (2020).
  7. Henderson, R. The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules. Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).
  8. Noble, A. J., et al. Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography. Elife. 7, 34257 (2018).
  9. Tan, Y. Z., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EM through tilting. Nature Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
  10. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  11. Potter, C. S., et al. Leginon: a system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day. Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).
  12. Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: The new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
  13. Cheng, A., et al. Leginon: New features and applications. Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).
  14. Carragher, B., et al. Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens. Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).
  15. NYSBC.org Homepage. , Available from: https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Leginon_Homepage (2022).
  16. Russo, C. J., Passmore, L. A. Electron microscopy: Ultrastable gold substrates for electron cryomicroscopy. Science. 346, 1377-1380 (2014).
  17. Russo, C. J., Henderson, R. Charge accumulation in electron cryomicroscopy. Ultramicroscopy. 187, 43-49 (2018).
  18. Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (180), e62765 (2022).
  19. Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids. bioRxiv. , (2021).
  20. Naydenova, K., Peet Mathew, J., Russo Christopher J, J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (24), 11718-11724 (2019).
  21. Naydenova, K., et al. CryoEM at 100 keV: a demonstration and prospects. IUCrJ. 6 (6), 1086-1098 (2019).
  22. Herzik, M. A. cryoEM: Methods and Protocols. Gonen, T., Nannenga, B. L. , Springer US. 125-144 (2021).
  23. Cash, J. N., Kearns, S., Li, Y., Cianfrocco, M. A. High-resolution cryo-EM using beam-image shift at 200 keV. IUCrJ. 7 (6), 1179-1187 (2020).
  24. Peck, J. V., Fay, J. F., Strauss, J. D. High-speed high-resolution data collection on a 200 keV cryo-TEM. IUCrJ. 9 (2), 243-252 (2022).
  25. Bouvette, J., et al. Beam image-shift accelerated data acquisition for near-atomic resolution single-particle cryo-electron tomography. Nature Communications. 12 (1), 1957 (1957).
  26. Cheng, A., et al. High resolution single particle cryo-electron microscopy using beam-image shift. Journal of Structural Biology. 204 (2), 270-275 (2018).
  27. Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nature Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).
  28. Structura Biotechnology Inc. , Available from: https://cryosparc.com/live (2022).
  29. DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. A robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) processing workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion. Journal of Visualized Experiments. (179), e63387 (2022).
  30. Baldwin, P. R., Lyumkis, D. Non-uniformity of projection distributions attenuates resolution in Cryo-EM. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 150, 160-183 (2020).
  31. Baldwin, P. R., Lyumkis, D. Tools for visualizing and analyzing Fourier space sampling in Cryo-EM. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 160, 53-65 (2021).
  32. Aiyer, S., Zhang, C., Baldwin, P. R., Lyumkis, D. cryoEM: Methods and Protocols. Gonen, T., Nannenga, B. L. , Springer US. 161-187 (2021).
  33. Glaeser, R. M., et al. Defocus-dependent Thon-ring fading). Ultramicroscopy. 222, 113213 (2021).

Tags

Ce mois-ci dans JoVE numéro 185
Collecte de données cryo-EM à particule unique avec inclinaison de scène à l’aide de Leginon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aiyer, S., Strutzenberg, T. S.,… More

Aiyer, S., Strutzenberg, T. S., Bowman, M. E., Noel, J. P., Lyumkis, D. Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon. J. Vis. Exp. (185), e64136, doi:10.3791/64136 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter