Summary
尽管具有挑战性,但肺内皮细胞的分离对于肺部炎症的研究至关重要。本协议描述了大血管和微血管内皮细胞的高产量,高纯度分离的程序。
Abstract
从健康和患病组织和器官中分离的细胞的可用性是个性化医疗方法的关键要素。尽管生物样本库可以为生物医学研究提供广泛的原代细胞和永生化细胞,但这些并不能涵盖所有实验需求,特别是与特定疾病或基因型相关的实验需求。血管内皮细胞(ECs)是免疫炎症反应的关键组成部分,因此在多种疾病的发病机制中起着核心作用。值得注意的是,来自不同位点的EC表现出不同的生化和功能特性,使得特定EC类型(即大血管,微血管,动脉和静脉)的可用性对于设计可靠的实验至关重要。在这里,详细说明了从肺动脉和肺实质中获得高产量、几乎纯的人大血管和微血管内皮细胞的简单程序。任何实验室都可以以相对较低的成本轻松复制该方法,以实现独立于商业来源并获得尚不可用的EC表型/基因型。
Introduction
血管内皮排列在血管的内表面。它在调节血液凝固、血管张力和免疫炎症反应中起关键作用1,2,3,4。尽管从人类标本中分离的内皮细胞(ECs)的培养对于研究目的至关重要,但必须指出的是,来自不同血管(动脉,静脉,毛细血管)的EC具有特定的功能。这些不能完全由人脐静脉内皮细胞(HUVEC)概括,后者很容易获得并广泛用于血管内皮病理生理学研究5,6。例如,人肺微血管内皮细胞(HLMVECs)通过控制白细胞募集和积累在肺部炎症中起关键作用4,7。因此,旨在以高保真度再现肺部炎症的实验环境应包括HLMVEC。另一方面,可以在几种病理中观察到EC功能障碍;因此,来自患者的EC对于建立可靠的疾病体外模型至关重要。例如,从囊性纤维化(CF)患者的肺中解剖出的肺动脉(HPAEC)中分离EC碎片,使我们能够发现这种疾病内皮功能障碍的机制8,9。
因此,旨在优化疾病状态下不同来源/器官的EC分离的方案对于为研究人员提供有价值的研究工具至关重要,特别是当这些工具无法商业化时。HLMVEC和HPAEC分离协议先前已报道10,11,12,13,14,15,16,17,18,19。在所有情况下,肺标本的酶消化导致混合细胞群,使用特设选择性培养基和基于磁珠或细胞术的细胞分选进行纯化。这些方案的进一步优化必须解决EC分离中的两个主要问题:(1)细胞和组织污染,应尽早解决培养通道,以尽量减少EC复制衰老20;(2)初级EC分离株的产量低。
本研究描述了一种用于HLMVEC和HPAEC的高产量、高纯度分离的新方案。该程序很容易应用,只需几个步骤即可获得几乎纯的大血管和微血管 EC。
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Protocol
这项研究获得批准,协议遵循基耶蒂-佩斯卡拉大学人类研究伦理委员会(#237_2018bis)的指导方针。 图 1说明了从肺实质或肺动脉的节段(1-3cm长)中分离出内皮细胞,这些细胞来自因各种原因(例如气胸或肺叶切除术)接受胸外科手术的去识别人类受试者(书面同意)。在后一种情况下,外科医生还收集了肺动脉段。值得注意的是,外科医生被准确地指示收集无癌症样本。对所提出的方案进行了优化,以获得尽可能高的产量和纯度。
1. 实验准备
- 胶原酶重建
- 将胶原酶粉末溶解在不含CaCl2 和MgCl 2 (PBS−−,参见 材料表)的磷酸盐缓冲盐水中,浓度为2mg / mL,并使用0.22μm孔过滤器过滤溶液。
- 准备5mL等分试样,并将其储存在-20°C。 使用前解冻并将等分试样预热至37°C。
- 板材涂层
- 对于板包衣,将1.5%明胶溶液或50μg/ mL纤连蛋白(参见 材料表)移入培养板中(500μL足以覆盖6孔板的每个孔的表面),并在37°C下孵育1小时。
- 孵育后,除去多余的明胶,并用PBS−−洗涤孔。吸出PBS−−,让板在无菌罩中干燥。
注意:对于明胶复溶,将粉末溶解在水中制成1.5%的溶液,然后将其高压灭菌,并储存在4°C。 1.5%的明胶在4°C时不是液体;因此,必须在板涂之前对其进行预热。或者,任何适用于细胞培养物的商业明胶溶液都可用于板包衣。
2. 样品制备
- 肺实质
- 通过将收集的样品浸入含有PBS−−的50 mL管中来洗涤收集的样品。
- 将样品转移到无菌培养皿中,并使用手术剪刀(最佳尺寸:>2厘米)手动将样品切成每个约3-4毫米的小碎片。
- 动脉段
- 通过将收集的样品浸入含有PBS−−的50 mL管中来洗涤收集的样品。
- 将其转移到无菌培养皿中而不切碎,因为碎裂会增加动脉段横截面的表面积,从而增加分离非EC的可能性。
3. 酶消化
- 用PBS−−清洗切成丁的肺实质或肺动脉段两次。此步骤将去除大部分残留血液。
- 将样品放入15mL管中,并与5mL的2型胶原酶(参见 材料表)在37°C和5%CO2下孵育10分钟。在孵育过程中,细胞外基质的降解释放出单细胞和细胞聚集体。
4. 消化细胞的恢复
- 将无菌钢/金属过滤器(即目数为 ~1 mm 的滤茶器)放在 50 mL 收集管的顶部。
- 将 15 mL 管中的所有内容物倒入过滤器上,用刮刀轻轻按摩消化的组织,然后用 PBS−− 冲洗样品,直到收集管充满。
注意:此步骤将消除毫米级的大组织碎片,确保后续过滤步骤的效率更高。
5. 通过过滤去除非 EC
- 使用70μm网格尺寸的细胞过滤器过滤步骤4.2中收集的流出,并将流出收集在新鲜的50mL管中。
- 然后,使用40μm目尺寸的细胞过滤器,并将流出的液体收集在新鲜的50 mL管中。将此管标记为“管 1”。
注意:步骤5.1和步骤5.2中的这些过滤将去除通常由混合细胞群组成的大细胞聚集体。
6. 细胞簇沉降和细胞接种
- 在室温下以30× g 离心样品5分钟以沉淀细胞簇。
- 使用无菌移液管(不要倒入)小心地除去上清液,并将其放入新鲜的50 mL管(“管2”)中。
- 将沉淀悬浮在“管 1”中,并用 PBS−− 填充管至 50 mL。用 PBS−− 填充最多 50 mL 的“管 2”。
注意:从此步骤开始,两个管子都以相同的方式处理。 - 在室温下以300× g 离心样品5分钟。
- 用2mL生长培养基悬浮沉淀(参见 材料表),并将悬浮液接种在预包被的6孔板的两个独立孔中(步骤1.2)。
注意:从此步骤开始,每2天用生长培养基喂养细胞,直到它们达到汇合(大约1周,取决于样品大小),以获得合理数量的细胞进行分选。
7. 细胞扩增
- 用 2 mL 含有 CaCl2 和 MgCl2 (PBS++,参见 材料表)的 PBS 洗涤细胞以去除残留的血细胞(使用 PBS++ 对于避免细胞脱离很重要)。
- 取出PBS++,加入新鲜培养基。
- 重复步骤7.1和步骤7.2,直到细胞达到汇合(大约1周,取决于样本量)。
8. 细胞分选
- 使用 500 μL 胰蛋白酶-EDTA(0.05%,参见 材料表)分离细胞,离心,并用 190 μL PBS−− 重悬沉淀。
- 加入 10 μL 荧光偶联物抗人 CD31-FITC 抗体(1:20 稀释,参见 材料表),并将细胞悬液在 4 °C 下孵育 30 分钟。
- 使用 10 mL PBS−− 洗涤细胞,在室温下以 300 x g 离心 5 分钟,然后将沉淀重悬于 300 μL PBS−− 中。
- 使用100μm喷嘴通过荧光激活细胞分选(FACS)分离和收集CD31阳性(CD31 +)细胞,并将它们收集在管中。
- 根据门控策略,首先使用侧向散射区域参数SSC-A和FSC-A定义细胞形态。然后,使用FSC面积/ FSC高度或SSC面积/ SSC高度点图选择单个细胞,定义标记样品中的阳性细胞与未染色的对照样品,并将荧光细胞引导到收集管21中。
- 在室温下以300× g 离心细胞悬液5分钟,并将沉淀悬浮在2mL生长培养基中以接种在6孔板的预包被孔中。
9. 分拣后扩展
- 细胞分选两天后,用新鲜生长培养基替换条件培养基。
- 每2天重复步骤7.1和步骤7.2以进行细胞扩增。
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Representative Results
HLMEC 隔离
HLMVEC分离过程中的主要问题是污染细胞的存在,因为微观毛细血管不容易与基质组织分离。因此,在分离过程的最早阶段达到尽可能高的纯度对于减少培养传代从而减少细胞老化至关重要。同样,最佳的隔离方案应提供尽可能高的纯HLMVECs产量。为了实现这些目标,基于先前描述的协议10,11,12,14,15建立了一个新程序。
虽然肺实质血管化程度很高,因此是HLMVEC的极好来源,但它主要由平滑肌细胞(SMC),胶原纤维和成纤维细胞组成。这些细胞,尤其是SMC,可以适应各种培养基,并且在几乎所有情况下,体 外 复制的速度比其他细胞群快得多,这意味着它们接管了混合细胞培养。因此,我们首先关心的是校准实质的酶消化,以减少不需要的细胞的残留。由于2型胶原酶迅速将内皮细胞群与毛细血管的其余部分分离,我们认为肺样本的消化时间对于最大限度地减少细胞污染至关重要。因此,作为第一步,将切除的肺碎片的胶原酶暴露时间减少到最多10分钟,而不是建议的20分钟15 (图2A)。在这种处理之后,观察到部分细胞聚集体,包括SMC和成纤维细胞,仍然与长纤维结合(图2B),而SMC代表大多数非血细胞单体。还观察到直径通常不超过10-20μm的小而紧凑的细胞簇,没有可归因于基质组织碎片(即大纤维)的元素(图2B)。据推测,这些小细胞聚集体可能主要由HLMVEC组成。
根据这一假设,进行了连续过滤步骤以最大限度地提高HLMVEC回收率。对于第一次过滤,使用金属过滤器,并用镊子按摩样品以促进HLMVEC从毛细管中逸出(图2C,右)。此步骤的目的是去除仍与细胞外基质结合的大簇平滑肌细胞和成纤维细胞。然后使用一系列70μm和40μm网孔尺寸的过滤器过滤流出物,以去除残留的大聚集体,尽管肉眼不可见(图2C,中,左)。为了去除细胞单体,将样品以30× g 离心5分钟,该速度使细胞沉降并聚集直径为>7-10μm,从而使较小的细胞悬浮。这些离心参数是根据Miron等人报告的用于沉淀循环血细胞的参数选择的22。值得注意的是,在此离心后,上清液呈红色(图2D),表明存在许多红细胞(直径~5μm)。此时,小心地除去上清液并置于第二个试管中。将含有上清液和沉淀的试管充满PBS - − 并以300× g 离心5分钟。离心后,含有上清液的管显示出富含血细胞的红色沉淀,表明它还含有大部分外植细胞单体(图2E,右)。
将获得的沉淀与内皮细胞生长培养基悬浮,并分别接种在6孔板的两个孔中,其中预涂有来自猪皮的1.5%明胶(图2E,中间)。3天后,用PBS ++洗涤细胞,用新鲜培养基喂养并成像。 如图2E左侧所示,EC岛在含有来自“管1”(顶部)的细胞的孔中更丰富,而含有来自“管2”(底部)的细胞的孔主要由单个和非内皮样细胞组成。
相同的程序应用于我们之前工作中报告的不太具有挑战性的HPAEC分离方案,其中HPAEC分离涉及利用其与污染细胞相比更短的粘附时间8。由于它们的大尺寸,动脉可以很容易地从残留的结缔组织和脂肪组织中清除,从而消除大部分非ECs。然而,除了血管SMCs8之外,该阶段样品中仍然存在很大比例的成纤维细胞和细胞外基质纤维。新程序进一步提高了HPAEC外植体期间的初始EC纯度(结果未显示)。
新鲜分离的HLMVEC的纯化以及表型和功能表征
在分离方案结束时,通过细胞膜CD31的流式细胞术检测分析HLMVEC的纯度。为了正确识别CD31 +细胞区室,在前向散射(FSC)/侧向散射(SSC)点图上设置一个门,并鉴定出形态上均匀的细胞群。在FSC面积/ FSC高度点图上表示这样的群体,并对单个细胞进行门控并分析CD31的表面表达(分层门控策略,未显示)。在最好的情况下,获得~70%纯HLMVEC单细胞(图3A,B)。值得注意的是,当手术后未立即处理样本或供体是老年人或吸烟者时,HLMVEC产量显着降低。
为了获得更纯的HLMVEC制剂,将CD31 +细胞分选并接种在1.5%明胶包被的培养板中。分选的细胞呈现特征性的内皮样形状(图3C),如图 3D所示,共聚焦显微镜显示几乎100%的FACS纯化细胞对EC抗原染色呈阳性,即CD31和更特异性的血管性血友病因子(vWF)23。此外,当这些细胞接种在基质胶中时,它们产生管状结构以及HUVEC(图3E),从而确认了它们的内皮表型。
图 1:该过程的示意图。 流程图显示了内皮细胞分离和非内皮细胞去除的程序。每个步骤都概括了实验方案的步骤2-6中描述的事件。 请点击此处查看此图的大图。
图 2:优化的 EC 隔离程序图示。 (A) 在胶原酶消化前切成小碎片并在含有 5 mL 2 型胶原酶的 15 mL 管中孵育的肺实质标本的代表性图像(左)。(B)胶原酶消化后获得的细胞群的示意图(左)和实际(右;放大倍数:100倍)表示。这些群体包括非EC和EC的单线,EC组以及与纤维结合的非EC组,使用过滤器去除。(C) 使用金属 70 μm 和 40 μm 网状过滤器进行系列过滤。(D) 低速离心后和将上清液与“管 1”和“管 2”中的沉淀分离之前的 50 mL 管的图像。细胞簇包含在沉淀中,而单个细胞主要包含在上清液中。(E)显示沉淀的不同颜色和组成以及来自“管1”(顶部)和“管2”(底部)的分离细胞的图像;放大倍率:100倍。缩写:EC = 内皮细胞。请点击此处查看此图的大图。
图 3:HLMVEC 表型和功能表征 。 (A)从肺实质外植体获得的混合细胞群。(B)通过流式细胞术在第一代结束时的细胞表面检测CD31。纯度百分比(70%)是指使用的分层门控策略。(C)对CD31抗原进行活分选后的纯HLMVEC。(D)CD31(左)和vWF(右)阳性染色(比例尺:50μm)的代表性免疫荧光共聚焦显微图像。(E)在基质胶上接种HUVEC或HLMVEC后6小时捕获明场图像.放大倍率(A, C, E):100倍。缩写:HLMVECs=人肺微血管内皮细胞。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
血管内皮细胞在人体病理生理学中发挥的多种作用使这些细胞成为 体外 致病学和药理学研究不可或缺的工具。由于来自不同血管部位/器官的EC表现出特殊的特征和功能,因此来自感兴趣器官的健康和患病EC的可用性将是研究目的的理想选择。例如,HLMVEC对于肺部炎症的研究至关重要;因此,高产量、高纯度分离这些细胞的方法将有利于不同的研究领域。
分离HLMVEC的方法已被各种组10,11,12,14,15,17,18,19报道。每种方法都引入了创新方法,例如使用磁珠11,12,15,17,18进行细胞分选或使用钝套管17,18进行机械解离。本协议旨在收集胶原酶消化后获得的内皮细胞小胰岛,并使用基于沉降时间的连续离心来提高初始混合细胞群中EC的纯度。这一点至关重要,因为较高的起始细胞数量意味着需要较少的体外扩增才能达到实验所需的细胞数量,这反过来意味着在EC衰老之前可以完成更多的研究。这方面与HLMVEC分离株的纯度严格相关,这也与获得可靠的结果有关。此外,如果肺样本的尺寸非常小,并且不可能在外植体后立即进行EC分选,根据我们的经验,这是最常见的情况,则污染SMCs的生长速度将超过ECs,从而接管培养并降低细胞分选后EC的产量。
在这项研究中,我们试图解决这些问题。为此,最初监测胶原酶消化后肺部标本的情况,并通过不同的细胞类型(特别是SMC(图2)鉴定出显着污染,SMC生长迅速,可以在混合培养物中超过HLMVEC。因此,制定了一种策略,以在消化后立即将这种污染降至最低(图1和图2)。值得注意的是,在第一个分离阶段一致地获得了纯度为~70%的HLMVEC(图3A,B)。这一出色的结果促进了FACS的后续纯化步骤,从而最终获得了几乎纯净的功能性HLMVEC(图3C-E)。当使用肺动脉段作为起始材料并且HPAECs是分离的细胞时,也获得了类似的结果,因此这意味着该方法代表了先前报告的方法的改进8。
虽然简单且可重复,但此过程具有关键要求。例如,我们通过仅处理手术切除后3-6小时内获得的肺碎片成功进行了HLMVEC分离,而较长的间隔与不良结局相关(数据未显示)。由于酶活性的批次间变化,胶原酶消化时间也可能引入EC产量的变化24。另一个关键点与样品条件有关。来自吸烟者或老年供体的肺实质的HLMVEC产量较低。此外,低速离心的上清液可能含有一些转移到“管2”中的聚集体。因此,建议至少在细胞分离的早期阶段将“管1”和“管2”的内容物保留在培养物中。如前面的EC分离方案11,12,15,17,18中所述,CD31+细胞的直接分选也可以代表从一开始就提高纯度的良好解决方案。由于分析的标本尺寸较小,我们没有应用这个早期分选阶段。但是,这种可能性将在将来的协议实施中进行测试。
用于分离HLMVEC和HPAEC的简单可靠的分离方案将鼓励研究人员利用该途径获得用于研究的细胞,特别是当这些细胞无法商业化时。例如,将HLMEC与CF肺分离将允许在芯片25上构建完整的CF气道。此外,制作自己的EC集合将使研究人员能够以更低的成本计划和运行更多的实验。
总之,该方法解决了EC从手术标本中分离过程中可能出现的一些关键点,改进了现有方法,从而促进了EC病理生物学和炎症的研究。
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Disclosures
作者声明,这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的,这些关系可以解释为潜在的利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了意大利大学和研究部(前 60% 2021 年和 2022 年)对 R. P. 的资金支持,以及意大利囊性纤维化基金会 (FFC#23/2014) 和意大利卫生部 (L548/93) 对 M. R. 的赠款。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.05% trypsin-EDTA 1X | GIBCO | 25300-054 | Used to detach cells from the culture plates |
Anti CD31 Antibody, clone WM59 | Dako | M0823 | Used for CD-31 staining in immunocytochemistry. Dilution used: 1:50 |
Anti vWF Antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-14029 | Used for von Willebrand factor staining in immunocytochemistry. Working dilution: 1:100 |
Autoclavable surgical scissors | Any | Used for chopping specimens | |
Cell strainers 40 µm | Corning | 431750 | Used during the second filtration |
Cell strainers 70 µm | Corning | 431751 | Using during the first filtration |
Collagenase, Type 2 | Worthington | LS004177 | Type 2 Collagenase used for enzymatic digestion. Working concentration: 2 mg/mL |
Conjugated anti CD31 Antibody | BD Biosciences | 555445 | Used for cell sorting (1:20 dilution) |
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) with CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8662 | Used for cell washing before medium change |
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) without CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8537 | Used for washing surgical specimens and cells before trypsinization |
Endothelial Cell Growth Medium MV | PromoCell | C-22020 | HLMVEC growth medium |
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | Fibronectin from human plasma used for plate coating. Working concentration: 50 µg/mL |
Gelatin from porcine skin, type A | Sigma-Aldrich | G2500 | Used for plate coating |
Type A gelatin | Sigma-Aldrich | g-2500 | Gelatin from porcine skin used for plate coating. Working concentration: 1.5% |
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