Summary
Obwohl die Isolierung von pulmonalen Endothelzellen eine Herausforderung darstellt, ist sie für Studien zur Lungenentzündung unerlässlich. Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur hochwirksamen, hochreinen Isolierung von makrovaskulären und mikrovaskulären Endothelzellen.
Abstract
Die Verfügbarkeit von Zellen, die aus gesunden und kranken Geweben und Organen isoliert wurden, stellt ein Schlüsselelement für Ansätze der personalisierten Medizin dar. Obwohl Biobanken eine große Sammlung von primären und immortalisierten Zellen für die biomedizinische Forschung bereitstellen können, decken diese nicht alle experimentellen Bedürfnisse ab, insbesondere nicht solche, die sich auf bestimmte Krankheiten oder Genotypen beziehen. Vaskuläre Endothelzellen (ECs) sind Schlüsselkomponenten der immunen Entzündungsreaktion und spielen daher eine zentrale Rolle in der Pathogenese einer Vielzahl von Erkrankungen. Bemerkenswert ist, dass ECs von verschiedenen Standorten unterschiedliche biochemische und funktionelle Eigenschaften aufweisen, so dass die Verfügbarkeit spezifischer EC-Typen (d. h. makrovaskulär, mikrovaskulär, arteriell und venös) für die Planung zuverlässiger Experimente unerlässlich ist. Hier werden einfache Verfahren zur Gewinnung hochergiebiger, nahezu reiner humaner makrovaskulärer und mikrovaskulärer Endothelzellen aus der Pulmonalarterie und dem Lungenparenchym detailliert dargestellt. Diese Methodik kann von jedem Labor zu relativ geringen Kosten leicht reproduziert werden, um Unabhängigkeit von kommerziellen Quellen zu erreichen und EC-Phänotypen/Genotypen zu erhalten, die noch nicht verfügbar sind.
Introduction
Das vaskuläre Endothel kleidet die innere Oberfläche der Blutgefäße aus. Es spielt eine Schlüsselrolle bei der Regulierung der Blutgerinnung, des Gefäßtonus und der immuninflammatorischen Reaktionen 1,2,3,4. Obwohl die Kultivierung von Endothelzellen (ECs), die aus menschlichen Proben isoliert wurden, für Forschungszwecke unerlässlich ist, muss beachtet werden, dass die ECs aus verschiedenen Blutgefäßen (Arterien, Venen, Kapillaren) spezifische Funktionen haben. Diese können von humanen Nabelvenen-Endothelzellen (HUVEC), die leicht verfügbar sind und in Studien zur Pathophysiologie des vaskulären Endothels weit verbreitet sind, nicht vollständig rekapituliert werden 5,6. So spielen beispielsweise humane mikrovaskuläre Endothelzellen der Lunge (HLMVECs) eine Schlüsselrolle bei Lungenentzündungen, indem sie die Rekrutierung und Akkumulation von Leukozyten kontrollieren 4,7. Daher sollte ein experimentelles Setting, das darauf abzielt, Lungenentzündungen mit hoher Genauigkeit zu reproduzieren, HLMVECs umfassen. Auf der anderen Seite kann eine EC-Dysfunktion bei mehreren Pathologien beobachtet werden; Daher sind ECs des Patienten von grundlegender Bedeutung, um ein zuverlässiges In-vitro-Modell der Krankheit zu erstellen. So konnten wir beispielsweise durch die Isolierung von EC-Fragmenten aus der Pulmonalarterie (HPAECs), die aus der explantierten Lunge von Mukoviszidose-Patienten (Mukoviszidose) entnommen wurden, Mechanismen der endothelialen Dysfunktion bei dieser Erkrankung aufdecken 8,9.
Daher sind Protokolle, die darauf abzielen, die Isolierung von ECs aus verschiedenen Quellen/Organen auch in Krankheitsstadien zu optimieren, unerlässlich, um Forschern wertvolle Forschungswerkzeuge zur Verfügung zu stellen, insbesondere wenn diese Werkzeuge nicht kommerziell erhältlich sind. HLMVEC- und HPAEC-Isolationsprotokolle wurden bereits berichtet 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. In allen Fällen führte der enzymatische Aufschluss der Lungenproben zu gemischten Zellpopulationen, die mit Hilfe von Ad-hoc-Selektionsmedien und magnetischer Beads- oder zytometrischer Zellsortierung aufgereinigt wurden. Weitere Optimierungen dieser Protokolle müssen zwei Hauptprobleme bei der EC-Isolierung angehen: (1) Zell- und Gewebekontamination, die zum frühestmöglichen Zeitpunkt behoben werden sollte, um die replikative Seneszenz der ECzu minimieren 20; und (2) die geringe Ausbeute an primären EC-Isolaten.
In dieser Arbeit wird ein neues Protokoll für die hochreine Isolierung von HLMVECs und HPAECs mit hoher Ausbeute und Reinheit beschrieben. Dieses Verfahren ist einfach anwendbar und liefert in wenigen Schritten nahezu reine makrovaskuläre und mikrovaskuläre ECs.
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Protocol
Diese Studie wurde genehmigt und das Protokoll folgte den Richtlinien der Ethikkommission für Humanforschung der Universität Chieti-Pescara (#237_2018bis). Abbildung 1 zeigt die Isolierung von Endothelzellen aus Segmenten (1-3 cm lang) des Lungenparenchyms oder der Pulmonalarterie von nicht identifizierten menschlichen Probanden (mit schriftlicher Zustimmung), die sich aus verschiedenen Gründen, wie z. B. Pneumothorax oder Lobektomie, einer Thoraxoperation unterziehen. In letzterem Fall entnahmen die Chirurgen auch ein Lungenarteriensegment. Bemerkenswert ist, dass die Chirurgen genau angewiesen wurden, krebsfreie Proben zu entnehmen. Das vorgestellte Protokoll wurde optimiert, um die größtmögliche Ausbeute und Reinheit zu erzielen.
1. Versuchsvorbereitung
- Kollagenase-Rekonstitution
- Kollagenasepulver wird in phosphatgepufferter Kochsalzlösung ohne CaCl 2 und MgCl 2 (PBS−−, siehe Materialtabelle) bei einer Konzentration von2 mg/ml gelöst und die Lösung mit einem 0,22 μm Porenfilter filtriert.
- Bereiten Sie 5-ml-Aliquots vor und lagern Sie sie bei −20 °C. Die Aliquots vor Gebrauch auftauen und auf 37 °C vorheizen.
- Plattenbeschichtung
- Für die Plattenbeschichtung pipettieren Sie 1,5%ige Gelatinelösung oder 50 μg/ml Fibronektin (siehe Materialtabelle) in die Kulturplatte (500 μl reichen aus, um die Oberfläche jeder Vertiefung einer 6-Well-Platte zu bedecken) und inkubieren Sie sie 1 h lang bei 37 °C.
- Entfernen Sie nach der Inkubation die überschüssige Gelatine und waschen Sie die Vertiefungen mit PBS−−. Saugen Sie das PBS−− ab und lassen Sie die Platte in einer sterilen Haube trocknen.
Anmerkungen: Für die Rekonstitution von Gelatine lösen Sie das Pulver in Wasser auf, um eine 1,5%ige Lösung herzustellen, autoklavieren Sie es dann und lagern Sie es bei 4 °C. Gelatine mit 1,5 % ist bei 4 °C nicht flüssig; Daher muss es vor der Plattenbeschichtung erwärmt werden. Alternativ kann jede handelsübliche Gelatinelösung, die für Zellkulturen geeignet ist, für die Plattenbeschichtung verwendet werden.
2. Probenvorbereitung
- Lungenparenchym
- Waschen Sie die gesammelten Proben, indem Sie sie in ein 50-ml-Röhrchen mit PBS−− tauchen.
- Übertragen Sie die Proben in eine sterile Petrischale und zerkleinern Sie die Probe manuell mit einer chirurgischen Schere (optimale Größe: >2 cm) in kleine Fragmente von jeweils ca. 3-4 mm.
- Arteriensegment(e)
- Waschen Sie die gesammelten Proben, indem Sie sie in ein 50-ml-Röhrchen mit PBS−− tauchen.
- Übertragen Sie es in eine sterile Petrischale, ohne es zu zerkleinern, da die Fragmentierung die Oberfläche des Querschnitts des Arteriensegments vergrößert und somit die Möglichkeit erhöht, Nicht-ECs zu isolieren.
3. Enzymatische Verdauung
- Waschen Sie das gewürfelte Lungenparenchym oder das/die Lungenarteriensegment(e) zweimal mit PBS−−. In diesem Schritt wird ein großer Teil des Restblutes entfernt.
- Die Proben werden in 15-ml-Röhrchen gegeben und mit 5 ml Kollagenase Typ 2 (siehe Materialtabelle) 10 Minuten lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Während dieser Inkubation werden durch den Abbau der extrazellulären Matrix einzelne Zellen und Zellaggregate freigesetzt.
4. Rückgewinnung der verdauten Zellen
- Stellen Sie ein steriles Stahl-/Metallsieb (d. h. ein Teesieb mit einer Maschenweite von ~1 mm) auf ein 50-ml-Sammelröhrchen.
- Gießen Sie den gesamten Inhalt des 15-ml-Röhrchens auf das Sieb, massieren Sie das verdaute Gewebe vorsichtig mit einem Spatel und spülen Sie die Probe mit PBS−− ab, bis das Sammelröhrchen gefüllt ist.
HINWEIS: Dieser Schritt eliminiert große Gewebefragmente im Millimeterbereich, wodurch eine höhere Effizienz der nachfolgenden Filtrationsschritte gewährleistet wird.
5. Nicht-EC-Entfernung durch Filtration
- Filtern Sie den in Schritt 4.2 gesammelten Abfluss mit einem Zellsieb mit einer Maschenweite von 70 μm und sammeln Sie den Abfluss in einem frischen 50-ml-Röhrchen.
- Verwenden Sie dann ein Zellsieb mit einer Maschenweite von 40 μm und sammeln Sie den Abfluss in einem frischen 50-ml-Röhrchen. Beschriften Sie diese Röhre als "Röhre 1".
HINWEIS: Durch diese Filtrationen in Schritt 5.1 und Schritt 5.2 werden großzellige Aggregate entfernt, die häufig aus gemischten Zellpopulationen bestehen.
6. Sedimentation von Zellclustern und Zellaussaat
- Zentrifugieren Sie die Proben bei 30 x g für 5 min bei Raumtemperatur, um die Zellcluster zu sedimentieren.
- Entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer sterilen Pipette (nicht gießen) und legen Sie ihn in ein frisches 50-ml-Röhrchen ("Röhrchen 2").
- Suspendieren Sie das Pellet in "Röhrchen 1" und füllen Sie das Röhrchen bis zu 50 ml mit PBS−−. Füllen Sie "Röhrchen 2" bis zu 50 mL mit PBS−−.
Anmerkungen: Ab diesem Schritt werden beide Röhrchen auf die gleiche Weise behandelt. - Zentrifugieren Sie die Proben bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
- Suspendieren Sie die Pellets mit 2 ml Wachstumsmedium (siehe Materialtabelle) und säen Sie die Suspension in zwei separate Vertiefungen einer vorbeschichteten 6-Well-Platte (Schritt 1.2).
HINWEIS: Füttern Sie die Zellen ab diesem Schritt alle 2 Tage mit dem Wachstumsmedium, bis sie die Konfluenz erreichen (ca. 1 Woche, abhängig von der Probengröße), um eine angemessene Anzahl von Zellen für die Sortierung zu erhalten.
7. Zellenausdehnung
- Waschen Sie die Zellen mit 2 ml PBS mit CaCl 2 und MgCl2 (PBS++, siehe Materialtabelle), um die verbleibenden Blutzellen zu entfernen (die Verwendung von PBS++ ist wichtig, um eine Zellablösung zu vermeiden).
- Entfernen Sie PBS++ und fügen Sie frisches Nährmedium hinzu.
- Wiederholen Sie die Schritte 7.1 und 7.2, bis die Zellen die Konfluenz erreicht haben (ca. 1 Woche, abhängig von der Stichprobengröße).
8. Sortierung der Zellen
- Die Zellen werden mit 500 μl Trypsin-EDTA (0,05 %, siehe Materialtabelle) abgelöst, zentrifugiert und das Pellet mit 190 μl PBS−− resuspendiert.
- Fügen Sie 10 μl eines fluoreszierenden konjugierten Anti-Human-CD31-FITC-Antikörpers hinzu (1:20 Verdünnung, siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie die Zellsuspension bei 4 °C für 30 min.
- Waschen Sie die Zellen mit 10 ml PBS−−, zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 300 x g und resuspendieren Sie das Pellet in 300 μl PBS−−.
- Isolieren und sammeln Sie CD31-positive (CD31+) Zellen durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) mit einer 100-μm-Düse und sammeln Sie sie in einem Röhrchen.
- Definieren Sie gemäß der Gating-Strategie zunächst die Zellmorphologie mit den Parametern SSC-A und FSC-A. Wählen Sie dann einzelne Zellen unter Verwendung eines FSC-Area/FSC-Height- oder SSC-Area/SSC-Height-Punktdiagramms aus, definieren Sie die positiven Zellen in der markierten Probe im Vergleich zur ungefärbten Kontrollprobe und leiten Sie die fluoreszierenden Zellen in das Sammelröhrchen21.
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur und suspendieren Sie das Pellet in 2 ml Wachstumsmedium zur Aussaat in den vorbeschichteten Vertiefungen einer 6-Well-Platte.
9. Erweiterung der Nachsortierung
- Ersetzen Sie zwei Tage nach der Zellsortierung das konditionierte Medium durch frisches Wachstumsmedium.
- Wiederholen Sie Schritt 7.1 und Schritt 7.2 alle 2 Tage, um die Zellen zu erweitern.
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Representative Results
HLMEC-Isolation
Das Hauptproblem bei der Isolierung von HLMVECs ist das Vorhandensein kontaminierender Zellen, da die mikroskopisch kleinen Kapillaren nicht leicht vom Stromagewebe getrennt werden können. Daher ist es entscheidend, in den frühesten Phasen des Isolationsprozesses eine möglichst hohe Reinheit zu erreichen, um die Kulturpassagen und damit die Zellalterung zu reduzieren. Ebenso sollte ein optimales Isolationsprotokoll die höchstmögliche Ausbeute an reinen HLMVECs liefern. Um diese Ziele zu erreichen, wurde ein neues Verfahren entwickelt, das auf den zuvor beschriebenen Protokollen 10,11,12,14,15 basiert.
Obwohl das Lungenparenchym stark vaskularisiert ist und somit eine hervorragende Quelle für HLMVECs darstellt, wird es größtenteils von glatten Muskelzellen (SMCs), Kollagenfasern und Fibroblasten besiedelt. Diese Zellen, insbesondere SMCs, können sich an eine Vielzahl von Nährmedien anpassen und vermehren sich in fast allen Fällen in vitro viel schneller als andere Zellpopulationen, so dass sie die gemischte Zellkultur übernehmen. Daher war unser erstes Anliegen, die enzymatische Verdauung des Parenchyms zu kalibrieren, um die Verschleppung unerwünschter Zellen zu reduzieren. Da Typ-2-Kollagenase Gruppen von Endothelzellen schnell vom Rest der Kapillare ablöst, schlussfolgerten wir, dass die Verdauungszeit der Lungenprobe entscheidend für die Minimierung der Zellkontamination sein könnte. Daher wurde in einem ersten Schritt die Zeit der Kollagenase-Exposition des herausgeschnittenen Lungenfragments auf maximal 10 min statt der empfohlenen 20 min15 reduziert (Abbildung 2A). Nach dieser Behandlung wurde beobachtet, dass ein Teil der Zellaggregate, einschließlich der SMCs und Fibroblasten, immer noch an lange Fasern gebunden war (Abbildung 2B), während SMCs die Mehrheit der Nicht-Blutzell-Singuletts ausmachten. Kleine, kompakte Zellansammlungen mit Durchmessern von im Allgemeinen nicht mehr als 10-20 μm wurden ebenfalls ohne Elemente beobachtet, die auf Fragmente von Stromagewebe (d. h. große Fasern) zurückzuführen sind (Abbildung 2B). Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass diese kleinzelligen Aggregate hauptsächlich aus HLMVECs bestehen könnten.
Dieser Hypothese folgend, wurden serielle Filtrationsschritte durchgeführt, um die HLMVEC-Ausbeute zu maximieren. Für die erste Filtration wurde ein Metallsieb verwendet und die Probe mit einer Pinzette massiert, um das Entweichen von HLMVECs aus den Kapillaren zu erleichtern (Abbildung 2C, rechts). Ziel dieses Schritts war es, die großen Ansammlungen von glatten Muskelzellen und Fibroblasten, die noch an die extrazelluläre Matrix gebunden sind, zu entfernen. Der Abfluss wurde dann mit einer Sequenz von Sieben mit einer Maschenweite von 70 μm und 40 μm filtriert, um die verbleibenden großen, wenn auch nicht für das Auge sichtbaren Aggregate zu entfernen (Abbildung 2C, Mitte, links). Um die Zellsuvletts zu entfernen, wurden die Proben bei 30 x g für 5 min zentrifugiert, eine Geschwindigkeit, die Zellen und Aggregate mit einem Durchmesser von >7-10 μm sedimentiert, so dass die kleineren Zellen in Suspension bleiben. Diese Zentrifugationsparameter wurden auf der Grundlage derjenigen ausgewählt, die von Miron et al. für die Pelletierung zirkulierender Blutzellen berichtet wurden22. Bemerkenswert ist, dass der Überstand nach dieser Zentrifugation rot gefärbt war (Abbildung 2D), was auf das Vorhandensein vieler roter Blutkörperchen (~5 μm Durchmesser) hinweist. Zu diesem Zeitpunkt wurde der Überstand vorsichtig entfernt und in ein zweites Röhrchen gelegt. Beide Röhrchen mit dem Überstand und dem Pellet wurden mit PBS−− gefüllt und bei 300 x g für 5 min zentrifugiert. Nach der Zentrifugation zeigte das Röhrchen mit dem Überstand ein rotes Pellet, das mit Blutzellen angereichert war, was darauf hindeutet, dass es auch die meisten explantierten Zelleinzellinge enthielt (Abbildung 2E, rechts).
Die erhaltenen Pellets wurden mit dem Endothelzell-Wachstumsmedium suspendiert und separat in zwei Vertiefungen einer 6-Well-Platte ausgesät, die mit 1,5%iger Gelatine aus Schweinehaut vorbeschichtet waren (Abbildung 2E, Mitte). Nach 3 Tagen wurden die Zellen mit PBS++ gewaschen, mit frischem Medium gefüttert und abgebildet. Wie auf der linken Seite von Abbildung 2E zu sehen ist, waren EC-Inseln in der Vertiefung, die die Zellen aus "Röhre 1" enthielt (oben), häufiger vorhanden, während die Vertiefung mit den Zellen aus "Röhre 2" (unten) hauptsächlich von einzelnen und nicht-endothelialen Zellen besiedelt war.
Das gleiche Verfahren wurde auf das weniger anspruchsvolle HPAEC-Isolationsprotokoll angewendet, über das in unserer früheren Arbeit berichtet wurde, bei dem die HPAEC-Trennung die Ausnutzung ihrer kürzeren Adhäsionszeit im Vergleich zu der von Kontaminantenzellen beinhaltete8. Aufgrund ihrer Größe können Arterien leicht von verbliebenem Binde- und Fettgewebe gereinigt werden, wodurch ein großer Teil der Nicht-ECs eliminiert wird. Allerdings war zu diesem Zeitpunkt noch ein großer Anteil an Fibroblasten und extrazellulären Matrixfasern in den Proben vorhanden, zusätzlich zu den vaskulären SMCs8. Das neue Verfahren erhöhte die anfängliche EC-Reinheit während der HPAEC-Explantaten weiter (Ergebnisse nicht gezeigt).
Aufreinigung und phänotypische und funktionelle Charakterisierung von frisch isolierten HLMVECs
Am Ende des Isolationsprotokolls wurde die Reinheit der HLMVECs durch den durchflusszytometrischen Nachweis der Zellmembran CD31 analysiert. Um das CD31+ Zellkompartiment korrekt zu identifizieren, wurde ein Gate auf ein Forward-Scatter (FSC)/Side-Scatter (SSC) Punktdiagramm gesetzt und eine morphologisch homogene Zellpopulation identifiziert. Eine solche Population wurde in einem FSC-Area/FSC-Height-Punktdiagramm dargestellt, und einzelne Zellen wurden auf die Oberflächenexpression von CD31 untersucht (hierarchische Gating-Strategie, nicht gezeigt). Im besten Fall wurden ~70% reine HLMVEC-Einzelzellen (Abbildung 3A,B) erhalten. Bemerkenswert ist, dass die HLMVEC-Ausbeute signifikant reduziert war, wenn die Probe nicht unmittelbar nach der Operation verarbeitet wurde oder wenn der Spender älter oder Raucher war.
Um reinere HLMVEC-Präparate zu erhalten, wurden die CD31+-Zellen sortiert und in 1,5% gelatinebeschichtete Kulturplatten eingesät. Die sortierten Zellen nahmen die charakteristische endotheliale Form an (Abbildung 3C), und wie in Abbildung 3D berichtet, zeigte die konfokale Mikroskopie, dass fast 100 % der FACS-gereinigten Zellen positiv für EC-Antigene, nämlich CD31 und den spezifischeren von-Willebrand-Faktor (vWF)23, gefärbt wurden23. Darüber hinaus erzeugten diese Zellen, als sie in Matrigel eingesät wurden, tubuläre Strukturen sowie HUVECs (Abbildung 3E), was ihren endothelialen Phänotyp bestätigte.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Verfahrens. Das Flussdiagramm zeigt das Verfahren zur Isolierung von Endothelzellen und zur Entfernung von nicht-endothelialen Zellen. Jeder Schritt rekapituliert die in den Schritten 2-6 des Versuchsprotokolls beschriebenen Ereignisse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Illustration des optimierten EC-Isolationsverfahrens. (A) Repräsentatives Bild eines Lungenparenchyms, das vor dem Kollagenaseverdau in kleine Fragmente gewürfelt und in einem 15-ml-Röhrchen mit 5 ml Typ-2-Kollagenase (rechts) inkubiert wurde. (B) Schematische (links) und tatsächliche (rechts; Vergrößerung: 100-fache) Darstellung der Zellpopulationen, die nach dem Kollagenaseverdau gewonnen wurden. Zu diesen Populationen gehören Einzelstücke von Nicht-ECs und ECs, Gruppen von ECs und Gruppen von Nicht-ECs, die an Fasern gebunden sind, die mit Sieben entfernt werden. (C) Serienfiltration mit 70 μm und 40 μm Metallsieben. (D) Bild des 50-ml-Röhrchens nach der Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit und vor dem Trennen der Überstände von den Pellets in "Röhrchen 1" und "Röhrchen 2". Zellhaufen sind im Pellet enthalten, während die einzelnen Zellen meist im Überstand enthalten sind. (E) Bild, das die verschiedenen Farben und Zusammensetzungen des Pellets und der isolierten Zellen aus "Röhre 1" (oben) und "Röhre 2" (unten) zeigt; Vergrößerung: 100x. Abkürzung: EC = Endothelzellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: HLMVEC phänotypische und funktionelle Charakterisierung . (A) Eine gemischte Zellpopulation, die aus einem Lungenparenchym-Explantat gewonnen wurde. (B) CD31-Nachweis durch Durchflusszytometrie auf der Oberfläche von Zellen am Ende der ersten Passage. Die prozentuale Reinheit (70%) bezieht sich auf die verwendete hierarchische Gating-Strategie. (C) Reine HLMVECs nach Lebendsortierung für das CD31-Antigen. (D) Repräsentative konfokalmikroskopische Immunfluoreszenzaufnahmen von CD31 (links) und vWF (rechts) positiver Färbung (Maßstab: 50 μm). (E) Hellfeldbilder wurden 6 h nach der Aussaat von HUVECs oder HLMVECs auf Matrigel aufgenommen.Vergrößerung (A, C, E): 100x. Abkürzungen: HLMVECs = humane mikrovaskuläre Endothelzellen der Lunge. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Die vielfältigen Rollen, die vaskuläre Endothelzellen in der humanen Pathophysiologie spielen, machen diese Zellen zu einem unverzichtbaren Werkzeug für pathogenetische und pharmakologische In-vitro-Studien . Da ECs aus verschiedenen Gefäßstellen/Organen besondere Merkmale und Funktionen aufweisen, wäre die Verfügbarkeit von gesunden und kranken ECs aus dem interessierenden Organ ideal für Forschungszwecke. Zum Beispiel sind HLMVECs für Studien zu Lungenentzündungen unerlässlich; Daher wird eine Methodik für die hochergiebige, hochreine Isolierung dieser Zellen verschiedenen Forschungsbereichen zugute kommen.
Methoden zur Isolierung von HLMVECs wurden von verschiedenen Gruppen beschrieben 10,11,12,14,15,17,18,19. Jede Methode hat innovative Ansätze eingeführt, wie z. B. die Zellsortierung mit magnetischen Beads 11,12,15,17,18 oder die mechanische Dissoziation mit einer stumpfen Kanüle17,18. Das vorliegende Protokoll wurde entwickelt, um die kleinen Inseln von Endothelzellen zu sammeln, die nach dem Kollagenase-Verdau gewonnen wurden, und verwendete sedimentationszeitbasierte serielle Zentrifugationen, um die Reinheit der ECs in der anfänglichen gemischten Zellpopulation zu erhöhen. Dieser Punkt ist von entscheidender Bedeutung, da eine höhere Anzahl von Startzellen bedeutet, dass eine geringere Anzahl von In-vitro-Expansionen erforderlich ist, um die für die Experimente erforderliche Anzahl von Zellen zu erreichen, was wiederum bedeutet, dass weitere Untersuchungen abgeschlossen werden können, bevor die ECs seneszieren. Dieser Aspekt hängt eng mit dem Reinheitsgrad der HLMVEC-Isolate zusammen, der auch für zuverlässige Ergebnisse relevant ist. Wenn die Lungenprobe sehr klein ist und keine Möglichkeit besteht, unmittelbar nach dem Explantat eine EC-Sortierung durchzuführen, was unserer Erfahrung nach das häufigste Szenario war, wachsen die kontaminierenden SMCs schneller als die ECs, übernehmen so die Kultur und verringern die Ausbeute der ECs nach der Zellsortierung.
In dieser Studie haben wir versucht, diese Punkte anzugehen. Dazu wurde zunächst beobachtet, was mit den Lungenproben nach dem Kollagenaseverdau passierte, und es wurden signifikante Kontaminationen durch unterschiedliche Zelltypen, insbesondere SMCs (Abbildung 2), identifiziert, die schnell wachsen und HLMVECs in Mischkulturen überholen können. Daher wurde eine Strategie festgelegt, um diese Kontamination sofort nach dem Aufschluss zu minimieren (Abbildung 1 und Abbildung 2). Bemerkenswert ist, dass HLMVECs mit einer Reinheit von ~70 % (Abbildung 3A,B) in der ersten Isolationsphase konsistent erhalten wurden. Dieses hervorragende Ergebnis erleichterte den anschließenden Aufreinigungsschritt durch FACS, was zum Endergebnis der Erzielung nahezu reiner, funktioneller HLMVECs führte (Abbildung 3C-E). Ähnliche Ergebnisse wurden erzielt, wenn Pulmonalarteriensegmente als Ausgangsmaterial und HPAECs als isolierte Zellen verwendet wurden, was bedeutet, dass diese Methodik eine Verbesserung der zuvor berichteten Methodik darstellt8.
Obwohl dieses Verfahren einfach und reproduzierbar ist, stellt es wichtige Anforderungen. Zum Beispiel gelang uns die HLMVEC-Isolierung, indem wir nur Lungenfragmente verarbeiteten, die innerhalb von 3-6 h aus der chirurgischen Exzision gewonnen wurden, während längere Intervalle mit schlechten Ergebnissen assoziiert waren (Daten nicht gezeigt). Die Verdauungszeit der Kollagenase könnte aufgrund der Variationen der enzymatischen Aktivität von Charge zu Charge auch zu einer Variabilität der EC-Ausbeute führen24. Ein weiterer kritischer Punkt betrifft den Probenzustand. Lungenparenchym, das von Rauchern oder älteren Spendern stammte, ergab niedrige HLMVEC-Ausbeuten. Darüber hinaus kann der Überstand der langsamen Zentrifugation einige Aggregate enthalten, die in das "Rohr 2" überführt werden. Aus diesem Grund wird empfohlen, den Inhalt von "Röhrchen 1" und "Röhrchen 2" zumindest im frühen Stadium der Zellisolierung in Kultur zu belassen. Auch die direkte Sortierung von CD31+-Zellen, wie sie zuvor in den EC-Isolationsprotokollen 11,12,15,17,18 beschrieben wurde, kann eine gute Lösung darstellen, um die Reinheit von vornherein zu erhöhen. Wir haben diese frühe Sortierphase aufgrund der geringen Größe der analysierten Proben nicht angewendet. Diese Möglichkeit wird jedoch in Zukunft bei der Implementierung des Protokolls getestet.
Ein einfaches und zuverlässiges Isolationsprotokoll zur Isolierung von HLMVECs und HPAECs wird Forscher dazu ermutigen, diesen Weg zu nutzen, um Zellen für ihre Studien zu gewinnen, insbesondere wenn diese Zellen nicht kommerziell erhältlich sind. Zum Beispiel ermöglicht die Isolierung von HLMECs aus Mukoviszidose-Lungen den Bau eines vollständigen Mukoviszidose-Atemwegs auf einem Chip25. Darüber hinaus wird die Erstellung einer eigenen EC-Sammlung es den Forschern ermöglichen, mehr Experimente zu geringeren Kosten zu planen und durchzuführen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Methode, die einige kritische Punkte löst, die bei der EC-Isolierung aus chirurgischen Proben auftreten können, die bestehenden Methoden verbessert und so die Erforschung der EC-Pathobiologie und -Entzündung erleichtert.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass die Untersuchung ohne kommerzielle oder finanzielle Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Mittel des italienischen Ministeriums für Universität und Forschung (ex 60% 2021 und 2022) an R. P. und durch Zuschüsse der italienischen Mukoviszidose-Stiftung (FFC#23/2014) und des italienischen Gesundheitsministeriums (L548/93) an M. R. unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% trypsin-EDTA 1X | GIBCO | 25300-054 | Used to detach cells from the culture plates |
| Anti CD31 Antibody, clone WM59 | Dako | M0823 | Used for CD-31 staining in immunocytochemistry. Dilution used: 1:50 |
| Anti vWF Antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-14029 | Used for von Willebrand factor staining in immunocytochemistry. Working dilution: 1:100 |
| Autoclavable surgical scissors | Any | Used for chopping specimens | |
| Cell strainers 40 µm | Corning | 431750 | Used during the second filtration |
| Cell strainers 70 µm | Corning | 431751 | Using during the first filtration |
| Collagenase, Type 2 | Worthington | LS004177 | Type 2 Collagenase used for enzymatic digestion. Working concentration: 2 mg/mL |
| Conjugated anti CD31 Antibody | BD Biosciences | 555445 | Used for cell sorting (1:20 dilution) |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) with CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8662 | Used for cell washing before medium change |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) without CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8537 | Used for washing surgical specimens and cells before trypsinization |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | PromoCell | C-22020 | HLMVEC growth medium |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | Fibronectin from human plasma used for plate coating. Working concentration: 50 µg/mL |
| Gelatin from porcine skin, type A | Sigma-Aldrich | G2500 | Used for plate coating |
| Type A gelatin | Sigma-Aldrich | g-2500 | Gelatin from porcine skin used for plate coating. Working concentration: 1.5% |
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