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Biology

Isolement et purification de cellules endothéliales microvasculaires et macrovasculaires à partir d’échantillons dérivés de poumons

Published: February 3, 2023 doi: 10.3791/64885
Automatic Translation
1,2, 2, 2,3, 2,3, 1, 4, 4,5, 1,2, 2,3, 1, 6,7, 1, 1,2
1Department of Medical, Oral and Biotechnological Sciences, “G. d’Annunzio” University of Chieti-Pescara, 2Center on Advanced Studies and Technology (CAST), “G. d’Annunzio” University of Chieti-Pescara, 3Department of Medicine and Aging Sciences, University “G. d’Annunzio” of Chieti-Pescara, 4U.O. di Chirurgia Toracica e dei Trapianti di Polmone, Fondazione IRCCS Ca’ Granda - Ospedale Maggiore Policlinico di Milano, 5Dipartimento di Fisiopatologia Medico-Chirurgica e dei Trapianti, Università degli Studi di Milano, 6Department of Pharmaceutical Sciences, Università degli Studi di Milano, 7Unit of Cell and Molecular Biology in Cardiovascular Diseases, Centro Cardiologico Monzino IRCCS

Summary

Bien que difficile, l’isolement des cellules endothéliales pulmonaires est essentiel pour les études sur l’inflammation pulmonaire. Le présent protocole décrit une procédure pour l’isolement à haut rendement et à haute pureté des cellules endothéliales macrovasculaires et microvasculaires.

Abstract

La disponibilité de cellules isolées à partir de tissus et d’organes sains et malades représente un élément clé pour les approches de médecine personnalisée. Bien que les biobanques puissent fournir une vaste collection de cellules primaires et immortalisées pour la recherche biomédicale, celles-ci ne couvrent pas tous les besoins expérimentaux, en particulier ceux liés à des maladies ou à des génotypes spécifiques. Les cellules endothéliales vasculaires (CE) sont des composants clés de la réaction inflammatoire immunitaire et, par conséquent, jouent un rôle central dans la pathogenèse d’une variété de troubles. Notamment, les EC de différents sites présentent des propriétés biochimiques et fonctionnelles différentes, ce qui rend la disponibilité de types de CE spécifiques (c.-à-d. macrovasculaire, microvasculaire, artériel et veineux) essentielle pour concevoir des expériences fiables. Ici, des procédures simples pour obtenir des cellules endothéliales macrovasculaires et microvasculaires humaines à haut rendement et pratiquement pures à partir de l’artère pulmonaire et du parenchyme pulmonaire sont illustrées en détail. Cette méthodologie peut être facilement reproduite à un coût relativement faible par n’importe quel laboratoire pour obtenir l’indépendance vis-à-vis des sources commerciales et obtenir des phénotypes/génotypes EC qui ne sont pas encore disponibles.

Introduction

L’endothélium vasculaire tapisse la surface interne des vaisseaux sanguins. Il joue un rôle clé dans la régulation de la coagulation sanguine, du tonus vasculaire et des réponses immuno-inflammatoires 1,2,3,4. Bien que la culture de cellules endothéliales (CE) isolées à partir de spécimens humains soit essentielle à des fins de recherche, il faut remarquer que les CE de différents vaisseaux sanguins (artères, veines, capillaires) ont des fonctions spécifiques. Celles-ci ne peuvent pas être entièrement récapitulées par les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC), qui sont facilement disponibles et largement utilisées dans les études sur la physiopathologie de l’endothélium vasculaire 5,6. Par exemple, les cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires humaines (HLMVEC) jouent un rôle clé dans l’inflammation pulmonaire en contrôlant le recrutement et l’accumulationdes leucocytes 4,7. Ainsi, un cadre expérimental visant à reproduire l’inflammation pulmonaire avec une haute fidélité devrait inclure les HLMVEC. D’autre part, un dysfonctionnement EC peut être observé dans plusieurs pathologies; par conséquent, les CE du patient sont fondamentales pour construire un modèle in vitro fiable de la maladie. Par exemple, l’isolement de fragments d’EC de l’artère pulmonaire (HPAEC), disséqués à partir des poumons explantés de personnes atteintes de mucoviscidose (FK), nous a permis de découvrir des mécanismes de dysfonctionnement endothélial dans cette maladie 8,9.

Ainsi, les protocoles visant à optimiser l’isolement des CE provenant de différentes sources/organes, y compris dans des états pathologiques, sont essentiels pour fournir aux chercheurs des outils de recherche précieux, en particulier lorsque ces outils ne sont pas disponibles dans le commerce. Des protocoles d’isolement HLMVEC et HPAEC ont déjà été signalés 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Dans tous les cas, la digestion enzymatique des échantillons pulmonaires a donné lieu à des populations cellulaires mixtes, qui ont été purifiées à l’aide de milieux sélectifs ad hoc et d’un tri cellulaire à base de billes magnétiques ou cytométriques. D’autres optimisations de ces protocoles doivent aborder deux problèmes principaux dans l’isolement de la CU : (1) la contamination des cellules et des tissus, qui devrait être résolue le plus tôt possible pour minimiser la sénescence réplicative EC20 ; et 2) le faible rendement des isolats CE primaires.

Cette étude décrit un nouveau protocole pour l’isolement à haut rendement et à haute pureté des HLMVECs et des HPAEC. Cette procédure peut être facilement applicable et donner des CE macrovasculaires et microvasculaires pratiquement purs en quelques étapes.

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Protocol

Cette étude a été approuvée et le protocole a suivi les directives du comité d’éthique de la recherche humaine de l’Université de Chieti-Pescara (#237_2018bis). La figure 1 illustre l’isolement de cellules endothéliales à partir de segments (1 à 3 cm de long) de parenchyme pulmonaire ou d’artère pulmonaire de sujets humains déidentifiés (avec consentement écrit) subissant une chirurgie thoracique pour diverses raisons, telles qu’un pneumothorax ou une lobectomie. Dans ce dernier cas, les chirurgiens ont également prélevé un segment d’artère pulmonaire. Notamment, les chirurgiens ont reçu l’instruction précise de prélever des échantillons exempts de cancer. Le protocole présenté a été optimisé pour obtenir le plus grand rendement et la plus grande pureté possible.

1. Préparation expérimentale

  1. Reconstitution de la collagénase
    1. Dissoudre la poudre de collagénase dans une solution saline tamponnée au phosphate sans CaCl 2 et MgCl 2 (PBS−−, voir le tableau des matières) à une concentration de2 mg/mL et filtrer la solution à l’aide d’un filtre à pores de 0,22 μm.
    2. Préparer des aliquotes de 5 mL et les conserver à −20 °C. Décongeler et préchauffer les aliquotes à 37 °C avant utilisation.
  2. Revêtement de plaques
    1. Pour le revêtement sur plaque, introduire à la pipette une solution de gélatine à 1,5 % ou 50 μg/mL de fibronectine (voir le tableau des matières) dans la plaque de culture (500 μL suffisent pour couvrir la surface de chaque puits d’une plaque à 6 puits) et incuber pendant 1 h à 37 °C.
    2. Après l’incubation, retirez l’excès de gélatine et lavez les puits avec du PBS−−. Aspirez le PBS−− et laissez la plaque sécher dans une hotte stérile.
      REMARQUE: Pour la reconstitution de la gélatine, dissoudre la poudre dans de l’eau pour obtenir une solution à 1,5%, puis autoclaver et conserver à 4 ° C. La gélatine à 1,5 % n’est pas liquide à 4 °C; Par conséquent, il doit être réchauffé avant le revêtement de la plaque. Alternativement, toute solution de gélatine commerciale adaptée aux cultures cellulaires peut être utilisée pour le revêtement de la plaque.

2. Préparation des échantillons

  1. Parenchyme pulmonaire
    1. Lavez les échantillons prélevés en les immergeant dans un tube de 50 ml contenant du PBS−−.
    2. Transférer les échantillons dans une boîte de Petri stérile et hacher manuellement l’échantillon à l’aide de ciseaux chirurgicaux (taille optimale: >2 cm) en petits fragments d’environ 3-4 mm chacun.
  2. Segment(s) d’artère
    1. Lavez les échantillons prélevés en les immergeant dans un tube de 50 ml contenant du PBS−−.
    2. Transférez-le dans une boîte de Petri stérile sans hachage, car la fragmentation augmentera la surface de la section transversale du segment artériel, augmentant ainsi la possibilité d’isoler les non-CE.

3. Digestion enzymatique

  1. Lavez deux fois le parenchyme pulmonaire coupé en dés ou le(s) segment(s) artère(s) pulmonaire(s) avec du PBS−−. Cette étape permettra d’enlever une grande partie du sang résiduel.
  2. Placer les échantillons dans des tubes de 15 mL et incuber avec 5 mL de collagénase de type 2 (voir le tableau des matières) pendant 10 min à 37 °C et 5 % de CO2. Au cours de cette incubation, la dégradation de la matrice extracellulaire libère des cellules individuelles et des agrégats cellulaires.

4. Récupération des cellules digérées

  1. Placez une passoire stérile en acier ou en métal (c.-à-d. une passoire à thé avec un maillage de ~1 mm) sur le dessus d’un tube de prélèvement de 50 mL.
  2. Versez tout le contenu du tube de 15 ml sur la passoire, massez doucement le tissu digéré avec une spatule et rincez l’échantillon avec du PBS−− jusqu’à ce que le tube de prélèvement soit rempli.
    REMARQUE: Cette étape éliminera les gros fragments de tissu à l’échelle millimétrique, assurant une plus grande efficacité des étapes de filtration suivantes.

5. Élimination non CE par filtration

  1. Filtrer le débit sortant recueilli à l’étape 4.2 à l’aide d’une crépine à cellules d’un maillage de 70 μm et recueillir le débit sortant dans un nouveau tube de 50 mL.
  2. Ensuite, utilisez une passoire à cellules d’un maillage de 40 μm et recueillez le débit sortant dans un nouveau tube de 50 mL. Étiquetez ce tube comme « tube 1 ».
    REMARQUE : Ces filtrations à l’étape 5.1 et à l’étape 5.2 élimineront les gros agrégats cellulaires, qui sont souvent composés de populations de cellules mixtes.

6. Sédimentation des amas cellulaires et ensemencement cellulaire

  1. Centrifuger les échantillons à 30 x g pendant 5 min à température ambiante pour sédimenter les amas cellulaires.
  2. Retirez délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette stérile (ne pas verser) et placez-le dans un tube frais de 50 ml (« tube 2 »).
  3. Suspendre la pastille dans le « tube 1 » et remplir le tube jusqu’à 50 mL de PBS−−. Remplir le « tube 2 » jusqu’à 50 ml avec du PBS−−.
    NOTE: À partir de cette étape, les deux tubes sont traités de la même manière.
  4. Centrifuger les échantillons à 300 x g pendant 5 min à température ambiante.
  5. Suspendre les pastilles avec 2 mL de milieu de croissance (voir le tableau des matériaux) et ensemencer la suspension dans deux puits distincts d’une plaque pré-revêtue de 6 puits (étape 1.2).
    NOTE: À partir de cette étape, nourrir les cellules tous les 2 jours avec le milieu de croissance jusqu’à ce qu’elles atteignent la confluence (environ 1 semaine, selon la taille de l’échantillon) afin d’obtenir un nombre raisonnable de cellules pour le tri.

7. Expansion cellulaire

  1. Lavez les cellules avec 2 mL de PBS avec CaCl 2 et MgCl2 (PBS++, voir le tableau des matières) pour éliminer les cellules sanguines résiduelles (l’utilisation de PBS++ est importante pour éviter le décollement des cellules).
  2. Retirez le PBS++ et ajoutez un nouveau milieu de culture.
  3. Répétez les étapes 7.1 et 7.2 jusqu’à ce que les cellules atteignent la confluence (environ 1 semaine, selon la taille de l’échantillon).

8. Tri cellulaire

  1. Détacher les cellules à l’aide de 500 μL de trypsine-EDTA (0,05 %, voir le tableau des matériaux), centrifuger et remettre en suspension la pastille avec 190 μL de PBS−−.
  2. Ajouter 10 μL d’un anticorps anti-CD31-FITC humain conjugué fluorescent (dilution 1:20, voir le tableau des matières) et incuber la suspension cellulaire à 4 °C pendant 30 min.
  3. Laver les cellules avec 10 mL de PBS−−, centrifuger à 300 x g pendant 5 min à température ambiante et remettre la pastille en suspension dans 300 μL de PBS−−.
  4. Isoler et recueillir des cellules CD31 positives (CD31+) par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), à l’aide d’une buse de 100 μm, et les recueillir dans un tube.
    1. Conformément à la stratégie de contrôle, définissez d’abord la morphologie cellulaire à l’aide des paramètres de la zone de diffusion latérale, SSC-A et FSC-A. Ensuite, sélectionnez des cellules individuelles à l’aide d’un diagramme de points FSC-Area/FSC-Height ou SSC-Area/SSC-Height, définissez les cellules positives dans l’échantillon marqué par rapport à l’échantillon témoin non coloré et dirigez les cellules fluorescentes dans le tube de collecte21.
  5. Centrifuger la suspension cellulaire à 300 x g pendant 5 min à température ambiante et suspendre la pastille dans 2 mL de milieu de croissance pour l’ensemencement dans les puits pré-revêtus d’une plaque de 6 puits.

9. Expansion post-tri

  1. Deux jours après le tri cellulaire, remplacer le milieu conditionné par un milieu de croissance frais.
  2. Répétez les étapes 7.1 et 7.2 tous les 2 jours pour l’expansion cellulaire.

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Representative Results

Isolement HLMEC
Le principal problème lors de l’isolement des HLMVECs est la présence de cellules contaminantes car les capillaires microscopiques ne peuvent pas être facilement séparés du tissu stromal. Par conséquent, il est crucial d’atteindre la plus grande pureté possible dès les premiers stades du processus d’isolement afin de réduire les passages de culture et, par conséquent, le vieillissement cellulaire. De même, un protocole d’isolement optimal devrait donner le rendement le plus élevé possible de HLMVEC purs. Pour atteindre ces objectifs, une nouvelle procédure a été mise en place sur la base des protocoles 10,11,12,14,15 décrits précédemment.

Bien que le parenchyme pulmonaire soit fortement vascularisé, représentant ainsi une excellente source de HLMVEC, il est largement peuplé de cellules musculaires lisses (CMS), de fibres de collagène et de fibroblastes. Ces cellules, en particulier les SMC, peuvent s’adapter à une variété de milieux de culture et, dans presque tous les cas, se répliquer in vitro beaucoup plus rapidement que les autres populations cellulaires, ce qui signifie qu’elles prennent en charge la culture de cellules mixtes. Par conséquent, notre première préoccupation était de calibrer la digestion enzymatique du parenchyme afin de réduire le transfert de cellules indésirables. Étant donné que la collagénase de type 2 détache rapidement des groupes de cellules endothéliales du reste du capillaire, nous avons estimé que le temps de digestion de l’échantillon pulmonaire pourrait être crucial pour minimiser la contamination cellulaire. Par conséquent, dans un premier temps, le temps d’exposition à la collagénase du fragment de poumon excisé a été réduit à un maximum de 10 minutes au lieu des 20 min15 suggérés (figure 2A). Après ce traitement, il a été observé qu’une partie des agrégats cellulaires, y compris les SMC et les fibroblastes, étaient encore liés à de longues fibres (Figure 2B), tandis que les SMC représentaient la majorité des singulets non sanguins. De petits amas compacts de cellules, dont le diamètre ne dépasse généralement pas 10 à 20 μm, ont également été observés sans éléments attribuables à des fragments de tissu stromal (c.-à-d. de grosses fibres) (figure 2B). On a émis l’hypothèse que ces petits agrégats cellulaires pourraient être composés principalement de HLMVEC.

Suivant cette hypothèse, des étapes de filtration en série ont été réalisées afin de maximiser la récupération HLMVEC. Pour la première filtration, une crépine métallique a été utilisée et l’échantillon a été massé avec une pince à épiler pour faciliter l’évacuation des HLMVECs des capillaires (figure 2C, à droite). Le but de cette étape était d’éliminer les grands amas de cellules musculaires lisses et de fibroblastes encore liés à la matrice extracellulaire. L’écoulement a ensuite été filtré à l’aide d’une séquence de crépines maillées de 70 μm et de 40 μm pour éliminer les gros agrégats résiduels, bien que non visibles à l’œil (figure 2C, au milieu, à gauche). Pour éliminer les singulettes cellulaires, les échantillons ont été centrifugés à 30 x g pendant 5 min, une vitesse qui sédimente les cellules et les agrégats d’un diamètre >7-10 μm, laissant ainsi les plus petites cellules en suspension. Ces paramètres de centrifugation ont été choisis en fonction de ceux rapportés par Miron et al. pour la granulation des cellules sanguines circulantes22. Notamment, après cette centrifugation, le surnageant était de couleur rouge (Figure 2D), indiquant la présence de nombreux globules rouges (~5 μm de diamètre). À ce stade, le surnageant a été soigneusement retiré et placé dans un deuxième tube. Les deux tubes contenant le surnageant et la pastille ont été remplis de PBS−− et centrifugés à 300 x g pendant 5 min. Après centrifugation, le tube contenant le surnageant présentait une pastille rouge enrichie en cellules sanguines, suggérant qu’il contenait également la plupart des singulettes cellulaires explantées (Figure 2E, à droite).

Les granulés obtenus ont été suspendus avec le milieu de croissance des cellules endothéliales et ensemencés séparément dans deux puits d’une plaque de 6 puits, qui ont été pré-enduits de 1,5% de gélatine provenant de peau de porc (Figure 2E, milieu). Après 3 jours, les cellules ont été lavées avec PBS ++, nourries avec du milieu frais et imagées. Comme le montre la figure 2E, les îlots EC étaient plus abondants dans le puits contenant les cellules du « tube 1 » (en haut), tandis que le puits contenant les cellules du « tube 2 » (en bas) était principalement peuplé de cellules simples et non endothéliales.

La même procédure a été appliquée au protocole d’isolement HPAEC moins difficile qui a été rapporté dans nos travaux précédents, dans lequel la séparation HPAEC impliquait d’exploiter leur temps d’adhésion plus court par rapport à celui des cellules contaminantes8. En raison de leur grande taille, les artères peuvent être facilement nettoyées des tissus conjonctifs et adipeux résiduels, éliminant ainsi une grande proportion de non-CE. Cependant, une grande proportion de fibroblastes et de fibres de matrice extracellulaire était encore présente dans les échantillons à ce stade, en plus des SMC vasculaires8. La nouvelle procédure a encore augmenté la pureté CE initiale pendant les explants HPAEC (résultats non présentés).

Purification et caractérisation phénotypique et fonctionnelle de HLMVECs fraîchement isolés
A la fin du protocole d’isolement, la pureté des HLMVECs a été analysée par la détection cytométrique en flux de CD31 membranaire cellulaire. Pour identifier correctement le compartiment cellulaire CD31+, une porte a été placée sur un diagramme de points à diffusion vers l’avant (FSC)/à diffusion latérale (SSC), et une population morphologiquement homogène de cellules a été identifiée. Une telle population a été représentée sur un diagramme de points FSC-Area/FSC-Height, et des cellules individuelles ont été fermées et analysées pour l’expression de surface de CD31 (stratégie de gating hiérarchique, non représentée). Dans le meilleur des cas, on a obtenu ~70 % de cellules simples HLMVEC pures (Figure 3A,B). Il convient de noter que le rendement de HLMVEC était significativement réduit lorsque l’échantillon n’était pas traité immédiatement après la chirurgie ou lorsque le donneur était âgé ou fumeur.

Pour obtenir des préparations HLMVEC plus pures, les cellules CD31+ ont été triées et ensemencées dans des plaques de culture recouvertes de gélatine à 1,5%. Les cellules triées ont pris la forme endothéliale caractéristique (Figure 3C) et, comme indiqué à la Figure 3D, la microscopie confocale a montré que près de 100% des cellules purifiées par FACS étaient colorées positives pour les antigènes EC, à savoir CD31 et le facteur de von Willebrand plus spécifique (vWF)23. De plus, lorsque ces cellules ont été ensemencées dans Matrigel, elles ont généré des structures tubulaires, ainsi que des HUVECs (Figure 3E), confirmant ainsi leur phénotype endothélial.

Figure 1
Figure 1 : Représentation schématique de la procédure. L’organigramme montre la procédure d’isolement des cellules endothéliales et d’élimination des cellules non endothéliales. Chaque étape récapitule les événements décrits dans les étapes 2 à 6 du protocole expérimental. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Illustration de la procédure optimisée d’isolement de la CE. (A) Image représentative d’un échantillon de parenchyme pulmonaire coupé en petits fragments avant la digestion de la collagénase (à gauche) et incubé dans un tube de 15 mL contenant 5 mL de collagénase de type 2 (à droite). (B) Représentation schématique (à gauche) et réelle (à droite ; grossissement : 100x) des populations cellulaires obtenues après digestion de la collagénase. Ces populations comprennent les singulettes des non-EC et des CE, les groupes de CE et les groupes de non-EC liés aux fibres, qui sont éliminés à l’aide de crépines. C) Filtrations en série à l’aide de crépines métalliques à mailles de 70 μm et de 40 μm. (D) Image du tube de 50 mL après centrifugation à basse vitesse et avant séparation des surnageants des pastilles dans le « tube 1 » et le « tube 2 ». Les amas de cellules sont contenus dans la pastille, tandis que les cellules individuelles sont principalement contenues dans le surnageant. E) Image montrant les différentes couleurs et compositions de la pastille et des cellules isolées du « tube 1 » (en haut) et du « tube 2 » (en bas); grossissement: 100x. Abréviation : EC = cellules endothéliales. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Caractérisation phénotypique et fonctionnelle de HLMVEC. (A) Population de cellules mixtes obtenue à partir d’un explant de parenchyme pulmonaire. (B) Détection de CD31 par cytométrie en flux à la surface des cellules à la fin du premier passage. Le pourcentage de pureté (70%) fait référence à la stratégie hiérarchique utilisée. (C) HLMVECs purs après tri vivant pour l’antigène CD31. (D) Images microscopiques confocales représentatives par immunofluorescence de coloration positive CD31 (à gauche) et vWF (droite) (barre d’échelle : 50 μm). (E) Les images en fond clair ont été capturées 6 h après l’ensemencement des HUVECs ou des HLMVECs sur Matrigel.Agrandissement (A, C, E): 100x. Abréviations : HLMVECs = cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires humaines. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Les multiples rôles joués par les cellules endothéliales vasculaires dans la physiopathologie humaine font de ces cellules un outil indispensable pour les études pathogéniques et pharmacologiques in vitro . Étant donné que les EC de différents sites / organes vasculaires présentent des caractéristiques et des fonctions particulières, la disponibilité de CE saines et malades de l’organe d’intérêt serait idéale à des fins de recherche. Par exemple, les HLMVECs sont essentiels pour les études sur l’inflammation pulmonaire; Par conséquent, une méthodologie pour l’isolement à haut rendement et à haute pureté de ces cellules profitera à divers domaines de recherche.

Des méthodes d’isolement des HLMVECs ont été signalées par divers groupes 10,11,12,14,15,17,18,19. Chaque méthode a introduit des approches innovantes, telles que le tri cellulaire avec des billes magnétiques 11,12,15,17,18 ou la dissociation mécanique à l’aide d’une canule émoussée17,18. Le présent protocole a été conçu pour collecter les petits îlots de cellules endothéliales obtenues après digestion de la collagénase et a utilisé des centrifugations en série basées sur le temps de sédimentation pour augmenter la pureté des CE dans la population initiale de cellules mixtes. Ce point est crucial car un nombre plus élevé de cellules de départ signifie qu’un nombre plus faible d’expansions in vitro est nécessaire pour atteindre le nombre de cellules requises pour les expériences, ce qui, à son tour, signifie que davantage d’investigations peuvent être achevées avant la sénescence de la CE. Cet aspect est strictement lié au degré de pureté des isolats HLMVEC, qui est également pertinent pour obtenir des résultats fiables. De plus, si l’échantillon pulmonaire est de très petite taille et qu’il n’y a aucune possibilité d’effectuer un tri EC immédiatement après l’explant, ce qui était, selon notre expérience, le scénario le plus fréquent, les CMS contaminants se développeront plus rapidement que les CE, prenant ainsi en charge la culture et réduisant le rendement des EC après le tri cellulaire.

Dans cette étude, nous avons essayé d’aborder ces points. Pour cela, ce qui est arrivé aux échantillons pulmonaires après la digestion de la collagénase a été initialement surveillé, et une contamination importante a été identifiée par différents types de cellules, en particulier les SMC (Figure 2), qui se développent rapidement et peuvent dépasser les HLMVECs dans des cultures mixtes. Par conséquent, une stratégie a été établie pour minimiser immédiatement cette contamination après la digestion (Figure 1 et Figure 2). Remarquablement, des HLMVECs avec une pureté de ~70% (Figure 3A,B) ont été systématiquement obtenus à la première phase d’isolement. Cet excellent résultat a facilité l’étape de purification subséquente par FACS, conduisant au résultat final d’obtenir des HLMVECs fonctionnelles pratiquement pures (Figure 3C-E). Des résultats similaires ont été obtenus lorsque des segments d’artère pulmonaire ont été utilisés comme matière première et que les HPAEC étaient les cellules isolées, ce qui signifie que cette méthodologie représente une amélioration de la méthodologie décrite précédemment8.

Bien que simple et reproductible, cette procédure a des exigences clés. Par exemple, nous avons réussi l’isolement HLMVEC en ne traitant que des fragments pulmonaires obtenus dans les 3 à 6 heures suivant l’excision chirurgicale, alors que des intervalles plus longs étaient associés à de mauvais résultats (données non présentées). Le temps de digestion de la collagénase pourrait également introduire une variabilité du rendement EC en raison des variations d’activité enzymatique d’un lot à l’autre24. Un autre point critique concerne l’état de l’échantillon. Le parenchyme pulmonaire dérivé de fumeurs ou de donneurs âgés a donné de faibles rendements HLMVEC. De plus, le surnageant de la centrifugation à basse vitesse peut contenir des agrégats qui sont transférés dans le « tube 2 ». Pour cette raison, il est recommandé de conserver le contenu du « tube 1 » et du « tube 2 » en culture, au moins pendant les premiers stades de l’isolement cellulaire. Le tri direct des cellules CD31+, tel que décrit précédemment dans les protocoles d’isolement EC 11,12,15,17,18, peut également représenter une bonne solution pour augmenter la pureté dès le départ. Nous n’avons pas appliqué cette étape de tri précoce en raison de la petite taille des spécimens analysés. Toutefois, cette possibilité sera testée à l’avenir lors de la mise en œuvre du protocole.

Un protocole d’isolement simple et fiable pour isoler les HLMVECs et les HPAECs encouragera les chercheurs à utiliser cette voie pour obtenir des cellules pour leurs études, en particulier lorsque ces cellules ne sont pas disponibles sur le marché. Par exemple, l’isolement des HLMECs des poumons des FK permettra la construction d’une voie respiratoire complète sur une puce25. En outre, la création de leur propre collection EC permettra aux chercheurs de planifier et de mener davantage d’expériences à moindre coût.

En conclusion, cette méthode, qui résout certains points critiques qui peuvent survenir lors de l’isolement de la CE à partir d’échantillons chirurgicaux, améliore les méthodes existantes, facilitant ainsi la recherche sur la pathobiologie et l’inflammation de la CE.

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Disclosures

Les auteurs déclarent que la recherche a été menée sans aucune relation commerciale ou financière qui pourrait être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par des fonds du ministère italien de l’Université et de la Recherche (ex 60% 2021 et 2022) à R. P. et par des subventions de la Fondation italienne de la mucoviscidose (FFC # 23 / 2014) et du ministère italien de la Santé (L548/93) à M. R.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% trypsin-EDTA 1X GIBCO 25300-054 Used to detach cells from the culture plates
Anti CD31 Antibody, clone WM59 Dako M0823 Used for CD-31 staining in immunocytochemistry. Dilution used: 1:50
Anti vWF Antibody Thermo Fisher Scientific MA5-14029 Used for von Willebrand factor staining in immunocytochemistry. Working dilution: 1:100
Autoclavable surgical scissors Any Used for chopping specimens
Cell strainers 40 µm Corning 431750 Used during the second filtration
Cell strainers 70 µm Corning 431751 Using during the first filtration
Collagenase, Type 2 Worthington LS004177 Type 2 Collagenase used for enzymatic digestion. Working concentration: 2 mg/mL
Conjugated anti CD31 Antibody BD Biosciences 555445 Used for cell sorting (1:20 dilution)
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) with  CaCl2 and MgCl2 Sigma-Aldrich D8662 Used for cell washing before medium change
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) without CaCl2 and MgCl2 Sigma-Aldrich D8537 Used for washing surgical specimens and cells before trypsinization
Endothelial Cell Growth Medium MV PromoCell C-22020 HLMVEC growth medium
Fibronectin Sigma-Aldrich F0895 Fibronectin from human plasma used for plate coating. Working concentration: 50 µg/mL
Gelatin from porcine skin, type A Sigma-Aldrich G2500 Used for plate coating
Type A gelatin Sigma-Aldrich g-2500 Gelatin from porcine skin used for plate coating. Working concentration: 1.5%

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References

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Isolement et purification de cellules endothéliales microvasculaires et macrovasculaires à partir d’échantillons dérivés de poumons
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