Summary
Detta protokoll beskriver beredningen av CLON-G för att förlänga neutrofillivslängden till mer än 5 dagar och ger en tillförlitlig procedur för utvärdering av neutrofildöd med flödescytometri och konfokal fluorescensmikroskopi.
Abstract
Den genomsnittliga livslängden för en neutrofil är mindre än 24 timmar, vilket begränsar grundforskningen om neutrofiler och tillämpningen av neutrofilstudier. Vår tidigare forskning visade att flera vägar kunde förmedla den spontana döden av neutrofiler. En cocktail utvecklades genom att samtidigt rikta in sig på dessa vägar, caspaser-lysosomalt membranpermeabilisering-oxidant-nekortoshämning plus granulocytkolonistimulerande faktor (CLON-G), vilket förlängde neutrofillivslängden till mer än 5 dagar utan att signifikant äventyra neutrofilfunktionen. Samtidigt utvecklades också ett tillförlitligt och stabilt protokoll för bedömning och utvärdering av neutrofildöd. I detta arbete visar vi att CLON-G kan förlänga neutrofillivslängden in vitro till mer än 5 dagar, och vi uppvisar förlängningen av neutrofillivslängden med FACS och konfokal fluorescensmikroskopi. Denna rapport introducerar procedurer för beredning av CLON-G och visar en in vitro spontan dödsanalys av neutrofiler, som kan användas för studier av neutrofiler och för att därefter undersöka neutrofildöd, vilket ger en tillförlitlig resurs för neutrofilsamhället.
Introduction
Neutrofiler är kända för att omfatta en arsenal av rikliga cytoplasmatiska granuler, nikotinamidadenindinukleotidfosfat (NADPH) oxidas, antimikrobiella enzymer och olika organeller som försvarar mot invaderande mikrober; Dessutom är de mycket rörliga och är de första cellerna som rekryteras till inflammationsstället, vilket innebär att neutrofiler är den första försvarslinjen för det medfödda immunsystemet 1,2. Granulocyttransfusionsterapi har därför blivit en lovande klinisk behandling för neutropenirelaterade infektioner för att tillfälligt öka neutrofilimmuniteten 3,4,5. Nya upptäckter har tydligt visat att neutrofiler också fungerar som flerfasade effektorer i många fysiopatologiska scenarier6. Den genomsnittliga livslängden för en neutrofil är mindre än 24 timmar, och därför är grundforskning om neutrofiler och tillämpningen av neutrofilstudier oerhört svåra på grund av begränsningarna i samband med stabil genetisk manipulation och långvarig lagring 7,8,9,10,11 . Det finns några cellinjer som delvis kan visa upp vissa neutrofila funktioner, såsom HL-60, PLB-985, NB4, Kasumi-1 och inducerade pluripotenta stamceller12. Dessa cellinjer kan uppnå effektiv genredigering och kryokonservering; De skiljer sig emellertid fortfarande ganska oerhört från primära neutrofiler och kan därför inte troget rekapitulera neutrofila funktioner13. Således är det mesta av forskningen inom detta område fortfarande beroende av nyligen isolerade primära neutrofiler. Fältet bygger fortfarande på att generera dyra och tidskrävande villkorade knock-out-möss för att undersöka specifika genfunktioner i neutrofiler, men inga mänskliga modeller finns för närvarande.
Efter att ha lagt våra ansträngningar på att utforska de heterogena processerna som är involverade i neutrofildöd och de många vägar som reglerar dessa processer14,15, rapporterades nyligen en ny behandling som kallas CLON-G (caspaser-lysosomal membranpermeabilisering-oxidant-nekortoshämning plus granulocytkolonistimulerande faktor) 16. CLON-G består av Q-VD-oph (kinolyl-valyl-O-metylaspartyl-[-2,6-difluorfenoxi]-metylketon), Hsp70 (värmechockprotein 70), DFO (deferoxamin), NAC (N-acetylcystein), Nec-1s (nekrostatin-1s) och G-CSF (granulocytkolonistimulerande faktor). Neutrofil spontan död medieras av flera vägar, inklusive apoptos, nekrotos och pyroptos. Q-VD-oph hämmar apoptos av neutrofiler som en pan-kaspashämmare genom att rikta in sig på kaspas 1, kaspase 3, kaspas 8 och kaspas 917. Neutrofil nekrotos är beroende av en signalväg som involverar receptorinteragerande proteinkinas-1 (RIPK1) och blandat härstamningskinasdomänliknande protein (MLKL)18. Som en RIPK1-hämmare hämmar Nec-1s nekrotos av neutrofiler. Hsp70 och DFO kan hämma lysosomal membranpermeabilisering (LMP), vilket kan inducera neutrofil apoptos19 och pyroptos20. Reaktiva syreradikaler (ROS) spelar viktiga roller i neutrofildöd genom att förmedla LMP19 och apoptos21 och genom att hämma överlevnadssignaler22. Som en antioxidant som kan minska ROS ackumulering, NAC fördröjer neutrofil död. Som tillväxtfaktor aktiverar G-CSF neutrofila överlevnadssignaler och hämmar calpain-inducerad apoptos23,24. Genom att samtidigt rikta in sig på flera neutrofila spontana dödsvägar kan neutrofillivslängden effektivt förlängas till mer än 5 dagar utan att äventyra deras funktion. CLON-G-behandling utökar möjligheterna till neutrofilbevarande, transport och genmanipulation, vilket kan påskynda forskningen i neutrofilsamhället. Under tiden, baserat på kunskapen om neutrofildöd, kan de för närvarande godkända protokollen för celldödsanalyser orsaka oväntad skada på neutrofiler14, så dessa protokoll har förfinats för att vara mer lämpliga för neutrofilstudier. Denna rapport tillhandahåller detaljerade protokoll för neutrofilodling med CLON-G och en in vitro-celldödsanalys av musneutrofiler med flödescytometri och fluorescensavbildning. CLON-G är effektivt på både mus och humana neutrofiler; Musproverna visas dock här för att förenkla detta protokoll. Koncentrationen av NAC är 1 mM för musneutrofiler och 10 μM för humana neutrofiler. Hsp70 är artspecifik och bör därför användas enligt neutrofilens källa. För detta protokoll spelar det ingen roll om neutrofiler isoleras från perifert blod eller benmärg och hur de isoleras.
För den aktuella studien isolerades neutrofiler från musbenmärg för att uppnå tillräckligt med neutrofiler för experimenten, eftersom cirka 1 x 10 7-1,5 x 107 neutrofiler kan erhållas från benmärgen, medan endast 1 x 10 6 neutrofiler kan isoleras från perifert blod från en enda 8-12 veckor gammal C57BL /6-mus (av båda könen). Gradientcentrifugering utfördes för att undvika eventuella skador och aktivering från mekanisk stimulering av FACS-sortering eller MACS-sortering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Boston Children's Hospital och State Key Laboratory of Experimental Hematology (SKLEH) Animal Care and Use Committee godkände och övervakade alla procedurer. Figur 1 visar ett flödesschema över neutrofilodling med CLON-G och in vitro-dödsanalysen .
1. Neutrofil livslängdsförlängning med CLON-G
OBS: Alla nämnda operationer och material måste vara sterila. Se till att alla lösningar är väl blandade och fördelas jämnt.
- Bevarande av CLON-G-komponenterna
- Lös 50 mg Q-VD-oph (se Materialtabell) till en slutlig koncentration på 100 mM genom tillsats av 973,7 μL dimetylsulfoxid (DMSO) och pipettera vätskan tills blandningen blir klar. Alikvot 50 μl per rör och bevara vid −20 °C.
VARNING: DMSO är en skadlig kemisk vätska. Använd en labbrock, skyddsglasögon och en mask för att undvika hudkontakt, ögonkontakt och inandning. - Tina Hsp70 (se Materialförteckning) vid 4 °C och snurra ner innehållet i injektionsflaskan. Alikvot 1 μL Hsp70 per rör på is och bevara vid −80 °C.
OBS: Hsp70 är ett protein; Ultrakylförvaring är nödvändig för att hålla den stabil. Undvik frys-tina cykeln. - Lös 1 mg DFO (se Materialtabell) med 7,61 ml RPMI 1640 så att en stam på 200 μM erhålls. Alikvot 500 μl per rör och bevara vid −20 °C.
- Lös 0,1 g NAC (se materialtabell) med 2,5 ml RPMI 1640 i ett 15 ml centrifugrör och justera pH till 7-7,4 med NaOH. Tillsätt RPMI 1640 till en slutlig volym på 3,06 ml för att skapa ett 200 mM NAC-lager. Filtrera den med en 0,2 μm filterenhet. Alikvot 500 μl per rör och bevara vid −20 °C.
OBS: Upplösning NAC i denna höga koncentration är inte lätt, och virvel kan hjälpa till att lösa upp det. Fenolrött i RPMI 1640 är en perfekt indikation på pH; när NAC just är upplöst är färgen gulaktig; Justera den tills den blir rosa. NAC:s stamlösningar är stabila i upp till 1 månad vid −20 °C. - Lös 10 mg Nec-1s (se materialtabell) till 20 mM med 1,8 ml DMSO och pipettera blandningen tills den blir klar. Alikvot 50 μl per rör och bevara vid −20 °C. Skydda mot ljus.
- Lös 250 μg G-CSF (se materialtabell) till 200 μg/ml med 1,25 ml RPMI 1640. Alikvot 50 μl per rör och bevara vid 4 °C.
- Lös 50 mg Q-VD-oph (se Materialtabell) till en slutlig koncentration på 100 mM genom tillsats av 973,7 μL dimetylsulfoxid (DMSO) och pipettera vätskan tills blandningen blir klar. Alikvot 50 μl per rör och bevara vid −20 °C.
- Beredning av 2x CLON-G odlingsmedium
- Förbered basmediet. Tillsätt 39,5 ml RPMI 1640, 10 ml fetalt bovint serum (FBS) och 0,5 ml pen-strep (antibiotika) till ett 50 ml rör för att göra RPMI 1640 med 20% FBS och 1% PS som basmedium.
OBS: Denna höga koncentration av FBS används för att ge den långvariga kulturen av neutrofiler, som kan vara större än 5 dagar. Om odlingstiden är 1-2 dagar är 10% -15% FBS tillräcklig. - Tina alla stamlösningar av CLON-G-komponenterna på is.
- Späd 1 μl Hsp70 till 20 μM genom tillsats av 606 μl basmedium. Späd 1 μl 200 μg/ml g-csf till 20 μg/ml genom tillsats av 9 μl av basmediet.
- Tillsätt 976 μl basmedium till ett 15 ml centrifugrör. Tillsätt 1 μL Q-VD-oph (100 mM), 10 μL DFO (200 μM), 1 μL Hsp70 (20 μM), 10 μL NAC (200 mM), 1 μL Nec-1s (20 mM) och 1 μL G-CSF (20 μg / ml) för att göra 1 ml 2x CLON-G-medium.
OBS: 2x CLON-G-mediet ska användas omedelbart efter att det har beretts. Man kan lagra 2x CLON-G tillfälligt vid 4 °C. Överblivna 20 μM Hsp70 måste kasseras.
- Förbered basmediet. Tillsätt 39,5 ml RPMI 1640, 10 ml fetalt bovint serum (FBS) och 0,5 ml pen-strep (antibiotika) till ett 50 ml rör för att göra RPMI 1640 med 20% FBS och 1% PS som basmedium.
- Neutrofil kultur
- Isolera neutrofiler hos möss genom gradientcentrifugering enligt en tidigare rapport25. Resuspendera de isolerade musneutrofilerna i basmediet (1 miljon celler/100 μl).
OBS: Undvik att aktivera neutrofilerna genom att hantera dem försiktigt. Undvik skumning under hela processen. - Tillsätt 500 μL 2x CLON-G-medium, 400 μL basmedium och 100 μL cellsuspension till 24-brunns icke-vävnadsodlade odlingsplattor (se materialtabell) och pipettera försiktigt tre till fyra gånger.
OBS: Höga koncentrationer av komponenterna i 2x CLON-G-mediet kan skada neutrofilerna; Undvik att lägga ihop dem utan basmediet. Den icke-vävnadsodlade odlingsplattan är nödvändig för att undvika neutrofil vidhäftning. - Placera odlingsplattan smidigt i en inkubator på 37 °C och 5 %CO2 .
OBS: Det är onödigt att byta cellmedium inom 7 dagar. De slutliga koncentrationerna av CLON-G-kompositionen är 50 μM Q-VD-Oph, 1 μM DFO, 10 pM Hsp70, 1 mM NAC, 10 μM Nec-1 s och 10 ng/mL G-CSF. - Färga de odlade neutrofilerna med Wright Giemsa-sammansatt fläck (se materialtabell) och analysera med ett ljusmikroskop (figur 2A-D). Alternativt färga med APC-CD11b- och PE-Cy7-Ly6G-antikroppar och analysera med flödescytometri (figur 2E-I) som beskrivits tidigare26.
- Isolera neutrofiler hos möss genom gradientcentrifugering enligt en tidigare rapport25. Resuspendera de isolerade musneutrofilerna i basmediet (1 miljon celler/100 μl).
2. In vitro bestämning av spontan död av neutrofiler
- Analys av flödescytometri
- Odlingsisolerade neutrofiler med en densitet av 1 miljon celler/ml i basmediet vid 37 °C och 5 %CO2. Odlingsplattan med 24 brunnar är odlad utan vävnad. Tillsätt 1 ml cellmedium per brunn.
- Lös 1 g CaCl2 med 45 ml saltlösning till 200 mMCaCl2. Filtrera den med en 0,2 μm filterenhet. Bevara vid 4 °C.
- Förbered färgblandningen. Tillsätt 7 μl saltlösning per prov till ett 1,5 ml rör och tillsätt 0,4 mg/ml FITC-Annexin-V, 0,5 mg/ml propidiumjodid (PI) och 200 mMCaCl2-lösning vid 1 μl vardera per prov. Blanda väl. Använd lösningen omedelbart efter beredningen.
- Pipettera cellmediet försiktigt fem till sju gånger för att blanda väl, följt av överföring av 100 μL till ett flödescytometrirör vid önskade tidpunkter.
OBS: Undvik skumning under hela processen. - Vortex räknar pärlor (se materialförteckning) för att blanda dem väl. Pipettera 10 μL av de välblandade räknekulorna till samma flödescytometrirör som i steg 2.1.4.
- Tillsätt 10 μL den beredda färgblandningen (steg 2.1.3) till flödescytometriröret. Inkubera vid rumstemperatur i 5 minuter från ljus.
- Tillsätt 100 μL saltlösning till röret och blanda väl för att säkerställa en jämn fördelning av räknepärlorna och cellerna.
- Utför flödescytometrianalys av cellmediet. Samla cellerna i låg takt med ~ 400 händelser / s. Grinda APC-PE-Cy7-cellerna till FSC-A och SSC-A och grinda de intakta cellerna med medium FSC-A- och SSC-A-positioner till FITC-Annexin-V och PE-PI; Annexin-V-PI-populationen klassificeras som friska celler.
OBS: Följande ekvationer bestämmer det totala antalet friska celler per prov och livskraften hos neutrofilerna:
Totalt antal friska celler per prov27 = (1 000/antal räknepärlor) × antal Annexin-V−PI− population × 10
Viabilitet av neutrofiler = totalt antal friska celler vid angiven tidpunkt/totalt antal friska celler vid tidpunkten noll
- Fluorescerande bildanalys
- Odlingsisolerade neutrofiler med en densitet av 1 miljon celler/ml i basmediet vid 37 °C och 5 %CO2 i en konfokal platta med 2 ml cellmedium per platta.
OBS: Ett konfokalt fluorescensmikroskop har den bästa bildkvaliteten, men alla fluorescensmikroskop som har 488/561 / DIC-kanaler är tillräckliga för att stödja detta experiment. - Ta försiktigt ut plattan vid den angivna tidpunkten. Tillsätt 10 μL vardera 0,4 mg/ml FITC-Annexin-V, 0,5 mg/ml PI och 200 mM CaCl2 jämnt till plattan. Färga vid rumstemperatur i 5 min.
OBS: Undvik att skaka under hela processen. Tillsätt färgningsmedlen jämnt och försiktigt. - Ta fluorescensbilder vid 488 (annexin-V)/561 (PI)/DIC-kanaler med hjälp av ett konfokalt fluorescensmikroskop med en 20x objektivlins (se materialtabell). Ställ in exponeringstiden för 488-kanalen som 500 ms, 561-kanalen som 200 ms och DIC-kanalen som 100 ms. Välj 5-10 slumpmässiga områden för varje platta. Celltyperna definieras i vår tidigare publicerade rapport14.
- Odlingsisolerade neutrofiler med en densitet av 1 miljon celler/ml i basmediet vid 37 °C och 5 %CO2 i en konfokal platta med 2 ml cellmedium per platta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wright-Giemsa-färgade morfologin (figur 2A-D) och FACS-fenotyperna (figur 2E-J) hos de CLON-G-behandlade neutrofilerna påverkades inte. Viabiliteten hos CLON-G-behandlade neutrofiler vid 24 timmar var cirka 90%+ baserat på flödescytometrianalys (figur 3) och fluorescerande bildanalyser (figur 4). Lägre livskraft kan bero på felaktig lagring, felaktiga koncentrationer av CLON-G-komponenterna eller dålig kvalitet på de isolerade neutrofilerna. Flödescytometrianalysen av de obehandlade neutrofilerna som odlades med basmediet i 24 timmar visade att dessa neutrofiler hade en Annexin-V-positiv population (figur 3B). Förlusten av denna population kan bero på etylendiamintetraättiksyra (EDTA) i cellmediet. Fluorescensbilderna av neutrofiler odlade med basmediet i 24 timmar bör innehålla uppblåsta celler (vit pil i figur 4A). Förlusten av puffade celler kan bero på skakning eller pipettering av konfokalplattan.
Figur 1: Flödesschema över neutrofilodling med CLON-G och in vitro-dödtestet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Morfologi och fenotyper för cellytemarkörer hos CLON-G-behandlade musneutrofiler. Cellerna färgades (AD) med Wright-Giemsa-sammansatt fläck efter odling och bedömdes genom mikroskopi med en 40x objektivlins eller (E-I) färgades med APC-CD11b- och PE-Cy7-Ly6G-antikroppar och analyserades med flödescytometri. (J) Förhållandena mellan CD11b + och Ly6G + -cellerna vid de angivna tidpunkterna analyserades statistiskt. Skalstången är 10 μm. Data presenteras som medelvärden ± SD av tre experiment. ns = ingen statistiskt signifikant skillnad jämfört med motsvarande grupp. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Flödescytometrianalys av CLON-G-behandlade benmärgsneutrofiler från möss. (A) grindstrategi, (B) representativa resultat, och (C) neutrofilernas viabilitet efter odling i 24 timmar. Data presenteras som medelvärden ± SD av tre experiment. **P < 0,001 jämfört med motsvarande grupp. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Representativa resultat för neutrofildöd baserat på fluorescensbildanalysen. Neutrofil död efter odling med (A) basmedium i 24 timmar eller CLON-G i (B) 24 timmar, (C) 3 dagar eller (D) 5 dagar. Efter odling färgades cellerna med FITC-Annexin-V (grön) och PI (röd) och bedömdes med konfokal fluorescensmikroskopi. Skalstapeln är 40 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Neutrofiler spelar viktiga roller i medfödd och adaptiv immunitet, och deras homeostas är hårt reglerad. Neutrofiler är de vanligaste leukocyterna i humant perifert blod, och de har en robust och snabb omsättning. En frisk vuxen kan frigöra 1 x 109 neutrofiler/kg dagligen från benmärgen28. Neutrofilers död har därför blivit en av de förbryllande gåtorna på detta område, och mycket ansträngning har ägnats åt att bättre förstå dem. Caspase 29,30,31,32, LMP 33, ROS21,22,33, nekros 34,35,36,37 och nekropotos 18,38 har visat sig vara involverade i dessa heterogena processer. GM-CSF 24 och G-CSF23 kan förlänga neutrofillivslängden till cirka24timmar med undertryckta funktioner. CLON-G riktar in sig på alla kända mekanismer för neutrofil spontan död. Så vitt vi vet ger CLON-G för närvarande den längsta förlängningen av neutrofillivslängden in vitro utan att kompromissa med funktionen.
Flera förbehåll måste beaktas för att uppnå bästa resultat från neutrofilodling med CLON-G. Genom vår tidigare farmakologiska screening16 betonades att exakta koncentrationer av CLON-G-komponenterna är nyckeln till framgång och därmed att man bör försöka undvika att göra några misstag under beredningen och bevara dem ordentligt. När det gäller neutrofilmanipulation och rening är det lätt att aktivera och döda neutrofilerna; Därför bör de behandlas försiktigt under hela processen och odlas när de är isolerade. De är känsliga för cellkoncentrationen, odlingsplattans tillstånd, temperatur och pH; Man måste vara försiktig när man ändrar detta protokoll. När det gäller in vitro-dödanalysen har tidigare resultat visat att spontant döda neutrofiler sväller till uppblåsta celler som är oacceptabla för mekanisk kraft; spinning ner, pipettering och tvättning skulle minska antalet neutrofiler, och att ersätta standardbindningsbufferten med en CaCl2-lösning kan förenkla denna process och säkerställa korrekt avbildning av neutrofilerna14. Avvikelser mellan de tekniska dubbletterna i samma experiment kan bero på skumning under operationen. Skillnader mellan oberoende experiment kan bero på variationer i renhet och färskhet hos neutrofilerna39.
CLON-G kombinerar kända vägar och motsvarande hämmande kemikalier för att förhindra spontan neutrofildöd. Kärnfrågan inom detta område kvarstår dock när det gäller de komplicerade vägarna som förmedlar neutrofildöd, eftersom dessa fortfarande inte är helt förstådda. Döden av CLON-G-behandlade neutrofiler är oundviklig. CLON-G har alltså fortfarande utrymme för förbättringar. När det gäller komponenterna i CLON-G är de bästa valen kliniskt applicerade läkemedel för att utöka möjligheten till klinisk tillämpning av CLON-G-behandlade neutrofiler; Q-VD-oph och Rec-1s är dock endast för forskning, och kliniska prövningar som fokuserar på dem är för närvarande inte tillgängliga. Således är alternativa föreningar nödvändiga för klinisk tillämpning.
Genom att förlänga neutrofila livslängden till mer än 5 dagar med deras funktioner intakta, kan CLON-G låsa upp oändliga möjligheter för neutrofilforskning. Med detta utökade fönster kan observation, genmanipulation, långtidslagring, transport och kryokonservering utvecklas baserat på CLON-G. Arbets-, tids- och pengakostnaderna skulle minskas avsevärt, vilket skulle sänka inträdesbarriärerna för nya forskare. CLON-G kan också främja neutrofila kliniska tillämpningar som granulocyttransfusionsterapi. Neutropen infektion efter kemoterapi är en viktig dödsorsak för patienter som lider av cancer och hematopoetiska maligniteter 40,41,42,43,44. Granulocyttransfusionsterapi, som har stor potential som en alternativ terapi för att hjälpa dessa patienter, begränsas kraftigt av den korta livslängden hos neutrofiler45. Det nuvarande processflödet för granulocyttransfusion tar längre tid än livslängden för en neutrofil, vilket leder till att transfunderade neutrofiler förlorar sin effektivitet som en första linjens immuncell. CLON-G-behandling ger tillräckligt med tid för beredning av granulocyttransfusioner, som har potential att rädda otaliga liv för neutropenicinfekterade patienter och bidra till att mildra överanvändningen av antibiotika. Samtidigt kan det nuvarande protokollet för neutrofildödsanalysen exakt visa neutrofilernas status och förbättra reproducerbarheten av experimentella resultat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att forskningen genomfördes i avsaknad av intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta projekt stöddes av Haihe Laboratory of Cell Ecosystem Innovation Fund (22HHXBSS00036, 22HHXBSS00019), Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) Innovation Fund for Medical Sciences (2021-I2M-1-040,2022-I2M-JB-015), Special Research Fund for Central Universities, Peking Union Medical College (3332022062) och Science and Technology Support Program of Sichuan Province (NO. 2021YJ0480).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm syringe filter | Pall Corporation | 4612 | Filtrate prepared CLON-G components. |
| 1.5 mL micro centrifuge tube | LABSELECT | MCT-001-150 | Lab consumable. |
| 15 mL Centrifuge Tubes | LABSELECT | CT-002-15 | Lab consumable. |
| 24 well cell culture plate | Falcon | 351147 | Neutrophil culture plate. |
| 50 mL Centrifuge Tubes | LABSELECT | CT-002-50 | Lab consumable. |
| BD LSRII | BD | Instrument for flow cytometry analysis of neutrophil death. | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich | C4901 | Assitant of Annexin-V binding to phosphatidylserine. |
| Confocal microscope | Perkinelmer | UltraVIEW VOX | Instrument for fluorescent analysis of neutrophil death. |
| Confocal plate | NEST | 801001-20mm | Lab consumable for fluorescent image assay. |
| Counting beads | Thermo Fisher | C36950 | Quantification in flow cytometry analysis of neutrophil death. |
| DFO | Sigma Aldrich | D9533 | Component of CLON-G. LMP inhibitor. |
| Dimethyl sulfoxide ( DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | Solvent for Q-VD-oph and Nec-1s. |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10099141C | Component of neutrophil culture basic medium. Nutrition supply. |
| FITC-Annexin-V | BD | 51-65874X | Annexin-V can bind to phosphatidylserine of aged cells.This is at FITC channel. |
| Hsp70 | Abcam | ab113187 | Component of CLON-G. LMP inhibitor. |
| NAC | Sigma Aldrich | A9165 | Component of CLON-G. Antioxidant. |
| Nec-1s | EMD Millipore | 852391-15-2 | Component of CLON-G. Necroptosis inhibitor. |
| Penicillin-Streptomycin Solution (PS) | Gibco | 15070063 | Component of neutrophil culture basic medium. Antibiotics to protect cells from bacteria comtamination. |
| Propidium Iodide (PI) | BioLegend | 421301 | For neutrophil death assay. A small fluorescent molecule that binds to DNA but cannot passively traverse into cells that possess an intact plasma membrane. |
| Q-VD-oph | Selleck chem | S7311 | Component of CLON-G. Pan-caspase inhibitor. |
| Recombinant Human Granulocyte Colony-stimulating Factor for Injection (CHO cell)(G-CSF) | Chugai Pharma China | GRANOCYTE | Component of CLON-G. Promote neutrophil survival through Akt pathway. |
| Round-Bottom Polystyrene Tubes | Falcon | 100-0102 | Lab consumable for flow cytometry analysis. |
| RPMI1640 | Gibco | C11875500BT | Component of neutrophil culture basic medium. |
| Saline | LEAGENE | R00641 | Solution for flow cytometry analysis of neutrophil death. |
| Sodium hydroxide (NaOH) | FENG CHUAN | 13-011-00029 | pH adjustion for NAC. |
| Wright-Giemsa Stain Solution | Solarbio | G1020 | Neutrophil cytospin staining. |
References
- Segal, A. W.
- Rosales, C. Neutrophil: A cell with many roles in inflammation or several cell types. Frontiers in Physiology. 9, 113 (2018).
- Chung, S., Armstrong-Scott, O., Charlewood, R. Therapeutic granulocyte infusion for patients with severe neutropaenia and neutrophilic dysfunction: New Zealand experience. Vox Sanguinis. 117 (2), 220-226 (2021).
- Zhou, B., et al. Clinical outcome of granulocyte transfusion therapy for the treatment of refractory infection in neutropenic patients with hematological diseases. Annals of Hematology. 97 (11), 2061-2070 (2018).
- Covas, D. T., et al. Granulocyte transfusion combined with granulocyte colony stimulating factor in severe infection patients with severe aplastic anemia: A single center experience from China. PLoS One. 9 (2), e88148 (2014).
- Tecchio, C., Cassatella, M. A. Uncovering the multifaceted roles played by neutrophils in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Cellular & Molecular Immunology. 18 (4), 905-918 (2021).
- Lahoz-Beneytez, J., et al. Human neutrophil kinetics: Modeling of stable isotope labeling data supports short blood neutrophil half-lives. Blood. 127 (26), 3431-3438 (2016).
- Pillay, J., et al. In vivo labeling with 2H2O reveals a human neutrophil lifespan of 5.4 days. Blood. 116 (4), 625-627 (2010).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Tofts, P. S., Chevassut, T., Cutajar, M., Dowell, N. G., Peters, A. M. Doubts concerning the recently reported human neutrophil lifespan of 5.4 days. Blood. 117 (22), 6050-6052 (2011).
- McDonald, J. U., et al. In vivo functional analysis and genetic modification of in vitro-derived mouse neutrophils. FASEB Journal. 25 (6), 1972-1982 (2011).
- Pedruzzi, E., Fay, M., Elbim, C., Gaudry, M., Gougerot-Pocidalo, M. -A. Differentiation of PLB-985 myeloid cells into mature neutrophils, shown by degranulation of terminally differentiated compartments in response to N-formyl peptide and priming of superoxide anion production by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. British Journal of Haematology. 117 (3), 719-726 (2002).
- Blanter, M., Gouwy, M., Struyf, S. Studying neutrophil function in vitro: Cell models and environmental factors. Journal of Inflammation Research. 14, 141-162 (2021).
- Teng, Y., Luo, H. R., Kambara, H.
- Luo, H. R., Loison, F. Constitutive neutrophil apoptosis: Mechanisms and regulation. American Journal of Hematology. 83 (4), 288-295 (2008).
- Fan, Y., et al. Targeting multiple cell death pathways extends the shelf life and preserves the function of human and mouse neutrophils for transfusion. Science Translational Medicine. 13 (604), (2021).
- Caserta, T. M. Q-VD-OPh, a broad spectrum caspase inhibitor with potent antiapoptotic properties. Apoptosis. 8, 345-352 (2003).
- Wang, X., Yousefi, S., Simon, H. U.
- Loison, F., et al. Proteinase 3-dependent caspase-3 cleavage modulates neutrophil death and inflammation. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4445-4458 (2014).
- Kambara, H., et al. Gasdermin D exerts anti-inflammatory effects by promoting neutrophil death. Cell Reports. 22 (11), 2924-2936 (2018).
- Zhu, D., et al. Deactivation of phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate/Akt signaling mediates neutrophil spontaneous death. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (40), 14836-14841 (2006).
- Xu, Y., Loison, F., Luo, H. R. Neutrophil spontaneous death is mediated by down-regulation of autocrine signaling through GPCR, PI3Kgamma, ROS, and actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 2950-2955 (2010).
- van Raam, B. J., Drewniak, A., Groenewold, V., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Granulocyte colony-stimulating factor delays neutrophil apoptosis by inhibition of calpains upstream of caspase-3. Blood. 112 (5), 2046-2054 (2008).
- Klein, J. B., et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor delays neutrophil constitutive apoptosis through phosphoinositide 3-kinase and extracellular signal-regulated kinase pathways. Journal of Immunology. 164 (8), 4286-4291 (2000).
- Fan, Y., et al. Targeting multiple cell death pathways extends the shelf life and preserves the function of human and mouse neutrophils for transfusion. Science Translational Medicine. 13 (604), (2021).
- Xie, X., et al. Single-cell transcriptome profiling reveals neutrophil heterogeneity in homeostasis and infection. Nature Immunology. 21 (9), 1119-1133 (2020).
- Cosimo, E., et al. Inhibition of NF-kappaB-mediated signaling by the cyclin-dependent kinase inhibitor CR8 overcomes prosurvival stimuli to induce apoptosis in chronic lymphocytic leukemia cells. Clinical Cancer Research. 19 (9), 2393-2405 (2013).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Porter, A. G., Jänicke, R. U.
- Scheel-Toellner, D., et al. Clustering of death receptors in lipid rafts initiates neutrophil spontaneous apoptosis. Biochemical Society Transactions. 32, 679-681 (2004).
- Geering, B., Simon, H. U. Peculiarities of cell death mechanisms in neutrophils. Cell Death and Differentiation. 18 (9), 1457-1469 (2011).
- Gabelloni, M. L., Trevani, A. S., Sabatté, J., Geffner, J. Mechanisms regulating neutrophil survival and cell death. Seminars in Immunopathology. 35 (4), 423-437 (2013).
- Loison, F., et al. Proteinase 3-dependent caspase-3 cleavage modulates neutrophil death and inflammation. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4445-4458 (2014).
- Cho, Y. S., et al. Phosphorylation-driven assembly of the RIP1-RIP3 complex regulates programmed necrosis and virus-induced inflammation. Cell. 137 (6), 1112-1123 (2009).
- He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).
- Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148 (1-2), 213-227 (2012).
- Zhang, D. -W., et al. RIP3, an energy metabolism regulator that switches TNF-induced cell death from apoptosis to necrosis. Science. 325 (5938), 332-336 (2009).
- Wang, X., He, Z., Liu, H., Yousefi, S., Simon, H. -U. Neutrophil necroptosis is triggered by ligation of adhesion molecules following GM-CSF priming. Journal of Immunology. 197 (10), 4090-4100 (2016).
- Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. Journal of Visualized Experiments. (175), e62837 (2021).
- George, B., Bhattacharya, S. Infections in hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) patients. Contemporary Bone Marrow Transplantation. Chandy, M., Radhakrishnan, V. S., Sukumaran, R. , Springer. Cham, Switzerland. (2020).
- Lucena, C. M., et al. Pulmonary complications in hematopoietic SCT: A prospective study. Bone Marrow Transplant. 49 (10), 1293-1299 (2014).
- Tomblyn, M., et al. Guidelines for preventing infectious complications among hematopoietic cell transplantation recipients: A global perspective. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15 (10), 1143-1238 (2009).
- Wingard, J. R., Hiemenz, J. W., Jantz, M. A. How I manage pulmonary nodular lesions and nodular infiltrates in patients with hematologic malignancies or undergoing hematopoietic cell transplantation. Blood. 120 (9), 1791-1800 (2012).
- Wingard, J. R., Hsu, J., Hiemenz, J. W. Hematopoietic stem cell transplantation: An overview of infection risks and epidemiology. Infectious Disease Clinics of North America. 24 (2), 257-272 (2010).
- Netelenbos, T., et al. The burden of invasive infections in neutropenic patients: incidence, outcomes, and use of granulocyte transfusions. Transfusion. 59 (1), 160-168 (2019).
