Summary
Denne protokol beskriver forberedelsen af CLON-G for at forlænge neutrofilens levetid til mere end 5 dage og giver en pålidelig procedure til evaluering af neutrofildød med flowcytometri og konfokal fluorescensmikroskopi.
Abstract
Den gennemsnitlige levetid for en neutrofil er mindre end 24 timer, hvilket begrænser grundforskning på neutrofiler og anvendelsen af neutrofile undersøgelser. Vores tidligere forskning viste, at flere veje kunne formidle neutrofilers spontane død. En cocktail blev udviklet ved samtidig at målrette mod disse veje, caspaser-lysosomal membranpermeabilisering-oxidant-necroptose-hæmning plus granulocytkolonistimulerende faktor (CLON-G), som forlængede neutrofilens levetid til mere end 5 dage uden signifikant at kompromittere neutrofilfunktionen. Samtidig blev der også udviklet en pålidelig og stabil protokol til vurdering og evaluering af neutrofildød. I dette arbejde viser vi, at CLON-G kan forlænge den neutrofile levetid in vitro til mere end 5 dage, og vi udviser forlængelse af neutrofilens levetid med FACS og konfokal fluorescensmikroskopi. Denne rapport introducerer procedurer til fremstilling af CLON-G og viser et in vitro spontant dødsassay af neutrofiler, som kan bruges til undersøgelse af neutrofiler og til efterfølgende forhør af neutrofildød, hvilket giver en pålidelig ressource for neutrofilsamfundet.
Introduction
Neutrofiler er kendt for at omfatte et arsenal af rigelige cytoplasmatiske granulater, nicotinamid-adenin-dinukleotidphosphat (NADPH) oxidase, antimikrobielle enzymer og forskellige organeller, der forsvarer sig mod invaderende mikrober; Derudover er de meget bevægelige og er de første celler, der rekrutteres til inflammationsstedet, hvilket betyder, at neutrofiler er den første forsvarslinje for det medfødte immunsystem 1,2. Granulocyttransfusionsterapi er derfor blevet en lovende klinisk behandling for neutropeni-relaterede infektioner for forbigående at øge neutrofilimmunitet 3,4,5. Nylige opdagelser har tydeligt vist, at neutrofiler også fungerer som multifacetterede effektorer i mange fysiopatologiske scenarier6. Den gennemsnitlige levetid for en neutrofil er mindre end 24 timer, og derfor er grundforskning i neutrofiler og anvendelse af neutrofile undersøgelser enormt vanskelig på grund af begrænsningerne relateret til stabil genetisk manipulation og langtidsopbevaring 7,8,9,10,11 . Der er nogle cellelinjer, der delvist kan fremvise nogle neutrofile funktioner, såsom HL-60, PLB-985, NB4, Kasumi-1 og inducerede pluripotente stamceller12. Disse cellelinjer kan opnå effektiv genredigering og kryopræservering; De adskiller sig dog stadig ganske uhyre fra primære neutrofiler og kan derfor ikke trofast rekapitulere neutrofile funktioner13. Således er det meste af forskningen på dette område stadig afhængig af nyligt isolerede primære neutrofiler. Feltet er stadig afhængigt af at generere dyre og tidskrævende betingede knock-out-mus til at undersøge specifikke genfunktioner i neutrofiler, men der findes i øjeblikket ingen menneskelige modeller.
Efter at have lagt vores indsats i at udforske de heterogene processer, der er involveret i neutrofildød og de mange veje, der regulerer disse processer14,15, blev en ny behandling kaldet CLON-G (caspases-lysosomal membranpermeabilisering-oxidant-necroptose-hæmning plus granulocytkolonistimulerende faktor) for nylig rapporteret 16. CLON-G består af Q-VD-oph (quinolyl-valyl-O-methylaspartyl-[-2,6-difluorofenoxy]-methylketon), Hsp70 (varmechokprotein 70), DFO (deferoxamin), NAC (N-acetylcystein), Nec-1'er (nekrostatin-1'er) og G-CSF (granulocytkolonistimulerende faktor). Neutrofil spontan død medieres af flere veje, herunder apoptose, nekrotose og pyroptose. Q-VD-oph hæmmer apoptose af neutrofiler som en pan-caspasehæmmer ved at målrette caspase 1, caspase 3, caspase 8 og caspase 917. Neutrofil nekrotose er afhængig af en signalvej, der involverer receptorinteragerende proteinkinase-1 (RIPK1) og blandet afstamningskinase domænelignende protein (MLKL)18. Som en RIPK1-hæmmer Nec-1'er neutrofilers nekrotose. Hsp70 og DFO kan hæmme lysosomal membranpermeabilisering (LMP), hvilket kan inducere neutrofil apoptose19 og pyroptose20. Reaktive iltarter (ROS) spiller afgørende roller i neutrofildød ved at formidle LMP19 og apoptose21 og ved at hæmme overlevelsessignaler22. Som en antioxidant, der kan reducere ROS akkumulering, NAC forsinkelser neutrofil død. Som en vækstfaktor aktiverer G-CSF neutrofile overlevelsessignaler og hæmmer calpain-induceret apoptose23,24. Ved samtidig at målrette mod flere neutrofile spontane dødsveje kan den neutrofile levetid effektivt forlænges til mere end 5 dage uden at kompromittere deres funktion. CLON-G-behandling udvider mulighederne for neutrofilbevarelse, transport og genmanipulation, hvilket kan fremskynde forskning i neutrofilsamfundet. I mellemtiden, baseret på viden om neutrofil død, kan de aktuelt godkendte protokoller for celledødsanalyser forårsage uventet skade på neutrofiler14, så disse protokoller er blevet raffineret til at være mere passende til neutrofile undersøgelser. Denne rapport indeholder detaljerede protokoller for neutrofildyrkning med CLON-G og et in vitro-celledødsassay af museneutrofiler ved hjælp af flowcytometri og fluorescensbilleddannelse. CLON-G er effektiv på både mus og humane neutrofiler; Museksemplerne er dog demonstreret her for at forenkle denne protokol. Koncentrationen af NAC er 1 mM for museneutrofiler og 10 μM for humane neutrofiler. Hsp70 er artsspecifik og bør derfor anvendes i henhold til kilden til neutrofilen. For denne protokol er det ligegyldigt, om neutrofiler isoleres fra perifert blod eller knoglemarv, og hvordan de isoleres.
Til denne undersøgelse blev neutrofiler isoleret fra museknoglemarven for at opnå nok neutrofiler til forsøgene, da ca. 1 x 10 7-1,5 x 107 neutrofiler kan opnås fra knoglemarven, mens kun 1 x 10 6 neutrofiler kan isoleres fra det perifere blod fra en enkelt 8-12 uger gammel C57BL/6-mus (af begge køn). Gradientcentrifugering blev udført for at undgå mulig skade og aktivering fra den mekaniske stimulering af FACS-sortering eller MACS-sortering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Boston Children's Hospital og State Key Laboratory of Experimental Hematology (SKLEH) Animal Care and Use Committee godkendte og overvågede alle procedurerne. Figur 1 viser et rutediagram over neutrofildyrkning med CLON-G og in vitro-dødsassayet .
1. Neutrofil levetidsforlængelse med CLON-G
BEMÆRK: Alle de nævnte operationer og materialer skal være sterile. Sørg for, at alle opløsninger er godt blandet og fordelt jævnt.
- Bevarelse af CLON-G-komponenterne
- 50 mg Q-VD-oph (se materialetabel) opløses til en slutkoncentration på 100 mM ved tilsætning af 973,7 μL dimethylsulfoxid (DMSO), og væsken pipetteres, indtil blandingen bliver klar. Aliquot 50 μL pr. reagensglas og opbevares ved -20 °C.
FORSIGTIG: DMSO er en skadelig kemisk væske. Brug en laboratoriefrakke, beskyttelsesbriller og en maske for at undgå hudkontakt, øjenkontakt og indånding. - Hsp70 (se materialetabellen) tøs op ved 4 °C, og centrifuger indholdet i hætteglasset ned. Alikvote 1 μL Hsp70 pr. rør på is og opbevares ved -80 °C.
BEMÆRK: Hsp70 er et protein; Ultrakold opbevaring er nødvendig for at holde den stabil. Undgå fryse-optøningscyklussen. - 1 mg DFO (se materialetabel) opløses med 7,61 ml RPMI 1640 for at opnå et lager på 200 μM. Aliquot 500 μL pr. reagensglas, og konserveres ved -20 °C.
- 0,1 g NAC (se materialetabel) opløses med 2,5 ml RPMI 1640 i et 15 ml centrifugeglas, og pH-værdien justeres til 7-7,4 med NaOH. Tilføj RPMI 1640 til en endelig volumen på 3,06 ml for at lave en 200 mM NAC-lager. Filtrer det med en 0,2 μm filtreringsenhed. Aliquot 500 μL pr. reagensglas og opbevares ved -20 °C.
BEMÆRK: Opløsning af NAC i denne høje koncentration er ikke let, og hvirvelstrøm kan hjælpe med at opløse den. Fenolrød i RPMI 1640 er en perfekt indikation af pH; når NAC lige er opløst, er farven gullig; Juster det, indtil det bliver lyserødt. NAC-stamopløsninger er stabile i op til 1 måned ved -20 °C. - 10 mg Nec-1'er (se materialetabellen) opløses til 20 mM med 1,8 ml DMSO, og blandingen pipetteres, indtil den bliver klar. Aliquot 50 μL pr. reagensglas og opbevares ved -20 °C. Beskyt mod lys.
- 250 μg G-CSF (se materialetabel) opløses til 200 μg/ml med 1,25 ml RPMI 1640. Alikvote 50 μL pr. reagensglas og konserveres ved 4 °C.
- 50 mg Q-VD-oph (se materialetabel) opløses til en slutkoncentration på 100 mM ved tilsætning af 973,7 μL dimethylsulfoxid (DMSO), og væsken pipetteres, indtil blandingen bliver klar. Aliquot 50 μL pr. reagensglas og opbevares ved -20 °C.
- Fremstilling af 2x CLON-G kulturmedium
- Forbered basismediet. Tilsæt 39,5 ml RPMI 1640, 10 ml føtalt bovint serum (FBS) og 0,5 ml pen-strep (antibiotika) til et 50 ml rør for at gøre RPMI 1640 med 20% FBS og 1% PS som basisk medium.
BEMÆRK: Denne høje koncentration af FBS bruges til at sørge for den langvarige kultur af neutrofiler, som kan være større end 5 dage. Hvis dyrkningstiden er 1-2 dage, er 10% -15% FBS tilstrækkelig. - Optø alle lageropløsningerne af CLON-G-komponenterne på is.
- 1 μL Hsp70 fortyndes til 20 μM ved tilsætning af 606 μL basismedium. 1 μL 200 μg/mL G-CSF fortyndes til 20 μg/ml ved tilsætning af 9 μL basissubstrat.
- Der tilsættes 976 μL basisk substrat til et 15 ml centrifugeglas. Tilsæt 1 μL Q-VD-oph (100 mM), 10 μL DFO (200 μM), 1 μL Hsp70 (20 μM), 10 μL NAC (200 mM), 1 μL Nec-1s (20 mM) og 1 μL G-CSF (20 μg / ml) for at fremstille 1 ml 2x CLON-G-medium.
BEMÆRK: 2x CLON-G-mediet skal anvendes umiddelbart efter, at det er klargjort. Man kan opbevare 2x CLON-G midlertidigt ved 4 °C. Rester af 20 μM Hsp70 skal kasseres.
- Forbered basismediet. Tilsæt 39,5 ml RPMI 1640, 10 ml føtalt bovint serum (FBS) og 0,5 ml pen-strep (antibiotika) til et 50 ml rør for at gøre RPMI 1640 med 20% FBS og 1% PS som basisk medium.
- Neutrofil kultur
- Museneutrofiler isoleres ved gradientcentrifugering efter en tidligere rapport25. Resuspender de isolerede museneutrofiler i basismediet (1 million celler/100 μl).
BEMÆRK: Undgå at aktivere neutrofilerne ved at håndtere dem forsigtigt. Undgå skumdannelse under hele processen. - Der tilsættes 500 μL 2x CLON-G-medium, 400 μL af basismediet og 100 μL af cellesuspensionen til 24-brønds ikke-vævsdyrkede kulturplader (se materialetabellen), og pipetten afpipetteres forsigtigt tre til fire gange.
BEMÆRK: Høje koncentrationer af komponenterne i 2x CLON-G-mediet kan beskadige neutrofilerne; Undgå at tilføje dem sammen uden det grundlæggende medium. Den ikke-vævsdyrkede kulturplade er nødvendig for at undgå neutrofil vedhæftning. - Kulturpladen anbringes jævnt i en 37 °C og 5 % CO2 -inkubator.
BEMÆRK: Det er unødvendigt at udskifte cellemediet inden for 7 dage. De endelige koncentrationer af CLON-G-sammensætningen er 50 μM Q-VD-Oph, 1 μM DFO, 10 pM Hsp70, 1 mM NAC, 10 μM Nec-1 s og 10 ng/mL G-CSF. - Plet de dyrkede neutrofiler med Wright Giemsa-sammensat plet (se materialetabel), og analyser med et lysmikroskop (figur 2A-D). Alternativt kan du plette med APC-CD11b- og PE-Cy7-Ly6G-antistoffer og analysere med flowcytometri (figur 2E-I) som beskrevet tidligere26.
- Museneutrofiler isoleres ved gradientcentrifugering efter en tidligere rapport25. Resuspender de isolerede museneutrofiler i basismediet (1 million celler/100 μl).
2. In vitro spontan dødsanalyse af neutrofiler
- Flow cytometri analyse
- Dyrkning isolerede neutrofiler med en densitet på 1 million celler/ml i basismediet ved 37 °C og 5% CO2. Kulturpladen med 24 brønde er ikke-vævsdyrket. Tilsæt 1 ml cellemedium pr. Hul.
- 1 g CaCl2 opløses med 45 ml saltvand til 200 mMCaCl2. Filtrer det med en 0,2 μm filtreringsenhed. Konserveres ved 4 °C.
- Forbered farvningsblandingen. Der tilsættes 7 μL saltvand pr. prøve til et 1,5 ml glas, og der tilsættes 0,4 mg/ml FITC-Annexin-V, 0,5 mg/ml propidiumiodid (PI) og 200 mMCaCl2-opløsning ved 1 μL hver pr. prøve. Bland godt. Brug opløsningen umiddelbart efter tilberedning.
- Cellemediet pipetteres forsigtigt fem til syv gange for at blande godt, efterfulgt af overførsel af 100 μL til et flowcytometrirør på de ønskede tidspunkter.
BEMÆRK: Undgå skumdannelse under hele processen. - Hvirveltællende perler (se tabel over materialer) for at blande dem godt. Der pipetteres 10 μL af de godt blandede tælleperler til det samme flowcytometrirør som i trin 2.1.4.
- Der tilsættes 10 μL den fremstillede farvningsblanding (trin 2.1.3) til flowcytometrirøret. Inkuber ved stuetemperatur i 5 minutter væk fra lys.
- Tilsæt 100 μL saltvand til røret, og bland godt for at sikre en jævn fordeling af tælleperlerne og cellerne.
- Udfør flowcytometrianalyse af cellemediet. Saml cellerne med en lav hastighed med ~ 400 hændelser / s. APC-PE-Cy7-cellerne skal porteres til FSC-A og SSC-A, og de intakte celler med mellemstore FSC-A- og SSC-A-positioner skal forbindes med FITC-Annexin-V og PE-PI. Annexin-V-PI-populationen klassificeres som raske celler.
BEMÆRK: Følgende ligninger bestemmer det samlede antal sunde celler pr. prøve og levedygtigheden af neutrofilerne:
Samlet antal raske celler pr. prøve27 = (1.000/antal tælleperler) × antal Annexin-V-PI-populationer × 10
Neutrofilers levedygtighed = samlet antal raske celler på det angivne tidspunkt/samlet antal raske celler på nul
- Fluorescerende billedanalyse
- Dyrkning isolerede neutrofiler ved en densitet på 1 million celler / ml i basismediet ved 37 ° C og 5% CO 2 i en konfokal plade med2 ml cellemedium pr. Plade.
BEMÆRK: Et konfokal fluorescensmikroskop har den bedste billedkvalitet, men ethvert fluorescensmikroskop, der har 488/561 / DIC-kanaler, er tilstrækkeligt til at understøtte dette eksperiment. - Tag forsigtigt pladen ud på det angivne tidspunkt. Der tilsættes 10 μL hver på 0,4 mg/ml FITC-Annexin-V, 0,5 mg/ml PI og 200 mMCaCl2 jævnt til pladen. Plet ved stuetemperatur i 5 min.
BEMÆRK: Undgå at ryste under hele processen. Tilsæt farvningsmidlerne jævnt og forsigtigt. - Tag fluorescensbilleder ved 488 (annexin-V)/561 (PI)/DIC-kanaler ved hjælp af et konfokal fluorescensmikroskop med en 20x objektivlinse (se materialetabel). Indstil eksponeringstiden for 488-kanalen til 500 ms, 561-kanalen som 200 ms og DIC-kanalen til 100 ms. Vælg 5-10 tilfældige områder for hver plade. Celletyperne er defineret i vores tidligere offentliggjorte rapport14.
- Dyrkning isolerede neutrofiler ved en densitet på 1 million celler / ml i basismediet ved 37 ° C og 5% CO 2 i en konfokal plade med2 ml cellemedium pr. Plade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wright-Giemsa-farvede morfologi (figur 2A-D) og FACS-fænotyper (figur 2E-J) af de CLON-G-behandlede neutrofiler blev ikke påvirket. Levedygtigheden af de CLON-G-behandlede neutrofiler ved 24 timer var ca. 90%+ baseret på flowcytometrianalyse (figur 3) og fluorescerende billedassays (figur 4). Lavere levedygtighed kan skyldes forkert opbevaring, forkerte koncentrationer af CLON-G-komponenterne eller dårlig kvalitet af de startende isolerede neutrofiler. Flowcytometrianalysen af de ubehandlede neutrofiler, der blev dyrket med basismediet i 24 timer, viste, at disse neutrofiler havde en Annexin-V-positiv population (figur 3B). Tabet af denne population kan skyldes ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) i cellemediet. Fluorescensbillederne af neutrofilerne, der dyrkes med basismediet i 24 timer, skal indeholde puffede celler (hvid pil i figur 4A). Tabet af puffede celler kan skyldes omrystning eller pipettering af den konfokale plade.
Figur 1: Rutediagram over neutrofildyrkning med CLON-G og in vitro dødsassay. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Morfologi og fænotyper af celleoverflademarkører af de CLON-G-behandlede museneutrofiler. Cellerne blev (A-D) farvet med Wright-Giemsa-sammensat plet efter dyrkning og vurderet ved mikroskopi ved hjælp af en 40x objektiv linse eller (E-I) farvet med APC-CD11b og PE-Cy7-Ly6G-antistoffer og analyseret med flowcytometri. (J) Forholdet mellem CD11b + og Ly6G + cellerne på de angivne tidspunkter blev statistisk analyseret. Skalabjælken er 10 μm. Data præsenteres som midler ± SD af tre eksperimenter. ns = ingen statistisk signifikant forskel sammenlignet med den tilsvarende gruppe. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Flowcytometrianalyse af CLON-G-behandlede museknoglemarvsneutrofiler . (A) Gating strategi, (B) repræsentative resultater, og (C) levedygtigheden af neutrofilerne efter dyrkning i 24 timer. Data præsenteres som midler ± SD af tre eksperimenter. **P < 0,001 sammenlignet med den tilsvarende gruppe. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentative resultater for neutrofildød baseret på fluorescensbilledassayet. Neutrofil død efter dyrkning med (A) basisk substrat i 24 timer eller CLON-G i (B) 24 timer, (C) 3 dage eller (D) 5 dage. Efter dyrkning blev cellerne farvet med FITC-Annexin-V (grøn) og PI (rød) og vurderet ved konfokal fluorescensmikroskopi. Skalabjælken er 40 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Neutrofiler spiller afgørende roller i medfødt og adaptiv immunitet, og deres homeostase er tæt reguleret. Neutrofiler er de mest rigelige leukocytter i humant perifert blod, og de har en robust og hurtig omsætning. En sund voksen kan frigive 1 x 109 neutrofiler / kg dagligt fra knoglemarven28. Neutrofilers død er derfor blevet en af de gådefulde gåder på dette område, og der er gjort en stor indsats for bedre at forstå dem. Caspase 29,30,31,32, LMP 33, ROS21,22,33, nekrose 34,35,36,37 og nekropolose 18,38 har vist sig at være involveret i disse heterogene processer. GM-CSF 24 og G-CSF23 kan forlænge den neutrofile levetid til ca.24timer med undertrykte funktioner. CLON-G retter sig mod alle kendte neutrofile spontane dødsmekanismer. Så vidt vi ved, giver CLON-G i øjeblikket den længste forlængelse af neutrofilens levetid in vitro uden at gå på kompromis med funktionen.
Flere forbehold skal overvejes for at opnå de bedste resultater fra neutrofil dyrkning med CLON-G. Gennem vores tidligere farmakologiske screening16 blev det understreget, at nøjagtige koncentrationer af CLON-G-komponenterne er nøglen til succes, og at man derfor bør forsøge at undgå at lave fejl under forberedelsen og bevare dem korrekt. Med hensyn til neutrofil manipulation og oprensning er det let at aktivere og dræbe neutrofilerne; Derfor bør de behandles forsigtigt under hele processen og dyrkes, når de er isoleret. De er følsomme over for cellekoncentrationen, kulturpladens tilstand, temperatur og pH; Man skal være forsigtig, når man ændrer denne protokol. Med hensyn til in vitro-dødsanalysen har tidligere resultater vist, at spontant døde neutrofiler svulmer op til oppustede celler, der er uacceptable for mekanisk kraft; Centrifugering, pipettering og vask ville reducere antallet af neutrofiler, og udskiftning af standardbindingsbufferen med en CaCl2-opløsning kan forenkle denne proces og sikre en nøjagtig skildring af neutrofilerne14. Uoverensstemmelser mellem de tekniske duplikater i samme eksperiment kan skyldes skumdannelse under operationen. Forskelle mellem uafhængige eksperimenter kan skyldes variationer i renheden og friskheden af neutrofilerne39.
CLON-G kombinerer kendte veje og tilsvarende hæmmende kemikalier for at forhindre spontan neutrofil død. Imidlertid forbliver kernespørgsmålet på dette felt vedrørende de komplicerede veje, der formidler neutrofil død, da disse stadig ikke forstås fuldt ud. Døden af CLON-G-behandlede neutrofiler er uundgåelig. Således har CLON-G stadig plads til forbedringer. Hvad angår komponenterne i CLON-G, er de bedste valg klinisk anvendte lægemidler til at udvide muligheden for klinisk anvendelse af CLON-G-behandlede neutrofiler; Q-VD-oph og Rec-1'er er dog kun til forskning, og kliniske forsøg med fokus på dem er i øjeblikket ikke tilgængelige. Således er alternative forbindelser nødvendige til klinisk anvendelse.
Ved at forlænge den neutrofile levetid til mere end 5 dage med deres funktioner intakte, kan CLON-G låse op for uendelige muligheder for neutrofil forskning. Med dette udvidede vindue kan observation, genmanipulation, langtidsopbevaring, transport og kryopræservering udvikles baseret på CLON-G. Arbejds-, tids- og pengeomkostningerne ville blive reduceret betydeligt, hvilket ville sænke adgangsbarriererne for nye forskere. CLON-G kan også fremme neutrofile kliniske anvendelser som granulocyttransfusionsterapi. Neutropenisk infektion efter kemoterapi er en væsentlig dødsårsag for patienter, der lider af kræft og hæmatopoietiske maligniteter 40,41,42,43,44. Granulocyttransfusionsterapi, som har stort potentiale som en alternativ behandling til at hjælpe disse patienter, er stærkt begrænset af den korte levetid for neutrofiler45. Den nuværende processtrøm til granulocyttransfusion tager længere tid end levetiden for en neutrofil, hvilket fører til, at transfunderede neutrofiler mister deres effektivitet som en førstelinjeimmuncelle. CLON-G-behandling giver tilstrækkelig tid til fremstilling af granulocyttransfusioner, som har potentiale til at redde utallige liv for neutropenisk-inficerede patienter og hjælpe med at afbøde overforbrug af antibiotika. Samtidig kan den nuværende protokol for neutrofildødsanalysen nøjagtigt demonstrere neutrofilers status og forbedre replikabiliteten af eksperimentelle resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at forskningen blev udført i mangel af interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette projekt blev støttet af Haihe Laboratory of Cell Ecosystem Innovation Fund (22HHXBSS00036, 22HHXBSS00019), Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) Innovation Fund for Medical Sciences (2021-I2M-1-040,2022-I2M-JB-015), Special Research Fund for Central Universities, Peking Union Medical College (3332022062) og Science and Technology Support Program of Sichuan-provinsen (NO. 2021YJ0480).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm syringe filter | Pall Corporation | 4612 | Filtrate prepared CLON-G components. |
| 1.5 mL micro centrifuge tube | LABSELECT | MCT-001-150 | Lab consumable. |
| 15 mL Centrifuge Tubes | LABSELECT | CT-002-15 | Lab consumable. |
| 24 well cell culture plate | Falcon | 351147 | Neutrophil culture plate. |
| 50 mL Centrifuge Tubes | LABSELECT | CT-002-50 | Lab consumable. |
| BD LSRII | BD | Instrument for flow cytometry analysis of neutrophil death. | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich | C4901 | Assitant of Annexin-V binding to phosphatidylserine. |
| Confocal microscope | Perkinelmer | UltraVIEW VOX | Instrument for fluorescent analysis of neutrophil death. |
| Confocal plate | NEST | 801001-20mm | Lab consumable for fluorescent image assay. |
| Counting beads | Thermo Fisher | C36950 | Quantification in flow cytometry analysis of neutrophil death. |
| DFO | Sigma Aldrich | D9533 | Component of CLON-G. LMP inhibitor. |
| Dimethyl sulfoxide ( DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | Solvent for Q-VD-oph and Nec-1s. |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10099141C | Component of neutrophil culture basic medium. Nutrition supply. |
| FITC-Annexin-V | BD | 51-65874X | Annexin-V can bind to phosphatidylserine of aged cells.This is at FITC channel. |
| Hsp70 | Abcam | ab113187 | Component of CLON-G. LMP inhibitor. |
| NAC | Sigma Aldrich | A9165 | Component of CLON-G. Antioxidant. |
| Nec-1s | EMD Millipore | 852391-15-2 | Component of CLON-G. Necroptosis inhibitor. |
| Penicillin-Streptomycin Solution (PS) | Gibco | 15070063 | Component of neutrophil culture basic medium. Antibiotics to protect cells from bacteria comtamination. |
| Propidium Iodide (PI) | BioLegend | 421301 | For neutrophil death assay. A small fluorescent molecule that binds to DNA but cannot passively traverse into cells that possess an intact plasma membrane. |
| Q-VD-oph | Selleck chem | S7311 | Component of CLON-G. Pan-caspase inhibitor. |
| Recombinant Human Granulocyte Colony-stimulating Factor for Injection (CHO cell)(G-CSF) | Chugai Pharma China | GRANOCYTE | Component of CLON-G. Promote neutrophil survival through Akt pathway. |
| Round-Bottom Polystyrene Tubes | Falcon | 100-0102 | Lab consumable for flow cytometry analysis. |
| RPMI1640 | Gibco | C11875500BT | Component of neutrophil culture basic medium. |
| Saline | LEAGENE | R00641 | Solution for flow cytometry analysis of neutrophil death. |
| Sodium hydroxide (NaOH) | FENG CHUAN | 13-011-00029 | pH adjustion for NAC. |
| Wright-Giemsa Stain Solution | Solarbio | G1020 | Neutrophil cytospin staining. |
References
- Segal, A. W.
- Rosales, C. Neutrophil: A cell with many roles in inflammation or several cell types. Frontiers in Physiology. 9, 113 (2018).
- Chung, S., Armstrong-Scott, O., Charlewood, R. Therapeutic granulocyte infusion for patients with severe neutropaenia and neutrophilic dysfunction: New Zealand experience. Vox Sanguinis. 117 (2), 220-226 (2021).
- Zhou, B., et al. Clinical outcome of granulocyte transfusion therapy for the treatment of refractory infection in neutropenic patients with hematological diseases. Annals of Hematology. 97 (11), 2061-2070 (2018).
- Covas, D. T., et al. Granulocyte transfusion combined with granulocyte colony stimulating factor in severe infection patients with severe aplastic anemia: A single center experience from China. PLoS One. 9 (2), e88148 (2014).
- Tecchio, C., Cassatella, M. A. Uncovering the multifaceted roles played by neutrophils in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Cellular & Molecular Immunology. 18 (4), 905-918 (2021).
- Lahoz-Beneytez, J., et al. Human neutrophil kinetics: Modeling of stable isotope labeling data supports short blood neutrophil half-lives. Blood. 127 (26), 3431-3438 (2016).
- Pillay, J., et al. In vivo labeling with 2H2O reveals a human neutrophil lifespan of 5.4 days. Blood. 116 (4), 625-627 (2010).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Tofts, P. S., Chevassut, T., Cutajar, M., Dowell, N. G., Peters, A. M. Doubts concerning the recently reported human neutrophil lifespan of 5.4 days. Blood. 117 (22), 6050-6052 (2011).
- McDonald, J. U., et al. In vivo functional analysis and genetic modification of in vitro-derived mouse neutrophils. FASEB Journal. 25 (6), 1972-1982 (2011).
- Pedruzzi, E., Fay, M., Elbim, C., Gaudry, M., Gougerot-Pocidalo, M. -A. Differentiation of PLB-985 myeloid cells into mature neutrophils, shown by degranulation of terminally differentiated compartments in response to N-formyl peptide and priming of superoxide anion production by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. British Journal of Haematology. 117 (3), 719-726 (2002).
- Blanter, M., Gouwy, M., Struyf, S. Studying neutrophil function in vitro: Cell models and environmental factors. Journal of Inflammation Research. 14, 141-162 (2021).
- Teng, Y., Luo, H. R., Kambara, H.
- Luo, H. R., Loison, F. Constitutive neutrophil apoptosis: Mechanisms and regulation. American Journal of Hematology. 83 (4), 288-295 (2008).
- Fan, Y., et al. Targeting multiple cell death pathways extends the shelf life and preserves the function of human and mouse neutrophils for transfusion. Science Translational Medicine. 13 (604), (2021).
- Caserta, T. M. Q-VD-OPh, a broad spectrum caspase inhibitor with potent antiapoptotic properties. Apoptosis. 8, 345-352 (2003).
- Wang, X., Yousefi, S., Simon, H. U.
- Loison, F., et al. Proteinase 3-dependent caspase-3 cleavage modulates neutrophil death and inflammation. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4445-4458 (2014).
- Kambara, H., et al. Gasdermin D exerts anti-inflammatory effects by promoting neutrophil death. Cell Reports. 22 (11), 2924-2936 (2018).
- Zhu, D., et al. Deactivation of phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate/Akt signaling mediates neutrophil spontaneous death. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (40), 14836-14841 (2006).
- Xu, Y., Loison, F., Luo, H. R. Neutrophil spontaneous death is mediated by down-regulation of autocrine signaling through GPCR, PI3Kgamma, ROS, and actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 2950-2955 (2010).
- van Raam, B. J., Drewniak, A., Groenewold, V., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Granulocyte colony-stimulating factor delays neutrophil apoptosis by inhibition of calpains upstream of caspase-3. Blood. 112 (5), 2046-2054 (2008).
- Klein, J. B., et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor delays neutrophil constitutive apoptosis through phosphoinositide 3-kinase and extracellular signal-regulated kinase pathways. Journal of Immunology. 164 (8), 4286-4291 (2000).
- Fan, Y., et al. Targeting multiple cell death pathways extends the shelf life and preserves the function of human and mouse neutrophils for transfusion. Science Translational Medicine. 13 (604), (2021).
- Xie, X., et al. Single-cell transcriptome profiling reveals neutrophil heterogeneity in homeostasis and infection. Nature Immunology. 21 (9), 1119-1133 (2020).
- Cosimo, E., et al. Inhibition of NF-kappaB-mediated signaling by the cyclin-dependent kinase inhibitor CR8 overcomes prosurvival stimuli to induce apoptosis in chronic lymphocytic leukemia cells. Clinical Cancer Research. 19 (9), 2393-2405 (2013).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Porter, A. G., Jänicke, R. U.
- Scheel-Toellner, D., et al. Clustering of death receptors in lipid rafts initiates neutrophil spontaneous apoptosis. Biochemical Society Transactions. 32, 679-681 (2004).
- Geering, B., Simon, H. U. Peculiarities of cell death mechanisms in neutrophils. Cell Death and Differentiation. 18 (9), 1457-1469 (2011).
- Gabelloni, M. L., Trevani, A. S., Sabatté, J., Geffner, J. Mechanisms regulating neutrophil survival and cell death. Seminars in Immunopathology. 35 (4), 423-437 (2013).
- Loison, F., et al. Proteinase 3-dependent caspase-3 cleavage modulates neutrophil death and inflammation. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4445-4458 (2014).
- Cho, Y. S., et al. Phosphorylation-driven assembly of the RIP1-RIP3 complex regulates programmed necrosis and virus-induced inflammation. Cell. 137 (6), 1112-1123 (2009).
- He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).
- Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148 (1-2), 213-227 (2012).
- Zhang, D. -W., et al. RIP3, an energy metabolism regulator that switches TNF-induced cell death from apoptosis to necrosis. Science. 325 (5938), 332-336 (2009).
- Wang, X., He, Z., Liu, H., Yousefi, S., Simon, H. -U. Neutrophil necroptosis is triggered by ligation of adhesion molecules following GM-CSF priming. Journal of Immunology. 197 (10), 4090-4100 (2016).
- Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. Journal of Visualized Experiments. (175), e62837 (2021).
- George, B., Bhattacharya, S. Infections in hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) patients. Contemporary Bone Marrow Transplantation. Chandy, M., Radhakrishnan, V. S., Sukumaran, R. , Springer. Cham, Switzerland. (2020).
- Lucena, C. M., et al. Pulmonary complications in hematopoietic SCT: A prospective study. Bone Marrow Transplant. 49 (10), 1293-1299 (2014).
- Tomblyn, M., et al. Guidelines for preventing infectious complications among hematopoietic cell transplantation recipients: A global perspective. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15 (10), 1143-1238 (2009).
- Wingard, J. R., Hiemenz, J. W., Jantz, M. A. How I manage pulmonary nodular lesions and nodular infiltrates in patients with hematologic malignancies or undergoing hematopoietic cell transplantation. Blood. 120 (9), 1791-1800 (2012).
- Wingard, J. R., Hsu, J., Hiemenz, J. W. Hematopoietic stem cell transplantation: An overview of infection risks and epidemiology. Infectious Disease Clinics of North America. 24 (2), 257-272 (2010).
- Netelenbos, T., et al. The burden of invasive infections in neutropenic patients: incidence, outcomes, and use of granulocyte transfusions. Transfusion. 59 (1), 160-168 (2019).
