Summary
Dit protocol beschrijft de voorbereiding van CLON-G om de levensduur van neutrofielen te verlengen tot meer dan 5 dagen en biedt een betrouwbare procedure voor het evalueren van neutrofielensterfte met flowcytometrie en confocale fluorescentiemicroscopie.
Abstract
De gemiddelde levensduur van een neutrofiel is minder dan 24 uur, wat fundamenteel onderzoek naar neutrofielen en de toepassing van neutrofielenstudies beperkt. Ons eerdere onderzoek gaf aan dat meerdere routes de spontane dood van neutrofielen konden bemiddelen. Een cocktail werd ontwikkeld door zich tegelijkertijd te richten op deze routes, caspasen-lysosomale membraanpermeabilisatie-oxidant-necroptose-remming plus granulocytkoloniestimulerende factor (CLON-G), die de levensduur van neutrofielen verlengde tot meer dan 5 dagen zonder de neutrofiele functie aanzienlijk in gevaar te brengen. Tegelijkertijd werd ook een betrouwbaar en stabiel protocol ontwikkeld voor het beoordelen en evalueren van neutrofielensterfte. In dit werk laten we zien dat CLON-G de levensduur van neutrofielen in vitro kan verlengen tot meer dan 5 dagen, en we tonen de verlenging van de levensduur van neutrofielen met FACS en confocale fluorescentiemicroscopie. Dit rapport introduceert procedures voor de bereiding van CLON-G en toont een in vitro spontane doodstest van neutrofielen, die kan worden gebruikt voor de studie van neutrofielen en voor het vervolgens ondervragen van neutrofielendood, waardoor een betrouwbare bron voor de neutrofielengemeenschap wordt geboden.
Introduction
Van neutrofielen is bekend dat ze bestaan uit een arsenaal van overvloedige cytoplasmatische korrels, nicotinamide adenine dinucleotidefosfaat (NADPH) oxidase, antimicrobiële enzymen en verschillende organellen die zich verdedigen tegen binnendringende microben; Bovendien zijn ze zeer beweeglijk en zijn ze de eerste cellen die op de ontstekingsplaats worden gerekruteerd, wat betekent dat neutrofielen de eerste verdedigingslinie zijn van het aangeboren immuunsysteem 1,2. Granulocytentransfusietherapie is daarom een veelbelovende klinische behandeling geworden voor neutropenie-gerelateerde infecties om de immuniteit van neutrofielen tijdelijk te verhogen 3,4,5. Recente ontdekkingen hebben duidelijk aangetoond dat neutrofielen ook functioneren als meerzijdige effectoren in veel fysiopathologische scenario's6. De gemiddelde levensduur van een neutrofiel is minder dan 24 uur, en dus zijn fundamenteel onderzoek naar neutrofielen en de toepassing van neutrofielenstudies enorm moeilijk vanwege de beperkingen in verband met stabiele genetische manipulatie en langdurige opslag 7,8,9,10,11 . Er zijn enkele cellijnen die gedeeltelijk enkele neutrofiele functies kunnen vertonen, zoals HL-60, PLB-985, NB4, Kasumi-1 en geïnduceerde pluripotente stamcellen12. Deze cellijnen kunnen effectieve genbewerking en cryopreservatie bereiken; Ze verschillen echter nog steeds enorm van primaire neutrofielen en kunnen dus neutrofiele functies niet getrouw samenvatten13. Het grootste deel van het onderzoek op dit gebied is dus nog steeds afhankelijk van vers geïsoleerde primaire neutrofielen. Het veld vertrouwt nog steeds op het genereren van dure en tijdrovende voorwaardelijke knock-out muizen om specifieke genfuncties in neutrofielen te onderzoeken, maar er bestaan momenteel geen menselijke modellen.
Na onze inspanningen te hebben gedaan om de heterogene processen te onderzoeken die betrokken zijn bij neutrofielendood en de meerdere routes die deze processen reguleren14,15, werd onlangs een nieuwe behandeling genaamd CLON-G (caspases-lysosomale membraanpermeabilisatie-oxidant-necroptose-remming plus granulocytkoloniestimulerende factor) gemeld 16. CLON-G bestaat uit Q-VD-oph (quinolyl-valyl-O-methylaspartyl-[-2,6-difluorfenoxy]-methylketon), Hsp70 (heat shock protein 70), DFO (deferoxamine), NAC (N-acetylcysteïne), Nec-1s (necrostatine-1s) en G-CSF (granulocytkoloniestimulerende factor). Neutrofiele spontane dood wordt gemedieerd door meerdere routes, waaronder apoptose, necroptose en pyroptose. Q-VD-oph remt de apoptose van neutrofielen als pan-caspaseremmer door zich te richten op caspase 1, caspase 3, caspase 8 en caspase 917. Neutrofiele necroptose is afhankelijk van een signaalroute met receptor-interagerend eiwitkinase-1 (RIPK1) en gemengd lineage kinase domein-achtig eiwit (MLKL)18. Als RIPK1-remmer remmen Nec-1's de necroptose van neutrofielen. Hsp70 en DFO kunnen lysosomale membraanpermeabilisatie (LMP) remmen, wat neutrofiele apoptose19 en pyroptose20 kan induceren. Reactieve zuurstofsoorten (ROS) spelen een vitale rol bij neutrofielensterfte door LMP19 en apoptose21 te bemiddelen en door overlevingssignalente remmen 22. Als een antioxidant die ROS-accumulatie kan verminderen, vertraagt NAC de dood van neutrofielen. Als groeifactor activeert G-CSF neutrofiele overlevingssignalen en remt calpain-geïnduceerde apoptose23,24. Door zich tegelijkertijd te richten op meerdere neutrofiele spontane doodsroutes, kan de levensduur van neutrofielen effectief worden verlengd tot meer dan 5 dagen zonder hun functie in gevaar te brengen. CLON-G-behandeling breidt de mogelijkheden van neutrofielenbehoud, transport en genmanipulatie uit, wat het onderzoek in de neutrofielengemeenschap kan versnellen. Ondertussen, op basis van de kennis van neutrofielendood, kunnen de momenteel goedgekeurde protocollen voor celdoodtests onverwachte schade aan neutrofielenveroorzaken 14, dus deze protocollen zijn verfijnd om meer geschikt te zijn voor neutrofiele studies. Dit rapport biedt gedetailleerde protocollen voor neutrofielenkweek met CLON-G en een in vitro celdoodtest van neutrofielen van muizen met behulp van flowcytometrie en fluorescentiebeeldvorming. CLON-G is effectief op zowel muis als menselijke neutrofielen; De muismonsters worden hier echter gedemonstreerd om dit protocol te vereenvoudigen. De concentratie NAC is 1 mM voor neutrofielen bij muizen en 10 μM voor menselijke neutrofielen. Hsp70 is soortspecifiek en moet dus worden gebruikt volgens de bron van de neutrofiel. Voor dit protocol maakt het niet uit of neutrofielen worden geïsoleerd uit perifeer bloed of beenmerg en hoe ze worden geïsoleerd.
Voor de huidige studie werden neutrofielen geïsoleerd uit het beenmerg van de muis om voldoende neutrofielen voor de experimenten te bereiken, aangezien ongeveer 1 x 10 7-1,5 x 107 neutrofielen uit het beenmerg kunnen worden verkregen, terwijl slechts 1 x 10 6 neutrofielen kunnen worden geïsoleerd uit het perifere bloed van een enkele 8-12 weken oude C57BL /6-muis (van beide geslachten). Gradiëntcentrifugatie werd uitgevoerd om mogelijke schade en activering door de mechanische stimulatie van FACS-sortering of MACS-sortering te voorkomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het Boston Children's Hospital en State Key Laboratory of Experimental Hematology (SKLEH) Animal Care and Use Committee keurde en controleerde alle procedures. Figuur 1 toont een stroomschema van neutrofielenkweek met CLON-G en de in vitro doodstest.
1. Verlenging van de levensduur van neutrofielen met CLON-G
OPMERKING: Alle genoemde bewerkingen en materialen moeten steriel zijn. Zorg ervoor dat alle oplossingen goed gemengd en gelijkmatig verdeeld zijn.
- Behoud van de CLON-G componenten
- Los 50 mg Q-VD-oph (zie materiaaltabel) op tot een eindconcentratie van 100 mM door toevoeging van 973,7 μl dimethylsulfoxide (DMSO) en pipetteer de vloeistof totdat het mengsel helder wordt. Aliquot 50 μL per buis, en bewaren bij −20 °C.
LET OP: DMSO is een schadelijke chemische vloeistof. Draag een laboratoriumjas, een bril en een masker om huidcontact, oogcontact en inademing te voorkomen. - Ontdooi Hsp70 (zie materiaaltabel) bij 4 °C en draai de inhoud van de injectieflacon af. Aliquot 1 μL Hsp70 per buis op ijs, en bewaren bij −80 °C.
OPMERKING: Hsp70 is een eiwit; Ultrakoude opslag is nodig om het stabiel te houden. Vermijd de vries-dooicyclus. - Los 1 mg DFO op (zie materiaaltabel) met 7,61 ml RPMI 1640 om een voorraad van 200 μM te verkrijgen. Aliquot 500 μL per buis, en bewaar bij −20 °C.
- Los 0,1 g NAC (zie materiaaltabel) op met 2,5 ml RPMI 1640 in een centrifugebuis van 15 ml en stel de pH in op 7-7,4 met NaOH. Voeg RPMI 1640 toe aan een eindvolume van 3,06 ml om een 200 mM NAC-voorraad te maken. Filter het met een filtereenheid van 0,2 μm. Aliquot 500 μL per buis, en bewaren bij −20 °C.
OPMERKING: Het oplossen van NAC in deze hoge concentratie is niet eenvoudig en vortexing kan helpen het op te lossen. Fenolrood in RPMI 1640 is een perfecte indicatie van de pH; wanneer de NAC net is opgelost, is de kleur geelachtig; Pas het aan totdat het rozeachtig wordt. NAC-voorraadoplossingen zijn tot 1 maand stabiel bij −20 °C. - Los 10 mg Nec-1's (zie materiaaltabel) op tot 20 mM met 1,8 ml DMSO en pipetteer het mengsel totdat het helder wordt. Aliquot 50 μL per buis, en bewaren bij −20 °C. Bescherm tegen licht.
- Los 250 μg G-CSF (zie materiaaltabel) op tot 200 μg/ml met 1,25 ml RPMI 1640. Aliquot 50 μL per buis, en bewaren bij 4 °C.
- Los 50 mg Q-VD-oph (zie materiaaltabel) op tot een eindconcentratie van 100 mM door toevoeging van 973,7 μl dimethylsulfoxide (DMSO) en pipetteer de vloeistof totdat het mengsel helder wordt. Aliquot 50 μL per buis, en bewaren bij −20 °C.
- Bereiding van 2x CLON-G kweekmedium
- Bereid het basismedium voor. Voeg 39,5 ml RPMI 1640, 10 ml foetaal runderserum (FBS) en 0,5 ml pen-strep (antibiotica) toe aan een buis van 50 ml om RPMI 1640 te maken met 20% FBS en 1% PS als basismedium.
OPMERKING: Deze hoge concentratie FBS wordt gebruikt om te zorgen voor de langdurige kweek van neutrofielen, die langer dan 5 dagen kan zijn. Als de kweektijd 1-2 dagen is, is 10% -15% FBS voldoende. - Ontdooi alle voorraadoplossingen van de CLON-G componenten op ijs.
- Verdun 1 μL Hsp70 tot 20 μM door 606 μL van het basismedium toe te voegen. Verdun 1 μL van 200 μg/ml g-csf tot 20 μg/ml door toevoeging van 9 μl van het basismedium.
- Voeg 976 μL basisch medium toe aan een centrifugebuis van 15 ml. Voeg 1 μL Q-VD-oph (100 mM), 10 μL DFO (200 μM), 1 μL Hsp70 (20 μM), 10 μL NAC (200 mM), 1 μL Nec-1s (20 mM) en 1 μL G-CSF (20 μg / ml) toe om 1 ml 2x CLON-G medium te maken.
OPMERKING: Het 2x CLON-G medium moet onmiddellijk na bereiding worden gebruikt. Men kan de 2x CLON-G tijdelijk bewaren bij 4 °C. Restanten van 20 μM Hsp70 moeten worden weggegooid.
- Bereid het basismedium voor. Voeg 39,5 ml RPMI 1640, 10 ml foetaal runderserum (FBS) en 0,5 ml pen-strep (antibiotica) toe aan een buis van 50 ml om RPMI 1640 te maken met 20% FBS en 1% PS als basismedium.
- Neutrofielencultuur
- Isoleer neutrofielen van muizen door gradiëntcentrifugatie volgens een eerder rapport25. Resuspendeer de geïsoleerde neutrofielen van muizen in het basismedium (1 miljoen cellen/100 μL).
OPMERKING: Vermijd het activeren van de neutrofielen door ze voorzichtig te hanteren. Vermijd schuimvorming tijdens het hele proces. - Voeg 500 μL 2x CLON-G medium, 400 μL van het basismedium en 100 μL van de celsuspensie toe aan 24-well non-tissue gekweekte kweekplaten (zie Tabel van Materialen) en pipetteer voorzichtig drie tot vier keer.
OPMERKING: Hoge concentraties van de componenten in het 2x CLON-G medium kunnen de neutrofielen beschadigen; Vermijd ze samen te voegen zonder het basismedium. De niet-weefselgekweekte kweekplaat is noodzakelijk om neutrofiele hechting te voorkomen. - Plaats de kweekplaat soepel in een 37 °C en 5 % CO2 incubator.
OPMERKING: Het is niet nodig om het celmedium binnen 7 dagen te vervangen. De uiteindelijke concentraties van de CLON-G-samenstelling zijn 50 μM Q-VD-Oph, 1 μM DFO, 10 pM Hsp70, 1 mM NAC, 10 μM Nec-1 s en 10 ng/ml G-CSF. - Bevlek de gekweekte neutrofielen met Wright Giemsa-samengestelde kleuring (zie tabel met materialen) en analyseer met een lichtmicroscoop (figuur 2A-D). U kunt ook kleuren met APC-CD11b- en PE-Cy7-Ly6G-antilichamen en analyseren met flowcytometrie (figuur 2E-I) zoals eerder beschreven26.
- Isoleer neutrofielen van muizen door gradiëntcentrifugatie volgens een eerder rapport25. Resuspendeer de geïsoleerde neutrofielen van muizen in het basismedium (1 miljoen cellen/100 μL).
2. In vitro spontane doodstest van neutrofielen
- Flowcytometrie analyse
- Kweek geïsoleerde neutrofielen met een dichtheid van 1 miljoen cellen/ml in het basismedium bij 37 °C en 5% CO2. De 24-well kweekplaat is niet-weefselgekweekt. Voeg 1 ml celmedium per put toe.
- Los 1 g CaCl 2 op met 45 ml zoutoplossing om 200 mM CaCl2 te maken. Filter het met een filtereenheid van 0,2 μm. Bewaren bij 4 °C.
- Bereid de kleuringsmix voor. Voeg 7 μL zoutoplossing per monster toe aan een buis van 1,5 ml en voeg 0,4 mg/ml FITC-Annexin-V, 0,5 mg/ml propidiumjodide (PI) en 200 ml CaCl2-oplossing toe met elk 1 μl per monster. Meng goed. Gebruik de oplossing onmiddellijk na bereiding.
- Pipetteer het celmedium vijf tot zeven keer voorzichtig om goed te mengen, gevolgd door het overbrengen van 100 μL naar een flowcytometriebuis op de gewenste tijdstippen.
OPMERKING: Vermijd schuimvorming tijdens het hele proces. - Vortex tellende kralen (zie Tabel van Materialen) om ze goed te mengen. Pipetteer 10 μL van de goed gemengde telparels aan dezelfde flowcytometriebuis als in stap 2.1.4.
- Voeg 10 μL het bereide kleuringsmengsel (stap 2.1.3) toe aan de flowcytometriebuis. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten uit de buurt van het licht.
- Voeg 100 μL zoutoplossing toe aan de buis en meng goed om de gelijkmatige verdeling van de telparels en cellen te garanderen.
- Voer flowcytometrie-analyse van het celmedium uit. Verzamel de cellen met een lage snelheid met ~400 gebeurtenissen/s. Gate de APC-PE-Cy7-cellen naar FSC-A en SSC-A, en gate de intacte cellen met medium FSC-A- en SSC-A-posities naar de FITC-Annexin-V en PE-PI; de Annexin-V−PI− populatie is geclassificeerd als gezonde cellen.
OPMERKING: De volgende vergelijkingen bepalen het totale aantal gezonde cellen per monster en de levensvatbaarheid van de neutrofielen:
Totaal aantal gezonde cellen per monster27 = (1.000/aantal telparels) × aantal Annexin-V−PI− populatie × 10
Levensvatbaarheid van neutrofielen = totaal aantal gezonde cellen op het aangegeven tijdstip/totaal aantal gezonde cellen op tijdstip nul
- Fluorescerende beeldtest
- Kweek geïsoleerde neutrofielen met een dichtheid van 1 miljoen cellen/ml in het basismedium bij 37 °C en 5% CO 2 in een confocale plaat met2 ml celmedium per plaat.
OPMERKING: Een confocale fluorescentiemicroscoop heeft de beste beeldkwaliteit, maar elke fluorescentiemicroscoop met 488/561/DIC-kanalen is voldoende om dit experiment te ondersteunen. - Haal de plaat er voorzichtig uit op het aangegeven tijdstip. Voeg 10 μL elk van 0,4 mg/ml FITC-Annexin-V, 0,5 mg/ml PI en 200 mM CaCl2 gelijkmatig toe aan de plaat. Bevlek bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
OPMERKING: Vermijd schudden tijdens het hele proces. Voeg de kleuringsmiddelen gelijkmatig en voorzichtig toe. - Leg fluorescentiebeelden vast op 488 (annexine-V)/561 (PI)/DIC-kanalen met behulp van een confocale fluorescentiemicroscoop met een 20x objectieflens (zie materiaaltabel). Stel de belichtingstijd van het 488-kanaal in op 500 ms, het 561-kanaal op 200 ms en het DIC-kanaal op 100 ms. Selecteer 5-10 willekeurige gebieden voor elke plaat. De celtypen zijn gedefinieerd in ons eerder gepubliceerde rapport14.
- Kweek geïsoleerde neutrofielen met een dichtheid van 1 miljoen cellen/ml in het basismedium bij 37 °C en 5% CO 2 in een confocale plaat met2 ml celmedium per plaat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De Wright-Giemsa-gekleurde morfologie (figuur 2A-D) en FACS-fenotypen (figuur 2E-J) van de met CLON-G behandelde neutrofielen werden niet beïnvloed. De levensvatbaarheid van de met CLON-G behandelde neutrofielen na 24 uur was ongeveer 90%+ op basis van flowcytometrie-analyse (figuur 3) en de fluorescerende beeldtests (figuur 4). Een lagere levensvatbaarheid kan het gevolg zijn van onjuiste opslag, onjuiste concentraties van de CLON-G-componenten of een slechte kwaliteit van de startende geïsoleerde neutrofielen. De flowcytometrie-analyse van de onbehandelde neutrofielen die gedurende 24 uur met het basismedium werden gekweekt, toonde aan dat deze neutrofielen een Annexine-V-positieve populatie hadden (figuur 3B). Het verlies van deze populatie kan te wijten zijn aan ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) in het celmedium. De fluorescentiebeelden van de neutrofielen die gedurende 24 uur met het basismedium zijn gekweekt, moeten gezwollen cellen bevatten (witte pijl in figuur 4A). Het verlies van gepofte cellen kan het gevolg zijn van het schudden of pipetteren van de confocale plaat.
Figuur 1: Stroomschema van neutrofielenkweek met CLON-G en de in vitro doodstest. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Morfologie en celoppervlakmarkerfenotypen van de met CLON-G behandelde muisneutrofielen. De cellen werden (A-D) gekleurd met Wright-Giemsa samengestelde kleuring na kweken en beoordeeld door microscopie met behulp van een 40x objectieve lens of (E-I) gekleurd met APC-CD11b en PE-Cy7-Ly6G antilichamen en geanalyseerd met flowcytometrie. (J) De verhoudingen van de CD11b+ en Ly6G+ cellen op de aangegeven tijdstippen werden statistisch geanalyseerd. De schaalbalk is 10 μm. Gegevens worden gepresenteerd als middelen ± SD van drie experimenten. ns = geen statistisch significant verschil ten opzichte van de overeenkomstige groep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Flowcytometrie-analyse van met CLON-G behandelde beenmergneutrofielen van muizen . (A) Gating strategie, (B) representatieve resultaten, en (C) de levensvatbaarheid van de neutrofielen na kweken gedurende 24 uur. Gegevens worden gepresenteerd als middelen ± SD van drie experimenten. **P < 0,001 ten opzichte van de overeenkomstige groep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatieve resultaten voor neutrofielensterfte op basis van de fluorescentiebeeldtest. Neutrofielendood na kweken met (A) basisch medium gedurende 24 uur of CLON-G gedurende (B) 24 uur, (C) 3 dagen of (D) 5 dagen. Na het kweken werden de cellen gekleurd met FITC-Annexin-V (Groen) en PI (Rood) en beoordeeld met confocale fluorescentiemicroscopie. De schaalbalk is 40 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Neutrofielen spelen een vitale rol in aangeboren en adaptieve immuniteit en hun homeostase is strak gereguleerd. Neutrofielen zijn de meest voorkomende leukocyten in menselijk perifeer bloed en ze hebben een robuuste en snelle omzet. Een gezonde volwassene kan dagelijks 1 x 109 neutrofielen/kg uit het beenmergafgeven 28. De dood van neutrofielen is daarom een van de raadselachtige raadsels van dit veld geworden en er is veel moeite gedaan om ze beter te begrijpen. Caspase 29,30,31,32, LMP 33, ROS21,22,33, necrose 34,35,36,37 en necropotose 18,38 zijn bewezen betrokken te zijn bij deze heterogene processen. GM-CSF 24 en G-CSF23 kunnen de levensduur van neutrofielen verlengen tot ongeveer24uur met onderdrukte functies. CLON-G richt zich op alle bekende neutrofiele spontane doodsmechanismen. Voor zover bekend biedt CLON-G momenteel de langste verlenging van de levensduur van neutrofielen in vitro zonder afbreuk te doen aan de functie.
Verschillende kanttekeningen moeten worden overwogen om de beste resultaten te verkrijgen van neutrofielenkweek met CLON-G. Door onze vorige farmacologische screening16 werd benadrukt dat nauwkeurige concentraties van de CLON-G-componenten de sleutel tot succes zijn en dat men dus moet proberen fouten tijdens de bereiding te vermijden en ze goed te bewaren. Met betrekking tot de manipulatie en zuivering van neutrofielen is het gemakkelijk om de neutrofielen te activeren en te doden; Daarom moeten ze tijdens het hele proces voorzichtig worden behandeld en worden gekweekt zodra ze zijn geïsoleerd. Ze zijn gevoelig voor de celconcentratie, de conditie van de kweekplaat, temperatuur en pH; Men moet voorzichtig zijn bij het wijzigen van dit protocol. Met betrekking tot de in vitro doodstest hebben eerdere resultaten aangetoond dat spontaan dode neutrofielen opzwellen tot gezwollen cellen die ondraaglijk zijn voor mechanische kracht; spinnen, pipetteren en wassen zou het aantal neutrofielen verminderen, en het vervangen van de standaard bindingsbuffer door een CaCl2-oplossing kan dit proces vereenvoudigen en de nauwkeurige weergave van de neutrofielen14 garanderen. Verschillen tussen de technische duplicaten in hetzelfde experiment kunnen het gevolg zijn van schuimvorming tijdens de operatie. Verschillen tussen onafhankelijke experimenten kunnen te wijten zijn aan variaties in de zuiverheid en versheid van de neutrofielen39.
CLON-G combineert bekende routes en bijbehorende remmende chemicaliën om spontane neutrofielendood te voorkomen. De kernvraag van dit veld blijft echter met betrekking tot de gecompliceerde paden die neutrofielendood bemiddelen, omdat deze nog steeds niet volledig worden begrepen. De dood van met CLON-G behandelde neutrofielen is onvermijdelijk. CLON-G heeft dus nog ruimte voor verbetering. Wat de componenten van CLON-G betreft, zijn de beste keuzes klinisch toegepaste geneesmiddelen om de mogelijkheid van de klinische toepassing van met CLON-G behandelde neutrofielen uit te breiden; Q-VD-oph en Rec-1's zijn echter alleen voor onderzoek en klinische onderzoeken die zich op hen richten, zijn momenteel niet beschikbaar. Alternatieve verbindingen zijn dus noodzakelijk voor klinische toepassing.
Door de levensduur van neutrofielen te verlengen tot meer dan 5 dagen met hun functies intact, kan CLON-G eindeloze mogelijkheden voor neutrofielenonderzoek ontsluiten. Met dit uitgebreide venster kunnen observatie, genmanipulatie, langdurige opslag, transport en cryopreservatie worden ontwikkeld op basis van CLON-G. De arbeids-, tijd- en geldkosten zouden aanzienlijk worden verlaagd, wat de toetredingsdrempels voor nieuwe onderzoekers zou verlagen. CLON-G kan ook klinische toepassingen van neutrofielen bevorderen, zoals granulocytentransfusietherapie. Neutropene infectie na chemotherapie is een belangrijke doodsoorzaak voor patiënten die lijden aan kanker en hematopoëtische maligniteiten 40,41,42,43,44. Granulocytentransfusietherapie, die een groot potentieel heeft als alternatieve therapie om deze patiënten te helpen, wordt ernstig beperkt door de korte levensduur van neutrofielen45. De huidige processtroom voor granulocytentransfusie duurt langer dan de levensduur van een neutrofiel, wat ertoe leidt dat getransfuseerde neutrofielen hun effectiviteit als eerstelijns immuuncel verliezen. CLON-G-behandeling biedt voldoende tijd voor de voorbereiding van granulocyttransfusies, die het potentieel hebben om talloze levens van neutropenisch geïnfecteerde patiënten te redden en het overmatig gebruik van antibiotica te helpen verminderen. Tegelijkertijd kan het huidige protocol voor de neutrofielensterftetest de status van neutrofielen nauwkeurig aantonen en de reproduceerbaarheid van experimentele resultaten verbeteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat het onderzoek is uitgevoerd zonder belangenverstrengeling.
Acknowledgments
Dit project werd ondersteund door het Haihe Laboratory of Cell Ecosystem Innovation Fund (22HHXBSS00036, 22HHXBSS00019), het Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) Innovation Fund for Medical Sciences (2021-I2M-1-040,2022-I2M-JB-015), het Special Research Fund for Central Universities, Peking Union Medical College (3332022062) en het Science and Technology Support Program van de provincie Sichuan (NR. 2021YJ0480).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm syringe filter | Pall Corporation | 4612 | Filtrate prepared CLON-G components. |
| 1.5 mL micro centrifuge tube | LABSELECT | MCT-001-150 | Lab consumable. |
| 15 mL Centrifuge Tubes | LABSELECT | CT-002-15 | Lab consumable. |
| 24 well cell culture plate | Falcon | 351147 | Neutrophil culture plate. |
| 50 mL Centrifuge Tubes | LABSELECT | CT-002-50 | Lab consumable. |
| BD LSRII | BD | Instrument for flow cytometry analysis of neutrophil death. | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich | C4901 | Assitant of Annexin-V binding to phosphatidylserine. |
| Confocal microscope | Perkinelmer | UltraVIEW VOX | Instrument for fluorescent analysis of neutrophil death. |
| Confocal plate | NEST | 801001-20mm | Lab consumable for fluorescent image assay. |
| Counting beads | Thermo Fisher | C36950 | Quantification in flow cytometry analysis of neutrophil death. |
| DFO | Sigma Aldrich | D9533 | Component of CLON-G. LMP inhibitor. |
| Dimethyl sulfoxide ( DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | Solvent for Q-VD-oph and Nec-1s. |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10099141C | Component of neutrophil culture basic medium. Nutrition supply. |
| FITC-Annexin-V | BD | 51-65874X | Annexin-V can bind to phosphatidylserine of aged cells.This is at FITC channel. |
| Hsp70 | Abcam | ab113187 | Component of CLON-G. LMP inhibitor. |
| NAC | Sigma Aldrich | A9165 | Component of CLON-G. Antioxidant. |
| Nec-1s | EMD Millipore | 852391-15-2 | Component of CLON-G. Necroptosis inhibitor. |
| Penicillin-Streptomycin Solution (PS) | Gibco | 15070063 | Component of neutrophil culture basic medium. Antibiotics to protect cells from bacteria comtamination. |
| Propidium Iodide (PI) | BioLegend | 421301 | For neutrophil death assay. A small fluorescent molecule that binds to DNA but cannot passively traverse into cells that possess an intact plasma membrane. |
| Q-VD-oph | Selleck chem | S7311 | Component of CLON-G. Pan-caspase inhibitor. |
| Recombinant Human Granulocyte Colony-stimulating Factor for Injection (CHO cell)(G-CSF) | Chugai Pharma China | GRANOCYTE | Component of CLON-G. Promote neutrophil survival through Akt pathway. |
| Round-Bottom Polystyrene Tubes | Falcon | 100-0102 | Lab consumable for flow cytometry analysis. |
| RPMI1640 | Gibco | C11875500BT | Component of neutrophil culture basic medium. |
| Saline | LEAGENE | R00641 | Solution for flow cytometry analysis of neutrophil death. |
| Sodium hydroxide (NaOH) | FENG CHUAN | 13-011-00029 | pH adjustion for NAC. |
| Wright-Giemsa Stain Solution | Solarbio | G1020 | Neutrophil cytospin staining. |
References
- Segal, A. W.
- Rosales, C. Neutrophil: A cell with many roles in inflammation or several cell types. Frontiers in Physiology. 9, 113 (2018).
- Chung, S., Armstrong-Scott, O., Charlewood, R. Therapeutic granulocyte infusion for patients with severe neutropaenia and neutrophilic dysfunction: New Zealand experience. Vox Sanguinis. 117 (2), 220-226 (2021).
- Zhou, B., et al. Clinical outcome of granulocyte transfusion therapy for the treatment of refractory infection in neutropenic patients with hematological diseases. Annals of Hematology. 97 (11), 2061-2070 (2018).
- Covas, D. T., et al. Granulocyte transfusion combined with granulocyte colony stimulating factor in severe infection patients with severe aplastic anemia: A single center experience from China. PLoS One. 9 (2), e88148 (2014).
- Tecchio, C., Cassatella, M. A. Uncovering the multifaceted roles played by neutrophils in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Cellular & Molecular Immunology. 18 (4), 905-918 (2021).
- Lahoz-Beneytez, J., et al. Human neutrophil kinetics: Modeling of stable isotope labeling data supports short blood neutrophil half-lives. Blood. 127 (26), 3431-3438 (2016).
- Pillay, J., et al. In vivo labeling with 2H2O reveals a human neutrophil lifespan of 5.4 days. Blood. 116 (4), 625-627 (2010).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Tofts, P. S., Chevassut, T., Cutajar, M., Dowell, N. G., Peters, A. M. Doubts concerning the recently reported human neutrophil lifespan of 5.4 days. Blood. 117 (22), 6050-6052 (2011).
- McDonald, J. U., et al. In vivo functional analysis and genetic modification of in vitro-derived mouse neutrophils. FASEB Journal. 25 (6), 1972-1982 (2011).
- Pedruzzi, E., Fay, M., Elbim, C., Gaudry, M., Gougerot-Pocidalo, M. -A. Differentiation of PLB-985 myeloid cells into mature neutrophils, shown by degranulation of terminally differentiated compartments in response to N-formyl peptide and priming of superoxide anion production by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. British Journal of Haematology. 117 (3), 719-726 (2002).
- Blanter, M., Gouwy, M., Struyf, S. Studying neutrophil function in vitro: Cell models and environmental factors. Journal of Inflammation Research. 14, 141-162 (2021).
- Teng, Y., Luo, H. R., Kambara, H.
- Luo, H. R., Loison, F. Constitutive neutrophil apoptosis: Mechanisms and regulation. American Journal of Hematology. 83 (4), 288-295 (2008).
- Fan, Y., et al. Targeting multiple cell death pathways extends the shelf life and preserves the function of human and mouse neutrophils for transfusion. Science Translational Medicine. 13 (604), (2021).
- Caserta, T. M. Q-VD-OPh, a broad spectrum caspase inhibitor with potent antiapoptotic properties. Apoptosis. 8, 345-352 (2003).
- Wang, X., Yousefi, S., Simon, H. U.
- Loison, F., et al. Proteinase 3-dependent caspase-3 cleavage modulates neutrophil death and inflammation. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4445-4458 (2014).
- Kambara, H., et al. Gasdermin D exerts anti-inflammatory effects by promoting neutrophil death. Cell Reports. 22 (11), 2924-2936 (2018).
- Zhu, D., et al. Deactivation of phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate/Akt signaling mediates neutrophil spontaneous death. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (40), 14836-14841 (2006).
- Xu, Y., Loison, F., Luo, H. R. Neutrophil spontaneous death is mediated by down-regulation of autocrine signaling through GPCR, PI3Kgamma, ROS, and actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 2950-2955 (2010).
- van Raam, B. J., Drewniak, A., Groenewold, V., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Granulocyte colony-stimulating factor delays neutrophil apoptosis by inhibition of calpains upstream of caspase-3. Blood. 112 (5), 2046-2054 (2008).
- Klein, J. B., et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor delays neutrophil constitutive apoptosis through phosphoinositide 3-kinase and extracellular signal-regulated kinase pathways. Journal of Immunology. 164 (8), 4286-4291 (2000).
- Fan, Y., et al. Targeting multiple cell death pathways extends the shelf life and preserves the function of human and mouse neutrophils for transfusion. Science Translational Medicine. 13 (604), (2021).
- Xie, X., et al. Single-cell transcriptome profiling reveals neutrophil heterogeneity in homeostasis and infection. Nature Immunology. 21 (9), 1119-1133 (2020).
- Cosimo, E., et al. Inhibition of NF-kappaB-mediated signaling by the cyclin-dependent kinase inhibitor CR8 overcomes prosurvival stimuli to induce apoptosis in chronic lymphocytic leukemia cells. Clinical Cancer Research. 19 (9), 2393-2405 (2013).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Porter, A. G., Jänicke, R. U.
- Scheel-Toellner, D., et al. Clustering of death receptors in lipid rafts initiates neutrophil spontaneous apoptosis. Biochemical Society Transactions. 32, 679-681 (2004).
- Geering, B., Simon, H. U. Peculiarities of cell death mechanisms in neutrophils. Cell Death and Differentiation. 18 (9), 1457-1469 (2011).
- Gabelloni, M. L., Trevani, A. S., Sabatté, J., Geffner, J. Mechanisms regulating neutrophil survival and cell death. Seminars in Immunopathology. 35 (4), 423-437 (2013).
- Loison, F., et al. Proteinase 3-dependent caspase-3 cleavage modulates neutrophil death and inflammation. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4445-4458 (2014).
- Cho, Y. S., et al. Phosphorylation-driven assembly of the RIP1-RIP3 complex regulates programmed necrosis and virus-induced inflammation. Cell. 137 (6), 1112-1123 (2009).
- He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).
- Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148 (1-2), 213-227 (2012).
- Zhang, D. -W., et al. RIP3, an energy metabolism regulator that switches TNF-induced cell death from apoptosis to necrosis. Science. 325 (5938), 332-336 (2009).
- Wang, X., He, Z., Liu, H., Yousefi, S., Simon, H. -U. Neutrophil necroptosis is triggered by ligation of adhesion molecules following GM-CSF priming. Journal of Immunology. 197 (10), 4090-4100 (2016).
- Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. Journal of Visualized Experiments. (175), e62837 (2021).
- George, B., Bhattacharya, S. Infections in hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) patients. Contemporary Bone Marrow Transplantation. Chandy, M., Radhakrishnan, V. S., Sukumaran, R. , Springer. Cham, Switzerland. (2020).
- Lucena, C. M., et al. Pulmonary complications in hematopoietic SCT: A prospective study. Bone Marrow Transplant. 49 (10), 1293-1299 (2014).
- Tomblyn, M., et al. Guidelines for preventing infectious complications among hematopoietic cell transplantation recipients: A global perspective. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15 (10), 1143-1238 (2009).
- Wingard, J. R., Hiemenz, J. W., Jantz, M. A. How I manage pulmonary nodular lesions and nodular infiltrates in patients with hematologic malignancies or undergoing hematopoietic cell transplantation. Blood. 120 (9), 1791-1800 (2012).
- Wingard, J. R., Hsu, J., Hiemenz, J. W. Hematopoietic stem cell transplantation: An overview of infection risks and epidemiology. Infectious Disease Clinics of North America. 24 (2), 257-272 (2010).
- Netelenbos, T., et al. The burden of invasive infections in neutropenic patients: incidence, outcomes, and use of granulocyte transfusions. Transfusion. 59 (1), 160-168 (2019).
