Name: Aislamiento y trasplante de células madre hematopoyéticas (HSC) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-02-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 38 s
Description: Aprende a purificar células madre hematopoyéticas de larga duración y trasplantarlas en ratones. Este método demuestra técnicas efectivas de esterilización, disección y aislamiento óseo para avanzar en terapias con células madre.

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Ósea total de preparación de la médula <ol><li> Cuatro ratones B6 son sacrificados y disecados para obtener tibias, fémures, la cadera y la columna vertebral. </li><li> Durante las disecciones, las extremidades y los huesos se mantienen en PBS el 2% de FCS inactivado por calor (opcional EDA 2 mm - medio disección). </li><li> Los huesos limpios se trituran con mortero en medio de la disección. Una manera eficiente de hacerlo es aplastar a la tibia, el fémur y cadera de cada ratón, y luego dos espinas a la vez. </li><li> La mezcla de células obtenidas de cada ratón se mantiene separada y se filtra a través de un filtro de 40μm en un tubo de 50 ml de halcón. De esta manera, cada tubo contiene la mezcla de células obtenidas de todos los huesos de las patas de un ratón, y la mitad de la mezcla obtenida a partir de 2 espinas. En esta etapa, el filtro se utiliza para separar fragmentos de hueso. </li><li> Por lo general se recomienda para aplastar a los huesos de las piernas dos veces para obtener blanco (sin médula ósea) fragmentos de hueso y los fragmentos de la columna 2 o 3 veces. </li><li> Llenar los tubos para que ellos equilibrada, y el giro 1200rpm 5 min. </li><li> Aspirar el sobrenadante y aflojar el sedimento arrastrando los tubos en el soporte de tubos (este paso es importante después de cada centrifugación para minimizar la formación de grupo y la pérdida de células). Resuspender cada tubo en 1 ml de PBS 2% de FCS (NO EDTA a partir de ahora) si usted está haciendo el agotamiento de linaje, o en el volumen que es de otra manera conveniente para usted. </li></ol> Lineage agotamiento <ol><li> Este procedimiento le permite eliminar las células altamente diferenciadas y obtener una población muy heterogénea de células, enriquecida de las células madre y progenitoras. Si usted está ordenando HSC, este paso reduce drásticamente el número de células que tienen que pasar por la clasificación de células, por lo tanto, reduciendo el tiempo de clasificación y lo que le permite ordenar HSC de un mayor número de ratones, para que pueda obtener un mayor número de HSC en una clasificación única. </li><li> Si usted va a ordenar más tarde, saque 50μl de la mezcla de células (por lo general toman un poco de cada tubo) para la clasificación de los controles (sin manchas y Sca1, c-Kit, CD48, Flk2 controles de un solo color). </li><li> Añadir 30ml/tube Lin cóctel. Cóctel linaje contiene una variedad de anticuerpos, que por desgracia cambia un poco de un laboratorio a otro. En el laboratorio Scadden, que utilizan anticuerpos contra biotinilado Gr1, Ter119, CD4, CD8, CD3, B220. Su dilución final en la tinción es 1:700. </li><li> Vortex rápidamente a la mezcla y se incuba durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Durante la incubación, preparar las columnas de los imanes y los tubos de 15 ml de elución en las columnas. Degas algunos PBS utilizando un filtro steriflip (debería ver pequeñas burbujas de aire en movimiento hacia la superficie de la aspiración al vacío debido a la PBS), y equilibrar las columnas mediante la aplicación de 3 ml desgasificado PBS a cada columna. </li><li> El flujo de la columna es de unos 1ml/5min, por lo que tarda unos 15 minutos para que las columnas listas para usar. </li><li> Al final de la incubación, añadir PBS 2% de FCS para llenar los tubos y centrifugar durante 5 minutos a 1200rpm. </li><li> Aspirar el sobrenadante, afloje los pellets y resuspender en 1 ml / tubo de desgasificado PBS. </li><li> Si usted está ordenando posteriormente, sacar la médula ósea del linaje de un solo color tinción ctrl (15 ml, un poco de cada tubo). </li><li> Añadir 30ml/tube cuentas estreptavidina vórtice, de forma rápida para mezclar e incubar durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Al final de la incubación, añadir 2 ml / tubo de desgasificado PBS. Poner nuevos tubos de recogida en las columnas, y se aplican cada suspensión a una columna, filtrado a través de un filtro de 40μm. </li><li> Añadir otro 3 ml de desgasificado PBS a cada tubo para lavarlo. Una vez que las columnas están vacías, se aplican de nuevo utilizando el filtro de 40μm mismo. </li><li> El eluido contiene el linaje agotado mezcla de células, una población heterogénea enriquecido para células madre y progenitores. La piscina del contenido de los 4 tubos en 2 tubos. Girar durante 5 min a 1500 rpm. </li><li> Aspirar el sobrenadante. La pastilla debe ser blanco o negro, principalmente. Afloje los pellets y resuspender juntos en 1 ml de PBS FCS total de 2% si está ordenando más tarde, de lo contrario volver a suspender en el volumen que sea conveniente para usted. </li></ol> LKS o la clasificación de largo plazo, HSC <ol><li> Saque el linaje de un solo color agotado tinción ctrl (15 ml). Esto le permitirá evaluar la eficacia de su agotamiento linaje. </li><li> La mezcla de células de tipo se tiñe en el tubo de 15 ml. </li></ol> Añadir los anticuerpos: <table border="0"><tbody><tr><td> Sca-PE Cy5.5 </td><td> 1: 100 </td><td> 10ml </td></tr><tr><td> Kit de APC </td><td> 1:100 </td><td> 10ml </td></tr><tr><td> SA PE-Cy7 </td><td> 1:500 </td><td> 2 ml </td></tr></tbody></table> Para ordenar HSC a largo plazo, también se suman: <table border="0"><tbody><tr><td class="jove_content"> CD48 FITC </td><td class="jove_content"> 1:1000 </td><td class="jove_content"> 1 ml </td></tr><tr><td class="jove_content"> Flk2 PE </td><td class="jove_content"> 1:200 </td><td class="jove_content"> 5 ml </td></tr&gt; </tbody></table> También, preparar tinción solo los controles mediante la médula ósea total de mantenerse a un lado después de la disección y el teñido de la médula ósea total de linaje. Estas coloraciones se puede hacer directamente en los tubos de FACS. Asegúrese de estar en la oscuridad! <ol><li> Vortex rápidamente para mezclar e incubar a 4 ° C durante 20 a 30 minutos, volver a mezclar a mitad de camino. </li><li> Para quitar el exceso de anticuerpos, se llenan los tubos con PBS 2% de FCS y girar durante 5 min a 1500 rpm. </li><li> Extraer el sobrenadante, resuspender todas pellets y pasar a nuevos tubos con tapas de filtro de FACS. Puede ser que tome un tiempo para obtener las células que pasar por estos filtros, y es importante aplicar un poco más de PBS después de lavar el filtro y minimizar la pérdida de células. Este paso es necesario para evitar la obstrucción de la clasificadora, que es la peor pesadilla de todos los usuarios de clasificador de células. </li><li> Cuando la entrega de sus células de la planta de clasificación de células, asegúrese de preparar también un tubo con PBS 10% de FCS HI donde las células se recogieron. </li><li> Si usted está ordenando las células LKS, obtendrá una población heterogénea que contiene a largo plazo y corto repoblar progenitores HSC y multipotentes. Un rendimiento promedio es de 300.000 LKS de 4 ratones. </li><li> Si usted también ha usado CD48 y Flk2 anticuerpos, puede separar cada población de células madre hematopoyéticas a largo plazo, HSC a corto plazo y MPP. LT-HSC son la población más raros. Un rendimiento promedio es de unos 50.000 a 60.000 células de 4 ratones. </li></ol>

aislamiento y trasplante de células madre hematopoyéticas (hsc)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Aislamiento y trasplante de células madre hematopoyéticas (HSC)

Soy Christina Ceso. Soy investigadora posdoctoral en el laboratorio de David Den y trabajo con células madre hematopoyéticas. Hoy vamos a purificar células madre hematopoyéticas de recuperación a largo plazo y las trasplantaremos en un ratón.Comenzamos rociando a los ratones con alcohol para que, en primer lugar, la mente comience esterilizada y además el pelo no interfiera con la disección. Utilizamos PBS con suero al 2 % para la disección. Corto la piel de la espalda y tiro de la piel hacia los lados para exponer el tejido.Para aislar la tibia, sostengo la tibia con pinzas. Corto el tendón en la parte superior de la rodilla y corto los músculos por debajo de la rodilla, y después corto a través de la rodilla para que la tibia no esté conectada al resto del miembro, y tiro para aislarla. Luego sostengo la tibia boca abajo y con las tijeras separo el pie de la tibia para obtener el fémur.Corto los músculos alrededor del fémur y luego desarticulo el fémur de la cadera. Para aislar la cadera, corto el músculo alrededor del hueso de la cadera del lado de la cola del ratón y luego separo la cadera del cuerpo. Para aislar la columna vertebral, corto por la cola lo más cerca posible del comienzo de la espalda, y luego realizo cortes a ambos lados de la columna y por debajo de ella, tratando de mantenerme lo más cerca posible de la columna para no cortar el peritoneo y dejar intacto el intestino.Una primera ronda de limpieza de los huesos se realiza con un escalpelo, que se utiliza para raspar el hueso y los músculos adheridos al hueso. El escalpelo es adecuado para limpiar los fémures, la cadera y la columna vertebral. Para limpiar la tibia, la sostengo con pinzas y utilizo las pinzas para eliminar la mayor cantidad posible de tejido.Se realiza una segunda ronda de limpieza utilizando una toallita limpia para eliminar completamente los huesos del músculo, y utilizo la toallita F para limpiar la tibia, el fémur y las caderas. Así es como se ven los huesos. Después de la limpieza, prefiero tubos de 50 volúmenes con filtros en la parte superior y transfiero los huesos al mortero.Agrego el medio de la sección y trituro los huesos restantes de la primera ronda de trituración de los huesos. Pipeteo la mezcla para liberar la mayor cantidad posible de células en la solución y reducir los grumos. Transfiero la mezcla a los tubos a través de los filtros y así es como se ven los fragmentos óseos después de la primera ronda de trituración.Así que añado más medio de disección a los fragmentos de hueso y los agito nuevamente. Transfiero la mezcla de seline a los tubos a través de los filtros y, en este punto, los fragmentos de hueso restantes están blancos y no queda médula ósea. Los tubos se llenan con PBS al 2 % de suero y, con el fin de que todos tengan el mismo peso para que estén equilibrados en la centrífuga, pero también para lavar los filtros y obtener el mayor número posible de células, luego centrifugo la mezcla celular y, tras la centrifugación, el precipitado incluye las células de la médula ósea.Aspiro el medio y muevo el tubo hacia adelante y hacia atrás en la rejilla para que el sedimento se suelte y se formen menos grumos. Cuando añado el medio, en este momento agrego un ml de medio por tubo, ya que estoy separando células madre hematopoyéticas. Más adelante, voy a almacenar una salida ALI de tamaños totales de médula ósea en este punto, que utilizaré posteriormente para el control de un solo color.Añado el cóctel de anticuerpos de linaje. Ordeno las muestras para mezclarlas bien y las incubo a cuatro grados durante 15 minutos. Mientras tanto, comienzo a preparar las columnas para la separación de linajes.Coloqué las columnas sobre el imán y preparé tubos de Ian debajo de las columnas. También preparé el PBS gaseificado utilizando un filtro de inversión aster y lo conecté al vacío para que todas las burbujas de aire se desplazaran a la parte superior del filtro. Luego, agregué tres ml del PBS gaseificado a cada columna para que la columna se humedezca.Después de la incubación con los anticuerpos, añado medio a las muestras celulares y las centrifugo para eliminar el exceso de anticuerpos. Tras la centrifugación, las células teñidas se encuentran en el botón. Aspiro el medio y resuspendo el botón en un mililitro de PBSI. Añado las perlas de tira, mezclo las células e incubo durante 15 minutos a cuatro grados.Después de la incubación, coloqué nuevos tubos de elución bajo las columnas. Añadí dos ml de PBS a cada tubo con las células y transferí la mezcla celular a la columna a través de un filtro de 40 micrones. Lavé los tubos con más medio para recoger todas las células restantes y apliqué el medio restante a través de los filtros hacia las columnas.Las células progenitoras de linaje bajo se aluden a las vistas de recolección. Extraje las muestras lutadas y les envié tofu. Entonces, tras la centrifugación, las células agotadas se encuentran en una pasta blanca.Aspiro el medio y resuspendo las células. Almaceno una cantidad adecuada de las células agotadas y añado los anticuerpos a la mezcla celular para la clasificación, así como a todos los controles de un solo color. Los anticuerpos se incuban con la muestra durante 15 minutos en el refrigerador.Después de la incubación, añado medio a las células y las centrifugo para eliminar el exceso de anticuerpos. Tras la centrifugación, las células están en el precipitado; aspiro el medio, resuspendo las células y transfiero las células a tubos fox con filtro azul. En este punto, las células están listas para ser clasificadas.Coloco al ratón bajo una lámpara de calor durante unos minutos para que las venas se dilaten y sean más visibles. Al preparar la jeringa, hay que tener cuidado de eliminar todas las burbujas de la mezcla que se encuentra en la jeringa, y luego doblo la aguja en un ángulo de 90 grados. Coloco al ratón bajo un vaso de vidrio con un peso encima para que no pueda escapar.Esterilizo la cola con la gasa impregnada de alcohol para que el sitio de inyección esté estéril, pero también porque es más fácil identificar la vena. Si observa la cola del ratón desde arriba, en la parte media y superior de la cola hay una arteria, mientras que en los dos lados se encuentran las dos venas, y nosotros inyectamos las células en una de las dos venas. Introduzco la aguja en la vena y realizo la inyección siguiendo el procedimiento de inyección.Es necesario esperar unos segundos antes de retirar la aguja y, posteriormente, limpiar el sitio de inyección. Esta es una representación de la jeringa con la aguja doblada a 90 grados respecto a la rodilla, y así en el tobillo comparado con la cola, lo que facilita al máximo la inyección. Cuando se inyecta en la cola del ratón, debe tenerse en cuenta que la vena de la cola es extremadamente superficial, por lo que esta es exactamente la orientación que debe tener la aguja con respecto a la cola.Y parece que seguirás deslizándote por encima de la cola, pero en realidad entrarás dentro de ella. Soy Christina Ceso. Soy becaria en el laboratorio de David Kaden, y trabajo con células madre hematopoyéticas.Suelo utilizar para los animales al principio, y al comienzo tuve más variabilidad, pero una vez que se logra consistencia en los métodos, obtengo de forma constante entre 50.000 y 60.000 células madre de ratones. Realicé mi doctorado en Londres con la Dra. Fiona Wat, trabajando en células madre dérmicas. Después de eso, simplemente quería tener un conocimiento más amplio sobre las células madre adultas en diversos tejidos, por lo que decidí trasladarme al laboratorio de David Kaden para trabajar en células madre hematopoyéticas, principalmente porque los aspectos conocidos sobre las células madre hematopoyéticas son precisamente los que desconocemos en las células madre epidérmicas, así como una serie de ensayos que pueden realizarse con epi.Las células madre epidérmicas aún no han terminado realmente con las células madre hematopoyéticas, y por eso en este momento intento reunir los conocimientos de estos dos campos diferentes. En última instancia, me interesa estudiar el mecanismo que regula los sensores de tejidos adultos en general, no solo el epitelio o las células madre, sino también diferentes tejidos, porque existen mecanismos similares; siempre son los mismos genes los que participan en la regulación, que simplemente interactúan entre sí de formas distintas. Resulta interesante comprender qué hace que cada célula madre sea una célula madre, pero al final una célula madre en un tejido diferente. Así, produciendo una proteína diferente.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Un método para analizar la distribución de progenitores hematopoyéticos de médula ósea en citometría de flujo, así como para aislar eficazmente altamente purificadas células madre hematopoyéticas (HSC) se describe. El procedimiento de aislamiento se basa esencialmente en el enriquecimiento magnética de c-kit + células y células de clasificación para purificar las CMH para los estudios celulares y moleculares.

El análisis fenotípico y aislamiento de células madre hematopoyéticas murinas y progenitores comprometidos Lineage

El objetivo de este protocolo es aislar a primates no humanos CD34 de las células+ de cebada la médula ósea, estas células con vectores lentivirales de modificar genes y para preparar un producto para infusión en el huésped autólogo. La longitud del protocolo total es aproximadamente de 48 h.

Preparación y modificación genética de primates no humanos tallo hematopoyéticas y células progenitoras

Aquí, presentamos un protocolo para formar con precisión endotelio hemogénico a partir de células madre pluripotentes humanas en una condición libre de alimentador y xeno. Este método tendrá amplias aplicaciones en el modelado de enfermedades y cribado de compuestos terapéuticos.

Diferenciación de endotelio hemogénico de células madre pluripotentes humanas en una condición definida libre de alimentador y xeno

Este protocolo demuestra la inducción de un programa hemogénico en fibroblastos dérmicos humanos mediante la expresión forzada de los factores de transcripción GATA2, GFI1B y FOS para generar células hematopoyéticas madre y progenitoras.

Reprogramación hemogénica de fibroblastos humanos por expresión forzada de factores de transcripción

Este protocolo permite el mantenimiento de células madre hematopoyéticas humanas en reposo in vitro imitando el microambiente de médula ósea utilizando abundantes ácidos grasos, colesterol, concentraciones más bajas de citoquinas e hipoxia.

Un método de cultivo para mantener las células madre hematopoyéticas humanas quiescentes

El presente protocolo describe un procedimiento optimizado de cultivo de células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) para el injerto robusto de células editadas genéticamente in vivo.

Edición génica CRISPR/Cas9 de células madre y progenitoras hematopoyéticas para aplicaciones de terapia génica

Presentamos un protocolo paso a paso para el aislamiento de células madre hematopoyéticas a largo plazo (LT-HSCs) y HSCs a corto plazo (ST-HSCs) utilizando el sistema reportero Hoxb5.

Método de aislamiento para células madre hematopoyéticas a largo y corto plazo

Aquí se presenta un protocolo para iniciar, mantener y analizar cultivos de células madre hematopoyéticas de ratón utilizando expansión ex vivo a base de alcohol polivinílico, así como métodos para manipularlos genéticamente mediante transducción lentiviral y electroporación.

Ex Vivo Expansión y manipulación genética de células madre hematopoyéticas de ratón en cultivos a base de alcohol polivinílico

Aquí, establecimos osteoorganoides in vivo activados por andamios de gelatina cargados con proteína morfogenética ósea 2 para recolectar células madre/progenitoras hematopoyéticas terapéuticas para la reconstrucción de un sistema hematopoyético e inmunológico dañado. En general, este enfoque puede proporcionar una fuente celular prometedora para las terapias celulares.

Enfoque osteo-organoide in vivo para la recolección de células madre/progenitoras hematopoyéticas terapéuticas

Aquí presentamos protocolos que permiten el aislamiento de células estromales de hueso murino, médula ósea, timo y tejido tímico humano compatible con multiómicas unicelulares.

Aislamiento de células estromales de órganos hematopoyéticos

Las inyecciones intrafemorales permiten el injerto de un pequeño número de células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC), colocando las células directamente en la cavidad de la médula ósea. En este trabajo describimos un protocolo experimental de inyección intrafemoral de HSPCs humanas en ratones inmunodeficientes.

Inyección intrafemoral de células madre y progenitoras hematopoyéticas humanas en ratones inmunocomprometidos 

Aprende a purificar células madre hematopoyéticas de larga duración y trasplantarlas en ratones. Este método demuestra técnicas efectivas de esterilización, disección y aislamiento óseo para avanzar en terapias con células madre.

Aislamiento y trasplante de células madre hematopoyéticas (HSC)

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