Los estudios genéticos de proteínas humanas de reparación del ADN utilizando la levadura como un sistema modelo

Los plásmidos WRN se digieren con la endonucleasa de restricción cell one y MLU one, y los fragmentos se purifican a partir de un gel. Estos vectores de expresión digeridos con cell one hasta MLU one, fragmentos WN, se ligarán luego en los sitios cell one a MLU one del vector de levadura. El plásmido de múltiples copias también contiene un marcador seleccionable TRP one.

Los constructos W Rrn se transforman en levadura siguiendo protocolos estándar y los transformantes se seleccionan en medio sintético completo con glucosa careciendo de triptófano. Luego, se realiza un aislamiento por estría de transformantes individuales en medio sintético completo con glucosa sin triptófano y las placas se incuban a partir de la placa maestra. Para analizar la restauración del fenotipo de crecimiento lento en SGS transformado con WRN, se realizan estrías de tres transformantes principales de cepas doble mutante en placas que contienen glucosa o galactosa.

Para analizar el efecto de la expresión de WRN sobre la sensibilidad a HU y MMS, se realiza un ensayo de siembra para determinar la distribución del ciclo celular en células de levadura que expresan WRN. Se lleva a cabo la tinción con DAPI. La expresión de WRN en un huésped heterólogo se analiza mediante análisis de transferencia Western.

Hola, soy Robert Broch del apartado sobre casos de ADN hela en el laboratorio de gerontología molecular del Instituto Nacional sobre el Envejecimiento, uno de los institutos de los Institutos Nacionales de la Salud. Hola, soy Monica Agarwal, también del apartado sobre casos de ADN Heli en el laboratorio de genética molecular del Instituto Nacional sobre el Envejecimiento. Comprender los roles de las proteínas humanas de reparación del ADN y de las vías genéticas es un desafío accesible para muchos investigadores.

Los estudios genéticos en sistemas de mamíferos se han visto limitados debido a la falta de herramientas fácilmente disponibles, incluyendo líneas celulares genéticas mutantes, sistemas reguladores de expresión y marcadores seleccionables adecuados. Hoy les mostraremos procedimientos que utilizan la levadura como sistema modelo para investigar las funciones moleculares y celulares de una enzima desenrolladora de ADN conocida como helicasa en la prevención del envejecimiento prematuro. Utilizamos estos procedimientos en nuestro laboratorio para caracterizar genéticamente el papel del producto del gen humano burner, defectuoso en la reparación del ADN y en el mantenimiento de la estabilidad genómica en el trastorno de envejecimiento prematuro.

El síndrome de Werner es uno de los cinco casos de helicasas de la familia recQ humanas en levadura. Existe únicamente un mutante denominado sgs para estudiar el papel del síndrome de Werner en la respuesta al estrés de replicación. Hemos examinado el efecto de la expresión del síndrome de Werner en un fondo mutante de levadura sobre diversos puntos finales biológicos.

Así que comencemos. Dado que utilizaremos levadura como huésped heterólogo, nuestro primer paso será clonar el gen humano de Werner o su variante en un vector de levadura. Los plásmidos de Werner se digirieron con la endonucleasa de restricción Sal I y Mlu I, y los fragmentos purificados se ligarán posteriormente en los sitios Sal I y Mlu I del vector de expresión en levadura, el cual está bajo la regulación de un promotor inducible por galactosa.

El plásmido multicopia también contiene un marcador seleccionable TRP1. Estos plásmidos de expresión de Werner se transforman luego en las cepas de levadura tróficas para triptófano apropiadas utilizadas en este estudio. Y los transformantes se seleccionan sembrando la suspensión en medio sintético completo con glucosa.

En ausencia de triptófano, incubar las placas a 30 grados Celsius durante tres a cuatro días hasta que aparezcan las colonias. Una vez que las colonias hayan crecido, realizar estrías de transformantes individuales en medio glucosado sintético completo e incubar las placas a 30 grados Celsius durante dos a tres días. Luego, los cepas mutantes de levadura que expresan el gen humano weer y sus variantes se analizan para fenotipos celulares mediante las técnicas demostradas en las siguientes secciones.

Los tres mejores mutantes muestran un defecto severo de crecimiento. Sin embargo, la mutación en el gen SGS uno suprime el fenotipo de crecimiento lento del mutante top three para examinar el efecto de la expresión de Werner sobre el crecimiento de cepas de tipo salvaje S Gs uno o S Gs uno top three, estríe las cepas correspondientes con el vector o con el plásmido de expresión de Werner en placas de medio sintético completo sin triptófano, pero que contienen ya sea 2 % glucosa o 2 % galactosa como control positivo. El efecto de la expresión de SGS uno se determinó incubando las placas a 30 grados durante dos días.

Las cepas silvestres y la cepa mutante sgs uno transformada con vector o con Werner no muestran ninguna diferencia en su patrón de crecimiento. Sin embargo, la cepa doble mutante sgs uno top tres transformada con Werner crece significativamente más lento que la cepa doble mutante sgs uno top tres transformada con vector, para evaluar los requisitos funcionales de Werner para restaurar el fenotipo de crecimiento lento. En el fondo genético sgs uno top tres, se sembraron en placas sintéticas completas sin triptófano que contenían ya sea 2% de glucosa o 2% de galactosa, cepas sgs uno top tres transformadas con mutantes del dominio catalítico de Werner, tras dos días.

La incubación con la mutante de la exonucleasa Werner indicada como E 84 A restaura el fenotipo de crecimiento lento como en Werner, demostrando así que la actividad exonucleasa no es necesaria para la restauración del fenotipo de crecimiento lento en los tres primeros lugares. La mutante de la helicasa Werner crece bien, demostrando por tanto que la actividad helicasa de Werner es necesaria para la restauración del fenotipo de crecimiento lento en los tres primeros lugares. Para determinar la capacidad de Werner de afectar la tasa de crecimiento de sgs.

Una cepa del top tres con bajos niveles de expresión proteica estriada sgs uno, tres cepas del top tres transformadas con el vector Werner o sgs uno en placas sintéticas completas que carecen de triptófano, pero que contienen concentraciones crecientes de galactosa. Incubar todas las placas a 30 grados Celsius durante dos días. El mutante de la exonucleasa Warner y Warner restaura la pendiente del top tres con fenotipo en todos los niveles de galactosa.

Sin embargo, los mutantes de la helicasa de Werner no lo hacen. Se ha demostrado que el doble mutante SGS uno top three es menos sensible que el mutante simple top three al agente alquilante del ADN metil metanosulfonato o MMS o al inhibidor de la replicación hidroxiurea o HU. Para determinar el efecto de la expresión de Werner sobre la sensibilidad al MMS y al HU de las cepas SGS uno o S GS uno top three, cultive cepas de levadura transformadas con vector o con Werner en medio sintético completo con rafinosa, sin triptófano, a 30 grados Celsius como control.

Utilice una cepa parental de tipo silvestre transformada con vector para reinocular todos los cultivos en medio sintético completo con rafinosa que carezca de triptófano y crezca a 30 grados Celsius hasta la fase logarítmica temprana. Cuando los cultivos estén en fase logarítmica temprana, prepare diluciones seriadas de diez veces hasta una dilución de 10 000 veces de estas cepas utilizando medio sintético completo que carezca de triptófano, coloque cuatro microlitros de cada dilución en placas de medio sintético completo con GAL que carezcan de triptófano y contengan 10 milimolares de HU o 0,0025 % de MMS, e incube las placas a 30 grados Celsius durante cuatro días. Un mutante doble SGS uno top tres que esté transformado con sgs de tipo silvestre.

Uno se retrasa en la fase tardía SG2 del ciclo celular, lo que resulta en una morfología en forma de mancuerna. En contraste, la levadura tipo silvestre completa la división celular, dejando menos células con morfología en forma de mancuerna para estudiar la distribución del ciclo celular de la cepa sgs uno top tres transformada con Werner. Primero, cultive cultivos en crecimiento logarítmico de las siguientes cepas en medio sintético completo con RAF, careciendo de triptófano, a 30 grados Celsius durante la noche.

SGS uno de los tres mejores transformados con el vector Werner o SGS uno, y el vector transformado de la cepa parental silvestre, reinocular las culturas a una DO de 0,05. Una vez reinoculadas, cultivar las muestras hasta una DO de 0,5 y cosecharlas por centrifugación. Luego se induce la expresión de Werner mediante la adición de galactosa al 2%. Dejar crecer las culturas a 30 grados Celsius durante seis horas.

Después de seis horas, coseche los cultivos y recolecte las células por centrifugación. Transfiera los cultivos a tubos de microcentrífuga tras la centrifugación, lave las células una vez con PBS. A continuación, fije las células en etanol al 70 % durante 20 minutos a temperatura ambiente; después de lavar las células fijadas dos veces con PBS, re suspenda las células en un volumen de PBS 1×.

Coloque la suspensión celular sobre un portaobjetos y agregue vector shield. Use un medio de montaje con DAPI a una concentración de un microgramo por mililitro. Examine los portaobjetos bajo un microscopio XI Saxo vert para buscar células con núcleos en forma de mancuerna, característica de las células de levadura en la fase SG dos del ciclo celular.

Para determinar la expresión de la proteína Werner o su variante en las cepas de levadura SGS uno o SGS uno top tres transformadas, comience por cultivar las cepas durante seis horas en medio que contiene galactosa para inducir la expresión de la proteína Werner. Después de recolectar las células mediante centrifugación, lávelas con PBS y resuspenda.

Un tampón de lisis alcalina. Hervir las células durante cinco minutos, luego clarificar por centrifugación y neutralizar con ácido clorhídrico uno molar. Estos lisados ya están listos para la electroforesis en geles de SDS poliacrilamida al 8-16% para determinar el nivel de expresión de la proteína Warner bajo la influencia de concentraciones variables de galactosa.

Primero, induzca las culturas con concentraciones variables de galactosa durante seis horas. Luego, recolecte las células por centrifugación y resuspenda en tampón que contenga inhibidores de proteasas. Añada perlas de vidrio de 425 a 600 micrones a la mezcla y rompa las células mediante vortex a alta velocidad durante un minuto, seguido de enfriamiento en hielo durante un minuto.

Repita un total de ocho veces. A continuación, centrifugue el homogenado resultante durante cinco minutos a 15.000 G y recoja la fracción sobrenadante. Después de medir la cantidad de proteína en las fracciones de lisado mediante el método de Bradford, separe concentraciones iguales de proteína en geles de SDS de poliacrilamida al 8-16 %; la expresión de Werner se determina entonces por inmunotransferencia (Western blot) la expresión de Werner en sgs.

Un TOP3 restaura el fenotipo de crecimiento lento de top3, como se muestra en estas fotografías. Cuando cepas de sgs1 top3 transformadas con el vector Werner o sgs1 se siembran en una placa SC de triptófano que contiene 2% de glucosa o 2% de galactosa. La expresión inducida por galactosa de Werner hace que la cepa sgs1 top3 crezca más lentamente.

En contraste, la cepa parental de tipo silvestre o la cepa SGS uno transformada con Werner no se ve afectada en su crecimiento, lo que indica que el crecimiento lento conferido por Werner es específico para el fondo sgs uno top tres. Cuando las cepas SGS uno top tres transformadas con variantes de Werner se sembraron por estría en placas de SC sin triptófano que contenían ya sea 2% de glucosa o 2% de galactosa únicamente.

El Werner con actividad exonucleasa inactiva aún fue capaz de restaurar el fenotipo de crecimiento lento. Esto demuestra que la actividad de helicasa ATPasa de Werner, pero no su actividad exonucleasa, es necesaria para restaurar el fenotipo de crecimiento lento de top three. En un fondo SGS one top three, Werner restauró el fenotipo de crecimiento lento de SGS one top three en todo el rango de concentración de GAL.

Estos resultados indican que la restauración del fenotipo de crecimiento lento en el fondo mutante sgs uno top tres ocurre a bajos niveles de expresión de la proteína Werner. Cuando cultivos en crecimiento logarítmico de cepas sgs, uno top tres transformadas con Werner o sus variantes se sembraron mediante dilución seriada en factores de diez sobre placas SC de triptófano que contenían glucosa o galactosa y MMS o HU, observamos que la expresión de Werner incrementó la sensibilidad al MMS y a la HU de la cepa sgs uno top tres. Además, este efecto sobre la sensibilidad al MMS y a la HU en el fondo sgs uno top tres requiere la actividad helicasa de la ATP de Werner, pero no la actividad exonucleasa.

Finalmente, la expresión de Werner también restaura el retraso característico de dos SG en el top tres, como lo indica la población elevada de células grandes emparejadas. En las células mutantes sgs uno top tres que expresan Werner. En comparación con las células sgs, las células uno top tres transformadas con vector fueron teñidas con Dabi.

Para visualizar los núcleos, las flechas indican la expresión de Werner en núcleos no divididos. En los sgs transformados, una de las tres células superiores fue inducida mediante la adición de las concentraciones indicadas de galactosa y las células se recolectaron seis horas después de la inducción. Se cargaron cantidades iguales de lisado celular total en geles de SDS de poliacrilamida del 8 al 16 %, seguido de la detección por sonda western utilizando un anticuerpo anti-Warner.

Le hemos mostrado cómo investigar los fenotipos celulares asociados con fondos mutantes definidos de levadura para aclarar las funciones celulares y moleculares del gen humano learner mediadas por sus actividades catalíticas e interacciones proteicas. La levadura puede utilizarse como organismo modelo para estudiar las funciones del gen en vías definidas. Al realizar estos procedimientos, es importante seleccionar un fondo mutante de levadura adecuado para discernir el papel del gen bajo estudio en vías definidas.

Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.