Los estudios genéticos de proteínas humanas de reparación del ADN utilizando la levadura como un sistema modelo

Los plásmidos WRN se digieren con la endonucleasa de restricción cell one y MLU one y los fragmentos se purifican a partir de un gel. Estos vectores de expresión digeridos con fragmentos de WN de celda uno a MLU uno se ligan luego en los sitios de celda uno a MLU uno del vector de levadura. El plásmido multicopia también contiene un marcador seleccionable TRP.

Las construcciones de W Rrn se transforman en levadura siguiendo protocolos estándar y los transformadores se seleccionan en medios sintéticos de glucosa completa sin triptófano. A continuación, los transformantes individuales se vierten en medios sintéticos de glucosa completa que carecen de triptófano y las placas se incuban a partir de la placa maestra. Para analizar la restauración del fenotipo de crecimiento lento en SGS transformados en WRN, se colocan tres transformadores de cepas dobles mutantes en placas que contienen glucosa o galactosa.

Para analizar el efecto de la expresión de WRN en HU y MMS Sensitivity, se realiza un spotting para determinar la distribución del ciclo celular de las células de levadura que expresan WRN. Se realiza la tinción de DAPI. La expresión de WRN en el huésped heterólogo se analiza mediante Western Blood Analysis.

Hola, soy Robert Broch de la sección de casos de hela de ADN en el laboratorio de gerontología molecular del Instituto Nacional sobre el Envejecimiento, uno de los institutos de los Institutos Nacionales de Salud. Hola, soy Monica Agarwal, también de la sección de casos de ADN Heli en el laboratorio de genetología molecular de los Institutos Nacionales sobre el Envejecimiento. Comprender las funciones de las proteínas de reparación del ADN humano y las vías genéticas es un desafío asequible para muchos investigadores.

Los estudios genéticos en sistemas de mamíferos han sido limitados debido a la falta de herramientas fácilmente disponibles, incluidas líneas celulares genéticas mutantes, sistemas de expresión reguladores y marcadores seleccionables apropiados. Hoy le mostraremos los procedimientos que involucran a la levadura como un sistema modelo para investigar las funciones moleculares y celulares de una enzima que desenrolla el ADN conocida como helicasa en la prevención del envejecimiento prematuro. Utilizamos estos procedimientos en nuestro laboratorio para caracterizar genéticamente el papel del producto génico del quemador humano que es defectuoso en la reparación del ADN y el mantenimiento de la estabilidad genómica en el trastorno de envejecimiento prematuro.

El síndrome de Werner es uno de los cinco casos de heli de la familia req humana en el este. Solo hay uno llamado sgs one para estudiar el papel del Werner humano en la respuesta al estrés de replicación. Hemos examinado el efecto de la expresión de Werner en el fondo del mutante oriental en varios criterios de valoración biológicos.

Así que vamos a ponernos, vamos a empezar. Dado que utilizaremos la levadura como huésped heterólogo, nuestro primer paso será clonar el gen Werner humano o su variación en un vector de levadura. Los plásmidos de Werner se digierieron con la endonucleasa de restricción Sal one y MLU one y los fragmentos purificados dentro de ellos se ligaron luego en los sitios Sal one MLU one del vector de expresión de levadura que está bajo la regulación de un promotor inducible por galones.

El plásmido multicopia también contiene un marcador seleccionable TRP. Estos plásmidos de expresión de Werner se transforman luego en las cepas de levadura trópica de triptófano apropiadas utilizadas en este estudio. Y los transformantes se seleccionan mediante la siembra de la suspensión en medios sintéticos de glucosa completa.

A falta de triptófano, incuba las placas a 30 grados centígrados durante tres o cuatro días hasta que aparecen las colonias. Una vez que las colonias han crecido a raya, los transformantes individuales en medios sintéticos de glucosa completa e incuban placas a 30 grados centígrados durante dos o tres días. A continuación, se investigan los fenotipos celulares de las cepas mutantes que expresan el gen weer humano y sus variantes mediante las técnicas demostradas en las secciones siguientes.

Los tres mutantes principales muestran un defecto de crecimiento grave. Sin embargo, la mutación en el gen SGS one suprime el fenotipo de crecimiento lento de los tres mutantes principales para examinar el efecto de la expresión de Werner en el crecimiento de las cepas S Gs uno o S Gs de tipo salvaje una de las tres cepas superiores rayan las cepas correspondientes con el vector o plásmido de expresión de Werner en placas de medios completos sintéticos que carecen de triptófano pero que contienen un 2% de glucosa o un 2% de lactosa gala como control positivo. Se determinó el efecto de la expresión de SGS en placas de incubación a 30 grados durante dos días.

El tipo salvaje y SGS una cepa mutante transformada con vector o Werner no muestran ninguna diferencia en su patrón de crecimiento. Sin embargo, Werner transformó SGS una de las tres cepas dobles mutantes principales que S GS una cepa doble mutante superior transformada con vector para evaluar los requisitos funcionales de Warner para restaurar el fenotipo de crecimiento lento. En el sgs, una de las tres mejores cepas de fondo se transformaron con mutantes del dominio catalítico de Warner en placas completas sintéticas que carecen de triptófano que contienen 2% de glucosa o 2% de galactosa después de dos días.

El mutante de exonucleasa de Werner indicado como E 84 A restaura el fenotipo de crecimiento lento como Werner, lo que demuestra que la actividad de la exonucleasa no es necesaria para la restauración del fenotipo de crecimiento lento de los tres principales. El mutante Werner Helicase crece bien, lo que demuestra que la actividad de Werner helicasa es necesaria para la restauración del fenotipo de los tres principales crecimientos lentos. Determinar la capacidad de Werner para afectar la tasa de crecimiento de sgs.

Una de las tres cepas principales con niveles más bajos de expresión de proteínas raya sgs una cepa de las tres mejores transformadas con el vector Werner o sgs una en placas completas sintéticas que carecen de triptófano, pero que contienen concentraciones crecientes de galactosa. Incubar todas las placas a 30 grados centígrados durante dos días. Warner y Warner Exonucleasa mutante restauran los tres niveles superiores con fenotipo en todos los niveles de galactosa.

Sin embargo, los mutantes de Warner Helicase no lo hacen. Se ha demostrado que el mutante doble SGS uno top tres es menos sensible que los tres mutantes principales al agente alquilante del ADN, el sulfonato de metil metano o MMS, o al inhibidor de replicación hidroxiurea o HU, para determinar el efecto de la expresión de Warner en la sensibilidad MMS y HE de las tres cepas principales de SGS one o S GS one. Cultivar cepas de levadura transformadas con vector o Werner en medios sintéticos completos de rafinosa sin triptófano a 30 grados centígrados como control.

Se utilizó una cepa parental de tipo silvestre transformada con vector para reinocular todos los cultivos en medios sintéticos de rafinosa completa sin triptófano y se cultivaron a 30 grados centígrados hasta la fase logarítmica temprana. Cuando los cultivos se encuentren en la fase logarítmica temprana, se preparará una dilución en serie de diez veces hasta 10.000 veces de estas cepas utilizando medios sintéticos completos que carezcan de triptófano, cuatro microlitros de cada dilución en medios sintéticos completos de GAL que carezcan de placas de triptófano que contengan 10 milimolares de HU o 0,0025% MMS, incubar las placas a 30 grados Celsius durante cuatro días. Un SGS uno top tres doble mutante que se transforma con sgs de tipo salvaje.

Uno se retrasa a finales de la fase dos del ciclo celular, lo que da lugar a una morfología en forma de mancuerna. Por el contrario, la levadura de tipo salvaje completa la división celular, dejando menos células en forma de mancuerna para estudiar la distribución del ciclo celular de la cepa de Werner transformada sgs una de las tres cepas principales. En primer lugar, cultive logarítmicamente cultivos de las siguientes cepas en medios RAF completos sintéticos sin triptófano a 30 grados centígrados durante la noche.

SGS uno top tres transformado con vector Werner o SGS uno y el vector transformado cepa parental Wildtype vuelve a inocular los cultivos a OD 0.05. Una vez reinoculados, los cultivos se cultivan hasta OD 0,5 y se cosechan por centrifugación, se induce la expresión de Werner mediante la adición de lactosa gala a una concentración del 2%. Deje que los cultivos crezcan a 30 grados centígrados durante seis horas.

Después de seis horas, coseche los cultivos, recoja las células por centrifugación. Transfiera los cultivos a tubos de microcentrífuga después de la centrifugación, lave las células una vez con PBS. A continuación, fije las células en etanol al 70% durante 20 minutos a temperatura ambiente, después de lavar las células fijas dos veces con PBS, vuelva a suspender las células en un XPBS.

Coloque la suspensión de la celda en una corredera y agregue un escudo vectorial. Medios de montaje con DAPI a una concentración de un microgramo por mililitro. Examine los portaobjetos bajo un microscopio XI Saxo vert para buscar células con núcleos en forma de mancuerna, que es característico de las células de levadura en la fase dos del ciclo celular SG.

Determinar la expresión de la proteína Werner o su varianza en las tres cepas de levadura principales transformadas de SGS one o SGS one. Comience cultivando las cepas durante seis horas en medios que contengan galactosa para inducir la expresión de la proteína Werner. Después de recolectar células por centrifugación, lávelas con PBS y vuelva a suspender.

Un tampón de lisis alcalina. Hervir las células durante cinco minutos, luego clarificar por centrifugación y neutralizar con un molar de ácido clorhídrico. Estos lisados están ahora listos para la electroforesis en geles SDS de poliacrilamida al 8 al 16% para determinar el nivel de expresión de la proteína Warner bajo la influencia de concentraciones variables de galactosa.

En primer lugar, inducir los cultivos con diferentes concentraciones de galactosa durante seis horas. A continuación, se recogen las células por centrifugación y se vuelven a suspender en un puffer que contiene inhibidores de la proteasa. Agregue perlas de vidrio de 425 a 600 micras a la mezcla y rompa las células mediante un vórtice de vórtice a alta velocidad durante un minuto, seguido de glaseado durante un minuto.

Repita un total de ocho veces. A continuación, centrifugar el homogeneizado resultante durante cinco minutos a 15.000 Gs y recoger la fracción sobrenadante. Después de medir la cantidad de proteína en las fracciones de lisado por el método de Bradford, resuelva concentraciones iguales de proteína en geles SDS de ocho a 16% de poliacrilamida La expresión de Werner se determina mediante la expresión de Western blot Werner en sgs.

Uno de los tres primeros restaura el fenotipo de crecimiento lento de los tres primeros, como se muestra en estas fotografías. Cuando sgs una de las tres cepas superiores transformadas con vector Werner o sgs una raya en una placa de triptófano SC que contiene 2% de glucosa o 2% de galactosa. La expresión de Werner inducida por la galactosa hace que la cepa SGS one top three crezca más lentamente.

Por el contrario, la cepa parental de tipo salvaje o cepa SGS una cepa transformada con el Werner no se ve afectada en su crecimiento, lo que indica que el crecimiento lento conferido por Werner es específico del sgs. Un fondo de los tres primeros. Cuando SGS una, las tres cepas principales transformadas con variantes de Werner se rayaron en placas de triptófano SC que contenían solo un 2% de glucosa o un 2% de galactosa.

El Werner muerto por exonucleasa aún era capaz de restaurar el fenotipo de crecimiento lento. Esto demuestra que la ATPasa de Werner helicasa, pero no la actividad exonucleasa, es necesaria para restaurar el fenotipo de crecimiento lento de los tres primeros. En un entorno de SGS one top three, Werner restauró el fenotipo de crecimiento lento de SGS one top three en todo el rango de concentración de GAL.

Estos resultados indican que la restauración del fenotipo de crecimiento lento en el fondo de mutantes sgs one top three ocurre a niveles bajos de expresión de la proteína de Werner. Cuando se cultivaron logarítmicamente cultivos de sgs, se detectó una de las tres cepas principales transformadas con Werner o sus variantes en una dilución serial diez veces mayor en placas de triptófano SC que contenían glucosa o galactosa y MMS o HU. Observamos que la expresión de Werner aumentó el MMS y dos la sensibilidad de la cepa SGS una de las tres principales. Además, este efecto sobre la sensibilidad de MMS y HU en el fondo de los tres principales de SGS requiere la helicasa de Werner ATP, pero no la actividad de clease de exones.

Finalmente, la expresión de Werner también restaura el retardo característico de SG dos de los tres primeros, como lo indica la población elevada de células grandes y concomificadas. En el sgs uno de las tres células mutantes principales que expresan Werner. En comparación con sgs, las tres células superiores transformadas con células vectoriales se tiñeron con Dabi.

Para visualizar los núcleos y las flechas indican la expresión de Werner de los núcleos indivisos. En el sgs transformado, se indujo una de las tres células principales mediante la adición de concentraciones de galactosa indicadas y se recolectaron células seis horas después de la inducción. Se cargaron cantidades iguales de lisado celular total en geles SDS de poliacrilamida del 8 al 16%, seguidos de la detección de sangre occidental utilizando anticuerpos anti Warner.

Le hemos mostrado cómo investigar los fenotipos celulares asociados con fondos mutantes de levadura definidos para aclarar las funciones celulares y moleculares del gen de aprendizaje humano mediado por sus actividades catalíticas e interacciones proteicas. La levadura se puede utilizar como organismo modelo para estudiar las funciones del gen en vías definidas. Al realizar estos procedimientos, es importante seleccionar un fondo de mutante de levadura apropiado para discernir el papel del gen bajo investigación en vías definidas.

Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.