Electrofusión de células visualiza con microscopía de fluorescencia

La electrofusión implica la aplicación de pulsos eléctricos cortos de alto voltaje a las celdas en un contexto cercano. En este video, demostramos la electrofusión de células in vitro mediante el método Adherence modificado. Los experimentos se realizaron en células de melanoma de ratón, BF uno.

Para el experimento, siga estos pasos. Cultive células en dos matraces de cultivo separados hasta un 80% de confluencia. Por separado, agregue 2,1 microlitros de cada solución madre.

10 milimolares C-M-F-D-A o CMRA respectivamente a tres mililitros de tampón Krebs Hess en un tubo de centrífuga. Enjuague las celdas dos veces con tampón Krebs Hess y luego inserte las soluciones de carga en los matraces. Las soluciones de carga contienen aproximadamente siete micromolares C-M-F-D-A o CMRA respectivamente.

Incubar las células durante 30 minutos en atmósfera controlada. Durante esta primera incubación, las regiones pasan libremente a través de las membranas celulares hacia el citosol, donde se transforman en productos de reacción permeados IMP de membrana. Después de esta primera incubación, enjuague y luego incube las células con medio de cultivo durante otras dos horas.

Las células se observan utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con una cámara CCD refrigerada en el software de adquisición. Establezca la longitud de onda de excitación en 548 nanómetros y elija una imagen de fluorescencia de amenaza de filtro de paso de banda adecuada de las celdas cargadas con CMRA para las celdas cargadas con C-M-F-D-A. Establezca la longitud de onda de excitación en 492 nanómetros y elija un filtro de paso de banda para ojos de tripsina de imagen de fluorescencia verde, y cuente las células en ambos matraces y mezcle las células rojas y verdes en una proporción de uno a uno, ajuste la concentración de células a 5 millones de células por mililitro.

Coloque una gota de 20 microlitros de suspensión celular en el centro de cada pocillo. En una placa de 24 pocillos múltiples, incube las células en una atmósfera controlada durante 20 minutos para permitir que las células se adhieran ligeramente a la superficie del pocillo en una monocapa y establezcan contactos celulares entre sí. Coloque el pocillo múltiple con células en la platina del microscopio.

Coloque los electrodos en el fondo del pozo y conéctelos al generador de pulsos Para lograr una electrofusión óptima y mantener la viabilidad de la celda, se deben utilizar parámetros adecuados de pulsos eléctricos. Estos parámetros dependen de la línea celular y deben determinarse en experimentos preliminares. Retire el medio de cultivo y lave las células con un mililitro de tampón de fosfato de potasio ISO omu a 350 microlitros de tampón de fosfato de potasio hypos Miller para inducir la hinchazón celular.

Deje las células en tampón hiperósmico durante dos minutos antes de aplicar pulsos eléctricos. Los pulsos eléctricos deben aplicarse cuando las celdas estén cerca de sus volúmenes máximos. Es decir, antes de que comiencen el volumen regulatorio.

Disminución en nuestro experimento. Se aplicó un tren de ocho pulsos rectangulares con una duración de 100 microsegundos a un hercio. Después de la entrega de pulsos.

Deje las células intactas durante 10 minutos después de 10 minutos. Rendimiento de difusión determinado mediante contraste facial y microscopio fluorescente. E adquiera tres imágenes, contraste facial, fluorescencia roja y verde en cinco campos de visión elegidos al azar.

En cada uno, cree imágenes de tres canales a partir de cada triplete de imagen en el software de imagen J para mejorar la calidad visual de las imágenes a los pasos de preprocesamiento que se pueden aplicar a las imágenes originales, el fondo, la resta y las mejoras de contraste con conjuntos de parámetros predeterminados. Finalmente, las imágenes de tres canales se componen utilizando el complemento RGB a imagen gris J. En dicha imagen, se puede ver el citoplasma en reposo junto con las membranas celulares.

Por lo tanto, se pueden determinar fácilmente pocas células en el recuento de imágenes de tres canales de los tres tipos de células, rojo, verde y dualmente fluorescente. Determine el porcentaje de células dualmente fluorescentes dividiendo el número de células dualmente fluorescentes por un número de todas las células de cada imagen. El rendimiento de fusión se define entonces como el porcentaje de células dualmente fluorescentes multiplicado por dos.

Dado que la mitad de las celdas de la vista no se detectan cuando las celdas del mismo color vistas.