Name: Electrofusión de células visualiza con microscopía de fluorescencia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-01T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 2 s
Description: Aprende la electrofusión de células in vitro mediante un método de adherencia modificado con electroporación. Este protocolo utiliza melanoma de ratón y microscopía de fluorescencia para visualizar y cuantificar la eficiencia de fusión celular.

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Este trabajo fue apoyado por la Agencia de Investigación de Eslovenia (proyecto J2-9764 y el programa P2-0249). Este video representa el material complementario para la &quot;base de electroporación, tecnologías y tratamientos&quot; taller científico y postgrado, organizado por la Facultad de Ingeniería Eléctrica de la Universidad de Ljubljana, en Eslovenia.

I. Carga de las células con células seguidores CMFDA y CMRA <ol><li> Los experimentos se realizaron en células previamente preparada de la línea celular de ratón melanoma (B16-F1). Las células se cultivan en dos separados 25 frascos de cultivo cm 2 (TPP, ZDA) al 70-80% de confluencia en medio de cultivo DMEM (Dulbecco modificado de Eagle), complementado con suero fetal bovino al 10%, 0,15 mg / ml de L-glutamina, 16 mg / ml de gentamicina (todos de Sigma-Aldrich, Alemania), 200 unidades / ml crystacillin (Pliva, Croacia), y se incubaron en el 5% de CO 2 a 37 ° C. </li><li> Preparar dos soluciones madre 10 mM de seguidores celular (Invitrogen, EE.UU.) mediante la adición de 10,76 l y 9 l (para el verde y CMFDA de Orange CARM, respectivamente) de DMSO (Sigma-Aldrich, Alemania) a 50 mg de colorante en el original Invitrogen vial. La solución madre se pueden almacenar en un refrigerador a 4 º C durante unos pocos meses. Antes de comenzar los experimentos, calentar la solución hasta que los cristales se disuelven de DMSO. </li><li> Prepare bicarbonato sin Krebs-Hepes buffer (130 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 1,2 mM KH 2 PO 4, 11,7 mM D-glucosa, 1,3 mM CaCl 2, 10 mM HEPES, pH 7,4). En dos de 15 ml tubos Eppendorf separado mezclar 2,1 l de cada solución madre (10 mM CMFDA o CARM, respectivamente) en 3 ml de bicarbonato libre de Krebs-Hepes buffer. Esto produce una "solución de carga", que contiene aproximadamente 7 M CMFDA (o CARM). </li><li> Enjuague las células dos veces con bicarbonato sin Krebs-Hepes buffer y luego insertar la carga de soluciones en los frascos. Se incuban las células durante 30 minutos en el 5% de CO 2 a 37 ° C. Durante esta primera incubación reactivos pasar libremente a través de las membranas celulares, pero una vez dentro de la célula, los reactivos se transforman en células impermeable productos de reacción fluorescente. </li><li> Después de la incubación primera vez, aclarar e incubar las células con medio de cultivo por otras dos horas en el 5% de CO 2 a 37 ° C. </li><li> Trypsinize células en ambos frascos (cargado con CMFDA y CARM) y la mezcla de glóbulos rojos y verdes, unidos en una proporción de 1:1 en un tubo de centrífuga de 50 ml (TPP, ZDA). Ajustar la concentración de células a 5 x 10 6 células / ml por dilución con medio DMEM o por la concentración de centrífuga. Lugar una caída de 20 l de suspensión celular en cada pocillo de 24 pocillos de la placa (TPP, ZDA). Se incuban las células en el 5% de CO 2 a 37 ° C durante 20 minutos para que puedan colocar un poco a la superficie del pozo y establecer contactos de la célula. </li></ol> II. Electrofusión <ol><li> Prepare el buffer de isoosomolar fosfato de potasio (10 mM KH2PO4, 10 mM K 2 HPO 4, 1 mM MgCl 2, 250 mM de sacarosa) y tampón fosfato de potasio hipoosmolar (10 mM KH2PO4, 10 mM K 2 HPO 4, 1 mM de MgCl2, 75 mM de sacarosa) . </li><li> Coloque el multipocillo con células en el microscopio, la posición de los electrodos en la parte inferior del pozo y conectarlos al generador de pulsos. </li><li> Lavan las células con 1 ml de solución tampón fosfato de potasio isoosomolar. Añadir 350 l de tampón fosfato de potasio hipoosmolar con el fin de inducir la inflamación celular. El tampón debe cubrir los electrodos. </li><li> Salir de las células en tampón hipoosmolar durante 2 minutos antes de la aplicación de pulsos eléctricos. Durante este tiempo de llegada de las moléculas de agua en las células debido a un desequilibrio osmótico entre el interior y el exterior de las células causar un aumento del volumen celular. Impulsos eléctricos se debe aplicar cuando las células están cerca de su volumen máximo, antes de comenzar a disminuir el volumen de regulación. </li><li> Para lograr óptimos de electrofusión y mantener la viabilidad celular, los parámetros óptimos de los impulsos eléctricos se debe utilizar. Estas dependen de la línea celular utilizada [1]. En este experimento, un tren de 8 pulsos rectangulares (cada uno con duración de 100 ms a 1 Hz) se aplica a cada muestra, con dispositivo de electroporación (en nuestro caso Cliniporator, IGEA, Italia). Los pulsos son entregados a dos electrodos paralelos Pt / Ir con un diámetro de 0,8 mm y 5 mm de distancia entre ellos, creando un campo eléctrico de aproximadamente 1200 V / cm entre los electrodos en cada pozo, a excepción del control de pozos. </li><li> Salen de las células en reposo durante 10 minutos después de la entrega de pulso. Determinar el rendimiento de fusión mediante microscopía de contraste de fase y fluorescencia. </li></ol> III. De adquisición de imágenes y la determinación del rendimiento de la fusión <ol><li> Las células se observan con un microscopio de fluorescencia (en nuestro caso Zeiss Axiovert 200, Zeiss, Alemania) equipado con un objetivo (x20) y una cámara CCD enfriado (VisiCam 1280, Visitron, Alemania). Las imágenes se adquieren en MetaMorph 7.1.1 (Molecular Devices, EE.UU.), pero otro software de adquisición similar también se puede utilizar. CMFDA se excita con un monocromador (policroma IV, Visitron, Alemania) a 492 nm y 548 nm en la CARM. La fluorescencia de CMFDA y CMRA se realiza a través de dos filtros de emisión, uno centrado en 535 nm (HQ535/30m, por CMFDA) y el otro centrado en 510 nm (D605/55m, por CMRA, tanto Chroma, EE.UU.). El uso de espejo dicroico (Q515LP) que impidan la diafonía canal. </li><li> La adquisición de tres imágenes (contraste de fases, de color rojo y la fluorescencia verde) durante cinco campos elegidos al azar en cada pozo. Crear tres imágenes de canales de cada triplete de la imagen. En dicha imagen citoplasma fluorescentes pueden verse, junto con las membranas celulares. Células fusionadas por lo tanto se puede determinar fácilmente [Figura 1]. </li><li> Contar con los tres tipos de células (rojo, verde y fluorescente dual) en cada imagen de tres canales. Determinar el porcentaje de células fluorescentes doblemente dividiendo el número de células doblemente fluorescente con el número de todas las células en cada imagen. Rendimiento de fusión se define como el porcentaje de células fluorescentes doblemente multiplicado por 2, ya que la mitad de las células fusionadas no se detectan (cuando las células de la mecha del mismo color). </li></ol> Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/1991/1991fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 Imagen de microscopía tres canales de B16F1 células después de electrofusión:. Contraste de fases, CMRA fluorescencia (excitación a 548 nm) y CMFDA fluorescencia (excitación a 492 nm), aumento del objetivo 20x

<ol><li>Čemazar, M., Jarm, T., Miklavčič, D., Maček-Lebar, A., Ihan, A., Kopitar, N. A., Serša, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+electric-field+intensity+on+electropermeabilization+and+electrosensitivity+of+various+tumor-cell+lines+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Electro.+Magnetobiol%22%5BJournal%5D)">Effect of electric-field intensity on electropermeabilization and electrosensitivity of various tumor-cell lines in vitro.</a> Electro. Magnetobiol. 17, 263-272 (1998).</li>
<li>Trontelj, K., Reberšek, M., Kandušer, M., čurin šerbec, V., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+bulk+cell+electrofusion+in+vitro+for+production+of+human-mouse+heterohybridoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry%22%5BJournal%5D)">Optimization of bulk cell electrofusion in vitro for production of human-mouse heterohybridoma cells.</a> Bioelectrochemistry. 74, 124-129 (2008).</li>
<li>Rols, M. -P., Teissié, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+electrically+induced+permeabilization+and+fusion+of+Chinese+hamster+ovary+cells+by+osmotic+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Modulation of electrically induced permeabilization and fusion of Chinese hamster ovary cells by osmotic pressure.</a> Biochemistry. 29, 4561-4567 (1990).</li>
<li>Neil, G., Zimmermann, U. Electrofusion. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNeil%2C+G+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 220, 174-196 Forthcoming.</li>
<li>Abidor, I. G., Li, L. -H., Hui, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+cell+pellets%3A+II.+Osmotic+properties%2C+electroporation%2C+and+related+phenomena%3A+Membrane+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Studies of cell pellets: II. Osmotic properties, electroporation, and related phenomena: Membrane interactions.</a> Biophysical journal. 67, 427-435 (1994).</li>
<li>Jaroszeski, M. J., Gilbert, R., Fallon, P. G., Heller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanically+facilitated+cell-cell+electrofusion%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Mechanically facilitated cell-cell electrofusion.</a> Biophys J. 67 (4), 1574-1581 (1994).</li>
<li>Ramos, C., Bonefant, D., Teissié, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+hybridization+by+electrofusion+on+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Cell hybridization by electrofusion on filters.</a> Analytical biochemistry. 302, 213-219 (2002).</li>
<li>Cao, Y., Yang, J., Yin, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+high-throughput+cell+electrofusion+in+a+microelectrode-array+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Study of high-throughput cell electrofusion in a microelectrode-array chip.</a> Microfluid Nanofluid. 5, 669-675 (2008).</li>
<li>Ušaj, M., Trontelj, M., Kandušer, M., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+size+dynamics+and+viability+of+cells+exposed+to+hypotonic+treatment+and+electroporation+for+electrofusion+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Radiol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cell size dynamics and viability of cells exposed to hypotonic treatment and electroporation for electrofusion optimization.</a> Radiol. Oncol. 43, 108-119 (2009).</li>
<li>Teissié, J., Ramos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+electric+field+pulse+induced+long-lived+permeabilization+and+fusogenicity+in+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Correlation between electric field pulse induced long-lived permeabilization and fusogenicity in cell membranes.</a> Biophys. J. 74, 1889-1898 (1998).</li>
</ol>

La capacidad de las membranas celulares de fusionar de forma no específica, por ejemplo, por campos eléctricos externos, es importante para la biotecnología, la medicina y la investigación en la biología. Fusión inespecíficos, permite la producción de células híbridas de gran valor y sus productos, como los anticuerpos monoclonales, y proporciona información sobre los mecanismos fundamentales de la fusión [2]. Electrofusión es un método potencialmente muy eficaz ya que puede ser ajustado correctamente a diferentes tipos de células. Electrofusión se logra cuando las células en contacto físico se ponen en su estado fusogénica (predisposición a la fusión) por medio de pulsos de alta tensión eléctrica. La eficiencia de electrofusión depende de varios parámetros que afectan a dos partes del proceso de electrofusión. Primera parte del proceso de electrofusión es el logro de un estrecho contacto físico entre las células, que pueden ser obtenidos con diferentes métodos [3-8]. Método de adherencia (las células que crecen a la confluencia) se puede utilizar de manera eficiente gracias a los contactos de manera espontánea de células establecidas en zonas grandes entre las células, sin embargo, que produce células fusionadas muy grandes con muchos núcleos. Estamos utilizando el método de adherencia modificado, en células más pequeñas (de 2 a 5 núcleos), que tienen más probabilidades de sobrevivir y proliferar, se obtienen (Figura 1). Contacto entre las células también se benefician de la hinchazón osmótica de las células, debido al tratamiento osmótico utilizado en el experimento [9]. Segunda parte del proceso de electrofusión es el logro del estado fusogénica de las membranas celulares. Estado fusogénica se correlaciona bien con el estado electropermeabilized de la membrana (células no son específicamente permeabilized a las moléculas que normalmente no pueden pasar a través de la membrana intacta) y se rige por los mismos parámetros de los pulsos eléctricos (amplitud, duración, número y frecuencia) [10] . Los valores de los parámetros eléctricos necesarios para la electroporación óptima [1] y electrofusión difieren entre las distintas células y depende del tamaño de las células y sus propiedades biológicas. Parámetros eléctricos tanto, deben ser optimizados para diferentes líneas celulares, que se utilizan como socios de la fusión, para obtener la fusión.

<table><tbody><tr><td>CMRA</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>C34551</td><td>Colorante fluorescente citosólico</td></tr><tr><td>CMFDA</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>C7025</td><td>Colorante fluorescente citosólico</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM </td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5671</td><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modificado de Eagle&amp;rsquo;medio s</td></tr><tr><td>suero de feto bovino</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>crystacilina</td><td>Reactivo</td><td>Pliva</td><td>625110</td><td>antibiótico</td></tr><tr><td>gentamicina</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td>antibiótico</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Reactivo</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>A124873 927</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4248</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-8266</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Reactivo</td><td>Fluka</td><td>71382</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Reactivo</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>A154336 908</td><td></td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosa</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>sacarosa</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16104</td><td></td></tr><tr><td>Generador de impulsos eléctricos</td><td>Herramienta</td><td>IGEA</td><td></td><td>Cliniporator VITAE</td></tr><tr><td>Placa de múltiples pozos</td><td>Herramienta</td><td>Techno Plastic Products</td><td>92424</td><td></td></tr><tr><td>tubo cónico de 50 ml</td><td>Herramienta</td><td>Techno Plastic Products</td><td>91050</td><td></td></tr><tr><td>tubo cónico de centrífuga de 15 ml</td><td>Herramienta</td><td>Techno Plastic Products</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; frasco de cultivo</td><td>Herramienta</td><td>Techno Plastic Products</td><td>90026</td><td></td></tr><tr><td>Electrodos</td><td>Herramienta</td><td>Personalizado</td><td></td><td>Pt/Ir</td></tr></tbody></table>

electrofusión de células visualiza con microscopía de fluorescencia

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Electrofusión de células es un método seguro, no-virales y no químicas que pueden ser utilizados para la preparación de células híbridas para la terapia humana. Electrofusión implica la aplicación de corta pulsos de alta tensión eléctrica a las células que están en contacto cercano. Aplicación de corto y de alta tensión de los impulsos eléctricos provoca la desestabilización de las membranas de las células plasmáticas. Desestabilizado las membranas son más permeables a las moléculas diferentes y también son propensos a la fusión con cualquier membrana vecinos desestabilizado. Electrofusión es, pues, un método conveniente para lograr una fusión no específicos de células muy diferentes<em&gt; In vitro</em&gt;. Con el fin de obtener la fusión, las membranas celulares, desestabilizado por el campo eléctrico, debe estar en estrecho contacto para permitir la fusión de las bicapas de los lípidos y por lo tanto su citoplasma. En este vídeo, se demuestra electrofusión eficiente de las células<em&gt; In vitro</em&gt; Por el método de adherencia modificado. En este método, las células se permite adjuntar sólo un poco a la superficie del pozo, por lo que el medio se pueden cambiar y las células conservan su forma esférica. Visualización de la fusión es evaluado por pre-etiquetado del citoplasma de las células con diferentes tintes fluorescentes célula de seguimiento, la mitad de las células se marcan con color naranja CARM y la otra mitad de verde CMFDA. Rendimiento de fusión se determina el número de células fluorescentes doblemente dividido por el número de todas las células se multiplican por dos.

En este video se demuestra electrofusión eficiente de las células<em&gt; In vitro</em&gt; Por el método de adhesión modificar mediante electroporación y la posterior detección de la visualización de células fusionadas con microscopía de fluorescencia.

Electrofusión de células visualiza con microscopía de fluorescencia

La electrofusión celular es un método seguro, no viral y no químico que puede utilizarse para la preparación de células híbridas destinadas a terapias humanas. La electrofusión consiste en...

La electrofusión implica la aplicación de pulsos eléctricos breves de alto voltaje a células en estrecho contacto. En este video, demostramos la electrofusión de células in vitro mediante el método de Adherencia modificado. Los experimentos se realizaron con células de melanoma de ratón, BF uno.Para el experimento, siga estos pasos. Cultive células en dos frascos de cultivo separados hasta alcanzar una confluencia del 80 %. Por separado, agregue 2,1 µL de cada solución stock.10 milimolar de C-M-F-D-A o CMRA, respectivamente, a tres mililitros de tampón Krebs Hess en un tubo de centrífuga. Lave las células dos veces con tampón Krebs Hess y luego introduzca las soluciones de carga en los frascos. Las soluciones de carga contienen aproximadamente siete micromolar de C-M-F-D-A o CMRA, respectivamente.Incube las células durante 30 minutos en una atmósfera controlada. Durante esta primera incubación, las regiones pasan libremente a través de las membranas celulares hacia el citosol, donde se transforman en productos de reacción permeables a la membrana IMP. Después de esta primera incubación, enjuague y luego incube las células con medio de cultivo durante otras dos horas.Las células se observan utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con una cámara CCD refrigerada en el software de adquisición. Establezca la longitud de onda de excitación en 548 nanómetros y seleccione un filtro de paso de banda adecuado para obtener la imagen de fluorescencia de las células cargadas con CMRA para las células cargadas con C-M-F-D-A. Establezca la longitud de onda de excitación en 492 nanómetros y elija un filtro de paso de banda para la imagen de fluorescencia verde de los ojos de tripsina, cuente las células en ambos frascos y mezcle las células rojas y verdes juntas en una proporción de uno a uno; ajuste la concentración celular a 5 millones de células por mililitro.Coloque una gota de 20 microlitros de suspensión celular en el centro de cada pocillo. Incube las células en una placa de 24 pocillos en una atmósfera controlada durante 20 minutos para permitir que las células se adhieran ligeramente a la superficie del pocillo en una monocapa y establezcan contactos celulares entre sí. Coloque la placa de pocillos con las células sobre la platina del microscopio.Coloque los electrodos en la parte inferior del pocillo y conéctelos al generador de pulsos. Para lograr una electrofusión óptima y mantener la viabilidad celular, deben utilizarse parámetros adecuados de pulsos eléctricos. Estos parámetros dependen de la línea celular y deben determinarse en experimentos preliminares. Retire el medio de cultivo y lave las células con un mililitro de tampón fosfato de potasio ISO omu con 350 microlitros de tampón fosfato de potasio hypos Miller para inducir la hinchazón celular.Deje las células en tampón hiperosmótico durante dos minutos antes de aplicar los pulsos eléctricos. Los pulsos eléctricos deben aplicarse cuando las células estén cerca de sus volúmenes máximos, es decir, antes de que comiencen la regulación del volumen.Disminución en nuestro experimento. Se aplicó un tren de ocho pulsos rectangulares con una duración de 100 microsegundos a un hercio. Después de la entrega del pulso.Deje las células sin perturbar durante 10 minutos tras 10 minutos. Determine el rendimiento de difusión mediante microscopía de contraste de fase y fluorescencia. Adquiera tres imágenes, de contraste de fase, fluorescencia roja y verde, en cinco campos de visión elegidos al azar.En cada uno, se crearán imágenes de tres canales a partir de cada tríada de imágenes en el software ImageJ para mejorar la calidad visual de las imágenes antes de que se puedan aplicar pasos de preprocesamiento a las imágenes originales, como la sustracción de fondo y mejoras de contraste con conjuntos de parámetros predeterminados. Finalmente, las imágenes de tres canales se componen utilizando el complemento RGB a escala de grises de ImageJ. En dicha imagen, se puede observar el citoplasma en reposo junto con las membranas celulares.Por lo tanto, pocos pueden determinarse fácilmente en la imagen de tres canales que contabiliza los tres tipos de células: rojas, verdes y doblemente fluorescentes. Determine el porcentaje de células doblemente fluorescentes dividiendo el número de células doblemente fluorescentes entre el número total de células en cada imagen. El rendimiento de fusión se define entonces como el porcentaje de células doblemente fluorescentes multiplicado por dos.Dado que la mitad de las células de vista no se detectan cuando las células tienen vistas del mismo color.

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