Electrofusión de células visualiza con microscopía de fluorescencia
1 de julio de 2010
En este video se demuestra electrofusión eficiente de las células In vitro Por el método de adhesión modificar mediante electroporación y la posterior detección de la visualización de células fusionadas con microscopía de fluorescencia.
La electrofusión implica la aplicación de pulsos eléctricos cortos de alto voltaje a las celdas en un contexto cercano. En este video, demostramos la electrofusión de células in vitro mediante el método Adherence modificado. Los experimentos se realizaron en células de melanoma de ratón, BF uno.
Para el experimento, siga estos pasos. Cultive células en dos matraces de cultivo separados hasta un 80% de confluencia. Por separado, agregue 2,1 microlitros de cada solución madre.
10 milimolares C-M-F-D-A o CMRA respectivamente a tres mililitros de tampón Krebs Hess en un tubo de centrífuga. Enjuague las celdas dos veces con tampón Krebs Hess y luego inserte las soluciones de carga en los matraces. Las soluciones de carga contienen aproximadamente siete micromolares C-M-F-D-A o CMRA respectivamente.
Incubar las células durante 30 minutos en atmósfera controlada. Durante esta primera incubación, las regiones pasan libremente a través de las membranas celulares hacia el citosol, donde se transforman en productos de reacción permeados IMP de membrana. Después de esta primera incubación, enjuague y luego incube las células con medio de cultivo durante otras dos horas.
Las células se observan utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con una cámara CCD refrigerada en el software de adquisición. Establezca la longitud de onda de excitación en 548 nanómetros y elija una imagen de fluorescencia de amenaza de filtro de paso de banda adecuada de las celdas cargadas con CMRA para las celdas cargadas con C-M-F-D-A. Establezca la longitud de onda de excitación en 492 nanómetros y elija un filtro de paso de banda para ojos de tripsina de imagen de fluorescencia verde, y cuente las células en ambos matraces y mezcle las células rojas y verdes en una proporción de uno a uno, ajuste la concentración de células a 5 millones de células por mililitro.
Coloque una gota de 20 microlitros de suspensión celular en el centro de cada pocillo. En una placa de 24 pocillos múltiples, incube las células en una atmósfera controlada durante 20 minutos para permitir que las células se adhieran ligeramente a la superficie del pocillo en una monocapa y establezcan contactos celulares entre sí. Coloque el pocillo múltiple con células en la platina del microscopio.
Coloque los electrodos en el fondo del pozo y conéctelos al generador de pulsos Para lograr una electrofusión óptima y mantener la viabilidad de la celda, se deben utilizar parámetros adecuados de pulsos eléctricos. Estos parámetros dependen de la línea celular y deben determinarse en experimentos preliminares. Retire el medio de cultivo y lave las células con un mililitro de tampón de fosfato de potasio ISO omu a 350 microlitros de tampón de fosfato de potasio hypos Miller para inducir la hinchazón celular.
Deje las células en tampón hiperósmico durante dos minutos antes de aplicar pulsos eléctricos. Los pulsos eléctricos deben aplicarse cuando las celdas estén cerca de sus volúmenes máximos. Es decir, antes de que comiencen el volumen regulatorio.
Disminución en nuestro experimento. Se aplicó un tren de ocho pulsos rectangulares con una duración de 100 microsegundos a un hercio. Después de la entrega de pulsos.
Deje las células intactas durante 10 minutos después de 10 minutos. Rendimiento de difusión determinado mediante contraste facial y microscopio fluorescente. E adquiera tres imágenes, contraste facial, fluorescencia roja y verde en cinco campos de visión elegidos al azar.
En cada uno, cree imágenes de tres canales a partir de cada triplete de imagen en el software de imagen J para mejorar la calidad visual de las imágenes a los pasos de preprocesamiento que se pueden aplicar a las imágenes originales, el fondo, la resta y las mejoras de contraste con conjuntos de parámetros predeterminados. Finalmente, las imágenes de tres canales se componen utilizando el complemento RGB a imagen gris J. En dicha imagen, se puede ver el citoplasma en reposo junto con las membranas celulares.
Por lo tanto, se pueden determinar fácilmente pocas células en el recuento de imágenes de tres canales de los tres tipos de células, rojo, verde y dualmente fluorescente. Determine el porcentaje de células dualmente fluorescentes dividiendo el número de células dualmente fluorescentes por un número de todas las células de cada imagen. El rendimiento de fusión se define entonces como el porcentaje de células dualmente fluorescentes multiplicado por dos.
Dado que la mitad de las celdas de la vista no se detectan cuando las celdas del mismo color vistas.
Visión general
Este video demuestra la electrofusión eficiente de células in vitro utilizando un método de adherencia modificado combinado con electroporación. El proceso incluye la detección de células fusionadas mediante microscopía de fluorescencia.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Técnicas de fusión celular
- Métodos de electroporación
- Aplicaciones de microscopía de fluorescencia
Antecedentes
- La electrofusión es una técnica que aplica pulsos eléctricos para facilitar la fusión celular.
- El método puede mejorar la eficiencia de la creación de células híbridas.
- La microscopía de fluorescencia permite la visualización de células fusionadas.
- Entender la fusión celular es crucial para varias aplicaciones biológicas.
Propósito del estudio
- Demostrar un método confiable para la electrofusión de células.
- Visualizar y cuantificar la eficiencia de la fusión celular.
- Proporcionar un protocolo que pueda replicarse en otros laboratorios.
Métodos utilizados
- Se cultivaron y prepararon células de melanoma de ratón para la fusión.
- Se usaron colorantes fluorescentes para marcar las células antes de la fusión.
- Se aplicaron pulsos eléctricos para inducir la fusión celular.
- Se empleó microscopía de fluorescencia para analizar los resultados de la fusión.
Resultados principales
- Se logró una fusión celular exitosa, según lo indicado por la fluorescencia.
- Se calculó el porcentaje de células dualmente fluorescentes para determinar el rendimiento de fusión.
- Se identificaron parámetros óptimos de pulso eléctrico para la viabilidad celular.
- La calidad visual de las imágenes se mejoró mediante técnicas de procesamiento de imágenes.
Conclusiones
- El método de adherencia modificado es efectivo para la electrofusión celular.
- La microscopía de fluorescencia es una herramienta valiosa para evaluar la eficiencia de fusión.
- Este protocolo puede adaptarse para varios tipos de células en la investigación.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Cell electrofusion visualized by fluorescence microscopy provides a non-viral, non-chemical platform for generating hybrid cells, supporting early-stage biopharma research. Quantitative visualization of fusion events enables robust assessment of cell manipulation techniques, directly impacting target validation and assay development. This approach strengthens predictive confidence in cell-based workflows and informs risk-adjusted portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of cell fusion mechanisms relevant to therapeutic hypothesis testing.
- Supports functional validation of cell manipulation strategies for hybrid cell generation.
- Facilitates biological de-risking by quantifying fusion efficiency and specificity.
- Provides measurable outputs for portfolio triage and target confidence.
Screening & Assay Development
- Establishes validated cell systems for downstream screening of fusion-dependent phenotypes.
- Delivers standardized, reproducible quantification of fusion yield via dual fluorescence.
- Enables assay scalability and platform reuse for compound evaluation targeting cell fusion processes.
- Supports reliable benchmarking of fusion protocols across cell types.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational workflows by enabling generation of hybrid cells for preclinical modeling.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of cell-based therapies.
- Reduces mechanistic ambiguity in cell manipulation strategies for therapeutic development.
- Supports risk-adjusted advancement of cell fusion-based therapeutic concepts.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust cell fusion quantification and visualization, supporting both early validation and translational research.
- Discovery Biology: Quantitative fusion yield measurement supports hypothesis testing and pathway clarification.
- Screening: Dual fluorescence readouts enable reproducible assay development and benchmarking.
- Analytics: Image-based quantification provides objective, comparable outputs for condition assessment.
- Translational Research: Hybrid cell generation supports preclinical modeling and biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: The workflow is adaptable across cell types and research programs, enhancing platform value.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell fusion workflows.
- Operational Value: Standardizes fusion quantification and supports reproducibility across teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and improves capital efficiency in early-stage programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of cell-based therapeutic strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, fluorescence microscopy, and image analysis.
- Needs access to pulse generators, fluorescence microscopes, and image processing software.
- Demands cross-team standardization of labeling, imaging, and quantification protocols.
- Adaptation across cell lines may require optimization of pulse parameters and labeling conditions.
- Fusion efficiency and viability are cell line-dependent and must be empirically determined.
