Name: Recuperación Genética inversa mediada por norovirus murino Infecciosas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: Aprenda dos sistemas de genética inversa para recuperar norovirus murino infeccioso en cultivos celulares. Estos métodos permiten generar aislados genéticamente definidos para estudiar la replicación viral y patogénesis.

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Esta investigación fue financiada por una beca de Wellcome Trust Superior otorgó a Ian Goodfellow, y una beca Marie Curie Intra Europea (7PM Consejo Europeo de Investigación) otorgado a Armando Arias. Nos gustaría dar las gracias a Io Hong Cheong, la Dra. Rebecca Robey y el Dr. Mike Skinner por darnos permiso para usar su Bioanalyser Agilent y ayudar con el funcionamiento de las muestras de ARN.

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<li>Kim, Y., Thapa, M., Hua, D. H., Chang, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+nanogels+for+oral+delivery+of+interferon+for+norovirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">Biodegradable nanogels for oral delivery of interferon for norovirus infection.</a> Antiviral Res. 89, 165-173 (2011).</li>
<li>McFadden, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norovirus+Regulation+of+the+Innate+Immune+Response+and+Apoptosis+Occurs+via+the+Product+of+the+Alternative+Open+Reading+Frame+4%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Norovirus Regulation of the Innate Immune Response and Apoptosis Occurs via the Product of the Alternative Open Reading Frame 4.</a> PLoS Pathog. 7, e1002413(2011).</li>
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<li>Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calicivirus+translation+initiation+requires+an+interaction+between+VPg+and+eIF+4%5BTitle%5D)+AND+%22E.+EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Calicivirus translation initiation requires an interaction between VPg and eIF 4.</a> E. EMBO Rep. 6, 968-972 (2005).</li>
<li>Herbert, T. P., Brierley, I., Brown, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+protein+linked+to+the+genomic+and+subgenomic+mRNAs+of+feline+calicivirus+and+its+role+in+translation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of a protein linked to the genomic and subgenomic mRNAs of feline calicivirus and its role in translation.</a> J. Gen. Virol. 78 ( Pt5 ), 1033-1040 (1997).</li>
<li>Chaudhry, Y., Skinner, M. A., Goodfellow, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+genetically+defined+murine+norovirus+in+tissue+culture+by+using+a+fowlpox+virus+expressing+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Recovery of genetically defined murine norovirus in tissue culture by using a fowlpox virus expressing T7 RNA polymerase.</a> J. Gen. Virol. 88, 2091-20100 (2007).</li>
<li>Ward, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+infectious+murine+norovirus+using+pol+II-driven+expression+of+full-length+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Recovery of infectious murine norovirus using pol II-driven expression of full-length cDNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11050-11055 (2007).</li>
<li>Yunus, M. A., Chung, L. M., Chaudhry, Y., Bailey, D., Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+optimized+RNA-based+murine+norovirus+reverse+genetics+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of an optimized RNA-based murine norovirus reverse genetics system.</a> J. Virol. Methods. 169, 112-118 (2010).</li>
<li>Arias, A., Perales, C., Escarmis, C., Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+mutants+of+VPg+reveal+new+cytopathology+determinants+in+a+picornavirus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Deletion mutants of VPg reveal new cytopathology determinants in a picornavirus.</a> PLoS One. 5, e10735(2010).</li>
<li>Werf, S. vander, Bradley, J., Wimmer, E., Studier, F. W., Dunn, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+infectious+poliovirus+RNA+by+purified+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Synthesis of infectious poliovirus RNA by purified T7 RNA polymerase.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 2330-2334 (1986).</li>
<li>Bailey, D., Thackray, L. B., Goodfellow, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+amino+acid+substitution+in+the+murine+norovirus+capsid+protein+is+sufficient+for+attenuation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A single amino acid substitution in the murine norovirus capsid protein is sufficient for attenuation in vivo.</a> J. Virol. 82, 7725-7728 (2008).</li>
<li>Bailey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+RNA+structures+present+at+the+3%27+extremity+of+the+murine+norovirus+genome%3A+the+variable+polypyrimidine+tract+plays+a+role+in+viral+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of RNA structures present at the 3' extremity of the murine norovirus genome: the variable polypyrimidine tract plays a role in viral virulence.</a> J. Virol. 84, 2859-2870 (2010).</li>
</ol>

No tenemos nada que revelar.

Aquí se han puesto de manifiesto dos diferentes enfoques de genética inversa que permiten la recuperación de MNV infecciosa en cultivo celular. Ambos se aproxima efectivamente omitir el requisito absoluto para el ligamiento covalente de VPg al extremo 5 &#39;del genoma viral ARN a través de la generación de cubiertas de transcripciones MNV que luego son reconocidos por los ribosomas celulares. En la transcripción in vitro seguido por enzimáticamente nivelación es más eficiente en la recuperación de MNV infeccioso que la transcripción de los plásmidos infecciosos en las células que expresan la RNA polimerasa T7, en el que las transcripciones puede estar cubierto por las enzimas FPV de tapado. Los títulos de virus recuperados con estos sistemas de ida genética son similares a los obtenidos por transfección de virales VPg ligados ARN purificados a partir de cultivos de células infectadas 17 (Figura 5). La transfección de ARN tope MNV en células permisivas RAW264.7 hace sólo un título vírico 1-registro más bajo que los experimentos que implican la transfection de RNA total de células infectadas contienen viral VPg ligado ARN (Figura 5). Este hecho alienta investigaciones adicionales para determinar si la adición de una molécula VPg al extremo 5 &#39;de los transcritos generados por estos sistemas podrían resultar en rendimientos de virus de aumento, que pueden revelar aspectos funcionales subyacentes infectividad MNV en células asociadas a VPg. Sin embargo, consideramos que este sistema de genética inversa como una alta eficiencia comparable a la de otros virus de ARN de revertir los sistemas de la genética en la actualidad en el cual el ARN transcrito in vitro permite la recuperación de los títulos de sólo 10-100 más bajos que en las infecciones reales con viriones 19, 20. En general, las metodologías actuales constituyen un importante paso adelante en el campo de la biología molecular de los norovirus y nos proporcionan las herramientas para investigar el papel funcional de las proteínas y los motivos conservados en los genomas de ARN de norovirus. Estos enfoques han sido combinadas con cmodelo de ratón urrent disponibles y han demostrado que el MNV se recuperó de cDNA infeccioso es capaz de causar una infección letal de&gt; 80% STAT1-/ - ratones en menos de 10 días 4, 21. Haciendo uso de este sistema hemos recuperado mutantes viables norovirus murino de la proteína de la cápside y de una zona polypyrimidine implicado en la unión de los diferentes factores del huésped (PTB y PCBP) que muestran un fenotipo atenuado in vivo 21, 22. Además, recientemente se ha demostrado que los virus que carecen de la capacidad de expresar la proteína VF1 de ORF4 eficientemente replicar en cultivo celular, pero de nuevo han reducido la virulencia en ratones con respecto a WT MNV 8. Estos estudios nos animan a diseñar versiones atenuadas de los norovirus humanos basados ​​en estudios de MNV que podrían ser investigados como candidatos potenciales para la vacuna.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Cloruro de litio precipitación solución </td><td> Ambion </td><td> AM9480 </td></tr><tr><td> ARN solución de almacenamiento </td><td> Ambion </td><td> AM7000 </td></tr><tr><td> Megascript T7 secuencia de comandos </td><td> Ambion </td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> ScriptCap m7G Sistema de nivelación </td><td> Epicentro Biotecnologías </td><td> SCCE0610 </td></tr><tr><td> Sistema de transfección de neón </td><td> Invitrogen </td><td> MPK5000 </td></tr><tr><td> Transfección de neón kit de sistema de </td><td> Invitrogen </td><td> MPK1025 </td></tr><tr><td> Opti-MEM I </td><td> Invitrogen </td><td> 31985070 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 transfección reactivo </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-027 </td></tr><tr><td> Agilent ARN 600 kit de Nano </td><td> Agilent </td><td> 5067-1511 </td></tr><tr><td> Agilent 2100 bioanalyzer </td><td> Agilent </td><td> G2939AA </td></tr><tr><td> Illustra GFX PCR DNA y Gel Band Purification Kit </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9034-70 </td></tr><tr><td> RiboMAX a gran escala de ARN Sistema de Producción-T7 </td><td> Promega </td><td> P1300 </td></tr></tbody></table>

recuperación genética inversa mediada por norovirus murino infecciosas

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Norovirus humanos son responsables de la mayoría de los casos de gastroenteritis humana (GE) en todo el mundo y son un problema recurrente en los entornos en los que cerca de persona a persona de contacto no pueden ser evitados 1, 2. Durante los últimos años un aumento en la incidencia de los brotes en hospitales se ha informado, causando trastornos significativos en su capacidad operativa, así como grandes pérdidas económicas. La identificación de nuevos enfoques antivirales se ha limitado debido a la incapacidad de los norovirus humanos para completar una infección productiva en cultivo celular 3. El aislamiento reciente de un norovirus murino (MNV), estrechamente relacionado con el norovirus humanos 4, pero que se puede propagar en las células 5 ha abierto nuevas vías para la investigación de estos patógenos 6, 7. MNV resultados de replicación en la síntesis de nuevo genómico sentido positivo y moléculas de ARN subgenómico, el último de los cuales corresponde a la última thiRD del genoma viral (Figura 1). MNV contiene cuatro diferentes marcos de lectura abierta (ORF), de los cuales ORF1 ocupa la mayor parte del genoma y codifica siete proteínas no estructurales (NS1-7) liberados de un precursor de poliproteína. ORF2 y ORF3 están contenidas dentro de la región subgenómico ARN y codificar las proteínas de la cápside (VP1 y VP2, respectivamente) (Figura 1). Recientemente, hemos identificado que ORF4 adicional superposición ORF2, pero en un marco de lectura diferente es funcional y codifica para un factor de virulencia mitocondrial localizada (VF1) 8. La replicación de los virus de ARN de sentido positivo, incluyendo los norovirus, tiene lugar en el citoplasma que resulta en la síntesis de nuevos niveladas genomas de ARN. Para promover la traducción viral, los virus explotan diferentes estrategias dirigidas a la contratación de la maquinaria de síntesis proteica celular 11.9. Curiosamente, la traducción norovirus es impulsado por el multifuncional proteína viral-cebador VPgcovalentemente al extremo 5 &#39;final de ambos RNAs genómicos y subgenómico 12-14. Este mecanismo sofisticado de la traducción es probable que sea un factor importante en la eficiencia limitada de recuperación viral mediante enfoques convencionales inversa genética. Aquí mostramos dos estrategias diferentes en función de la generación de norovirus murino-1 (conocida como la presente MNV) transcripciones de un límite máximo en el extremo 5 &#39;. Uno de los métodos implica tanto en la síntesis in vitro y la nivelación de ARN viral, mientras que el segundo enfoque implica la transcripción de MNV ADNc en células que expresan la RNA polimerasa T7. La disponibilidad de estos sistemas de genética inversa para el estudio de MNV y un modelo de animal pequeño ha proporcionado una capacidad sin precedentes para diseccionar el papel de las secuencias virales en la replicación y la patogénesis de 15-17.

Los norovirus son la causa principal de gastroenteritis sin embargo, las técnicas moleculares para su caracterización son todavía relativamente nuevos. Aquí mostramos dos diferentes enfoques genética inversa para la recuperación eficiente de los norovirus murino (MNV), el único miembro de este género, que puede ser propagado en cultivos celulares.

Recuperación Genética inversa mediada por norovirus murino Infecciosas

Los norovirus humanos son responsables de la mayoría de los casos de gastroenteritis (GE) humana en todo el mundo y representan un problema recurrente en entornos donde existe un contacto cercano...

El objetivo general de este procedimiento es recuperar el virus neurovírico infeccioso utilizando dos sistemas genéticos inversos. Hola, soy Armando Arias del departamento de Virología del Imperial College de Londres. En nuestro grupo estamos interesados en analizar los mecanismos moleculares que subyacen a la replicación del neurovirus.Los norovirus son una causa importante de gastroenteritis. A nivel mundial, las técnicas moleculares avanzadas para su caracterización aún son relativamente nuevas. La identificación de nuevos enfoques antivirales y el conocimiento del ciclo vital del norovirus se han visto limitados debido a su incapacidad para completar una infección productiva en cultivo celular.El aislamiento reciente de un antiviral capaz de infectar ratones y propagarse en cultivo celular, concretamente el neurovirus espejo, ha abierto nuevas vías para la investigación de estos patógenos importantes. En este informe, demostraremos dos estrategias que permiten la generación de aislamientos de neurovirus genéticamente definidos en cultivo celular. Ambas estrategias se basan en la generación de transcritos virales con caperuza en el extremo cinco prima.El primero implica la síntesis in vitro de la caperuza del ARN viral antes de la transfección en células. El segundo enfoque consiste en la transcripción de neurovirus MI, ADNc dentro de células que expresan la ARN polimerasa T7. Descripción general del procedimiento. El protocolo para la recuperación del norovirus neuro a partir de transcritos de ARN con caperuza se inicia mediante la linealización.El plásmido que contiene MV CD NA para mmv uno. Esto se realiza con la enzima de restricción NHE uno. El ADN se transcribe luego in vitro en ARN utilizando la ARN polimerasa T siete.Posteriormente, el ARN de M-M-V-R-N-A se capa in vitro y se transfecta en células para permitir la recuperación de MNV infeccioso. Para la recuperación directa de MNV infeccioso utilizando el virus FAL PX que expresa la ARN polimerasa T siete, con el fin de recuperar MMV a partir de clones de ADNc transfectados directamente, primero se infectan las células con un virus FAL PX recombinante que expresa la ARN polimerasa T siete. La infección con FAL PX dará lugar a la expresión de la ARN polimerasa T siete, así como de enzimas virales de encapuchado de ARN que podrían encapuchar parte del ARN sintetizado. Luego, el ADNc de M-M-V se transfecta en las células infectadas con FPV mediante transfección mediada por lípidos. La ARN polimerasa T siete produce entonces el ARN de M-M-V-R-N-A, parte del cual podría ser encapuchado por el sistema de encapuchado de ARN de FPV.Una secuencia ribozimática garantiza que cada transcripción de ARN contenga un extremo tres prima definido. Los transcritos de MMV con caperuza luego se traducirán en proteína antes de la replicación, lo que conduce a la producción de nuevas partículas infecciosas. Protocolo para la transcripción de ARN y adición de caperuza para el aislamiento de transcritos de MMV infecciosos y síntesis de transcritos de MMV infecciosos con caperuza.En primer lugar, mezcle los siguientes reactivos: tampón de transcripción, nucleótidos, agua y plásmido linealizado que contenga el M-M-V-C-D-N-A. Luego añada ARN y ARN polimerasa T7 a la mezcla de reacción. Existen muchos kits comerciales disponibles para este fin, que proporcionan un método reproducible para la síntesis de ARN.La reacción de transcripción se lleva a cabo incubando la mezcla a 37 grados Celsius durante al menos dos horas. Analice una pequeña alícuota de esta reacción de transcripción en un gel de agarosa no desnaturalizante. Primero, limpie el equipo para geles con el detergente y enjuague con agua libre de RNAsas antes de usarlo.Asegúrese de que los geles de agarosa se preparen utilizando reactivos libres de RNasas. El M-V-R-N-A migrará aproximadamente a tres pares de bases en un gel de agarosa no desnaturalizante. Además, se puede utilizar un bioanalizador Agilent para proporcionar un método rápido de análisis de la integridad del ARN.El ARN debe purificarse luego para eliminar los nucleótidos no incorporados. Existen muchos métodos disponibles; sin embargo, en este protocolo, purificamos el ARN mediante precipitación con cloruro de litio como una alternativa rentable que precipita el ARN por centrifugación a velocidad máxima durante 15 minutos. Retire el sobrenadante teniendo cuidado de no perturbar el precipitado translúcido y lávelo usando etanol al 70%.Re-suspender el ARN mensajero MMV en solución de almacenamiento de ARN y asegurarse de que se disuelva completamente. Calentar el ARN a 65 grados C puede facilitar este proceso posteriormente. Cuantificar el ARN mediante espectrometría.Analice la integridad del ARN mediante la electroforesis de una pequeña alícuota en un gel de agarosa al 1% no desnaturalizante. Como puede observarse, la integridad del ARN después de la precipitación con cloruro de litio debería mantenerse igual para mejorar la eficiencia de la caperuza. Incube una alícuota del ARN a 65 grados durante 10 minutos.Coloque el tubo inmediatamente en hielo. Para evitar la degradación o el plegamiento nuevamente, prepare una mezcla de reacción de capping según lo sugerido por el fabricante. Normalmente agregamos alrededor de 60 microgramos de M-N-V-R-N-A a una reacción final de 100 microlitros.Aunque la reacción se puede reducir, mezcle bien e incube a 37 grados durante una hora, purifique el ARN mediante precipitación con cloruro de litio como antes. Es esencial verificar nuevamente la integridad del ARN antes de proceder con la transfección. Protocolo por pasos para la recuperación de MMV mediante electrotransferencia de ARN en células crudas. Resus.Suspenda el matraz con células crudas en DMEM. Asegúrese de formar una suspensión de células individuales. Determine la concentración de células viables en un hemocitómetro utilizando la exclusión con azul de tripano.Centrifugar las células y resuspender cuidadosamente. Suspenderlas en alícuotas de medio fresco sin antibióticos, 8 millones de células por transfección, y centrifugarlas en un microcentrífugo. Eliminar el medio y lavar las células con 500 microlitros de PBS, centrifugar nuevamente y eliminar el PBS. Resuspender las células en 130 microlitros a temperatura ambiente.Solución de suspensión de resucitación Neon. Añada la cantidad adecuada de ARN con caperuza, típicamente 1,3 microgramos por 130 microlitros de células, equivalente a un microgramo de ARN por 6 millones de células. Las células mezcladas con los transcritos se recogen en la punta de transfección Neon de 100 microlitros.Se debe tener mucho cuidado para no introducir burbujas en esta etapa. Luego, electro porar utilizando un solo pulso de 1700 voltios durante 25 milisegundos. Recuperar las células en un tubo eppendorf que contenga un mililitro de medio sin antibiótico.Distribuya las células del tubo en pozos independientes que contengan DMEM sin antibiótico con 10 % de FCS e incube las células a 37 grados durante 24 a 72 horas. La recuperación de MMV mediante lipotransfección de ARN en células BSR T siete se realiza como antes. Los transcritos de MMV se generan mediante la LINEARIZACIÓN del plásmido MMV CD nna y la transcripción in vitro con la polimerasa T siete, seguida de la capsulación in vitro; luego, los transcritos se lipotransfectan en células BS RT siete. La tripsinización se realiza en una monocapa de células bsrt siete y se siembran 7,5 veces 10 a la cinco células viables en placas de seis pocillos.Incube las células a 37 grados durante la noche. Retire el medio de las células y sustitúyalo con tres mililitros de medio fresco sin antibióticos. Para asegurar la máxima eficiencia de la transfección, mezcle uno a dos microgramos de ARNM-M-V-R con 100 microlitros de óptimo.Además, mezcle cuatro microlitros de lipectomía 2000 con 100 microlitros de óptimo. Combine las muestras que contienen ARN y lipectomía y mézclelas completamente pipeteando arriba y abajo 15 veces. Deje la mezcla a temperatura ambiente durante 20 minutos.Luego, agregue los complejos de transfección que contienen transcritos MMV con caperuza de forma gota a gota a la monocapa celular. Agite la placa en direcciones perpendiculares. Incube las células durante 24 a setenta y dos horas.Protocolo para la recuperación directa de MMV infeccioso a partir de ADNc en células que expresan la ARN polimerasa T7, tal como se describió anteriormente. Este protocolo se basa en la expresión de la ARN polimerasa T7 y de las enzimas de capping viral oxx en células infectadas por un virus auxiliar oxx. Luego, se transfecta M-N-V-C-D-N-A bajo el control de un promotor T7 en las células.En primer lugar, retire el medio de cultivo celular y añada a cada pocillo 700 microlitros de virus F pox diluido en medio sin antibióticos. Generalmente se utiliza una multiplicidad de infección de aproximadamente 0,5 PFU por célula; coloque las placas perpendicularmente e incube durante una hora a 37 grados. Posteriormente, añada dos porciones de medio sin antibióticos e incube las células durante una hora adicional a 37 grados para permitir la expresión de la ARN polimerasa T siete. Tras la transfección de MNV CG NNA, retire el medio de las células infectadas y añada tres mililitros de medio fresco sin antibióticos.Prepare una mezcla de un microgramo de M-M-V-C-D-N-A y lipectomía como se explicó en la sección anterior. Mezcle bien moviendo hacia arriba y hacia abajo. Mantenga el tubo a temperatura ambiente durante 20 minutos, luego vuelva a mezclar y agregue gotas a la monocapa celular.Agite suavemente la placa en direcciones perpendiculares. Incube las células a 37 grados durante 24 a 72 horas para confirmar la recuperación del MMV infeccioso mediante los diferentes enfoques de genética inversa mostrados en el transcurso de esta publicación de video, que libera variante infecciosa de las células mediante congelación y descongelación repetidas. Determine en cada muestra mediante procedimientos estándar, como la prueba de TCID 50 o el ensayo de placas, los resultados representativos.La disponibilidad de estos sistemas de genética inversa para estudiar el mi Neurovirus ha proporcionado una capacidad sin precedentes para analizar el papel de las secuencias virales en la replicación y la patogénesis del neurovirus en el huésped natural. Ambos enfoques de genética inversa explicados en este video son altamente eficientes para el aislamiento de neurovirus infecciosos en cultivo celular. Como se muestra en esta figura.Se recuperan MMV infecciosos, cuyo título supera 10 a la cinco TCID 50 por mil, tras la transfección de transcritos de MMV con caperuza en células RAW o en células BSRT7. La transfección de MMV-ADN en células BSRT7 previamente infectadas con ayuda del virus de la leucosis aviaria produce títulos virales que superan 10 a la cuatro TCID 50 por mil. Los títulos virales obtenidos mediante enfoques de genética inversa son similares a los recuperados tras transfección con ARN aislado de virus infeccioso, lo que destaca la alta eficiencia de los sistemas de genética inversa descritos aquí.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Un One-Step RT-PCR para la detección e identificación genogrupo de los aislamientos de Norovirus en las heces de los niños, que utiliza cebadores y sondas TaqMan específicas para el marco de lectura abierto 1 (ORF1)-ORF2 región de la unión, la región más conservada del genoma del norovirus es descrito. Un no-comercial, rentable método de extracción de ARN se detalla.

Detección y Genogrouping de norovirus en las heces de los niños por TaqMan en un solo paso RT-PCR

A la inversa sistema de genética de la cepa del virus de la fiebre del Valle del Rift MP-12 vacuna es una herramienta útil para la creación de nuevas MP-12 mutantes con mayor atenuación e inmunogenicidad. Se describe el protocolo para la generación y caracterización de cepas mutantes Sociedades Nacionales.

Mediante genética inversa para manipular el gen de Sociedades Nacionales del virus de la fiebre de Rift Valley MP-12 Cepa para mejorar la seguridad de la vacuna y la eficacia

Aquí se describe un método para cuantificar las partículas infecciosas de norovirus murino (MNV), que es el norovirus que sólo se replica de manera eficiente en cultivo celular. El ensayo de placa se aprovecha de MNV tropismo para macrófagos murinos y puede ser adaptado para su uso con muestras biológicas o ambientales que contienen MNV.

Placa de Ensayo para Norovirus murino

Fuente: Leuthold, M. M., et al. Producción de dominios sobresalientes de norovirus humanos en E. coli para cristalografía de rayos X. J. Vis. Exp. (2016).Este video demuestra la purificación del dominio P del norovirus humano recombinante mediante cromatografía de exclusión por tamaño, destacando la separación de la proteína diana de las impurezas de mayor y menor peso molecular en función de la accesibilidad diferencial de los poros. El proceso se monitorea mediante absorbancia UV y se...

Purificación de proteínas de dominio P recombinantes derivadas de bacterias de norovirus humanos

Source: Philip, A. A., et al. Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the recovery of recombinant rotavirus by transfecting plasmids encoding viral genome segments into hamster kidney cells, followed by amplification in monkey epithelial cells, enabling studies of rotavirus biology, replication, and vaccine development.

Plasmid-Mediated Generation of Recombinant Rotavirus in Cultured Cells

Rescate de arenavirus recombinantes a partir de ADNc clonado, un enfoque conocido como la genética inversa, permite a los investigadores estudiar la función de los productos específicos de genes virales, así como la contribución de los diferentes dominios y residuos específicos, a diferentes aspectos de la biología de los arenavirus . Del mismo modo, las técnicas de genética inversa en líneas celulares aprobados por la FDA (Vero) para el desarrollo de vacunas ofrece nuevas posibilidades para la...

Generación de Arenavirus recombinante para el Desarrollo de Vacunas de la FDA aprobados células Vero

Virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) se ha estudiado ampliamente en los últimos años con el fin de desarrollar nuevos vectores para la vacunación y la terapia, entre otros. Estos estudios han sido posible debido a las técnicas para rescatar virus recombinante a partir de cDNA, tales como las que se describen aquí.

Rescate del virus de la enfermedad de Newcastle recombinante a partir de cDNA

Aquí presentamos un procedimiento para cuantificar enterovirus y norovirus en aguas ambientales y potables utilizando PCR cuantitativa con transcripción inversa. La recuperación media del virus de las aguas subterráneas con este procedimiento estandarizado del Método 1615 de la EPA fue del 20% para el poliovirus y del 30% para el norovirus murino.

Método EPA 1615. La medición de enterovirus y norovirus Ocurrencia en agua por cultura y RT-qPCR. Parte III. Detección de virus por RT-qPCR

Métodos de detección de rutina utilizando amplificación del genoma viral están limitados por su incapacidad para discriminar infecciosas de partículas no infecciosas. El propósito de este artículo es proporcionar protocolos detallados para métodos alternativos facilitar la discriminación de las partículas infecciosas norovirus con aptámeros vinculante, dispersión dinámica de luz y microscopía electrónica de transmisión.

Métodos alternativos In Vitro para la determinación de la integridad estructural de la cápside Viral

La generación de rotavirus recombinantes a partir del ADN plásmido proporciona una herramienta esencial para el estudio de la replicación del rotavirus y la patogénesis, y el desarrollo de vectores de expresión de rotavirus y vacunas. En este documento, describimos un enfoque de genética inversa simplificado para generar rotavirus recombinantes, incluyendo cepas que expresan proteínas fluorescentes de reportero.

Método de Genética Inversa Simplificada para Recuperar Rotavirus Recombinantes Expresando Proteínas Reportero

El objetivo de este protocolo es cuantificar la unión del norovirus humano del patógeno eucariota a las bacterias. Después de realizar un ensayo inicial de apego a la bacteria del virus, la citometría de flujo se utiliza para detectar bacterias ligadas viralmente dentro de la población.

Cuantificación de partículas similares al virus del norovirus humanos que se unen a bacterias comensales mediante citometría de flujo

Aprenda dos sistemas de genética inversa para recuperar norovirus murino infeccioso en cultivos celulares. Estos métodos permiten generar aislados genéticamente definidos para estudiar la replicación viral y patogénesis.

Recuperación Genética inversa mediada por norovirus murino Infecciosas

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