Recuperación Genética inversa mediada por norovirus murino Infecciosas

El objetivo general de este procedimiento es recuperar el neurovirus infeccioso mu eye utilizando dos sistemas genéticos inversos. Hola, soy Armando Arias de la sección de Virología del Imperial College of London. En nuestro grupo, estamos interesados en diseccionar los mecanismos moleculares subyacentes a la replicación de neurovirus.

Los norovirus son una de las principales causas de gastroenteritis. Las técnicas de chorro molecular a nivel mundial para su caracterización son todavía relativamente nuevas. La identificación de enfoques neovirales y los conocimientos sobre el ciclo de vida de los neurovirus han sido limitados debido a su incapacidad para completar una infección productiva en cultivo celular.

El reciente aislamiento de un antiviral capaz de infectar ratones y propagar cultivos celulares, a saber, el neurovirus espejo, ha abierto nuevas vías para la investigación de estos importantes patógenos. En este informe, demostraremos dos estrategias que permiten la generación de aislados de neurovirus genéticamente definidos en cultivo celular. Ambas estrategias se basan en la generación de transcripciones virales con un límite de cinco puntos primos.

La primera consiste en la síntesis in vitro del ARN viral antes de su transfección en las células. El segundo enfoque implica la transcripción de MI neuro vial, CDNA dentro de las células que expresan T siete ARN polimerasa Descripción general del procedimiento. El protocolo para la recuperación de neuro norovirus a partir de transcripciones de ARN tapadas se inicia mediante aumento lineal.

El plásmido que contiene MV CD NA para mmv one. Esto se hace con la enzima de restricción NHE one. A continuación, el ADN se transcribe in vitro en ARN utilizando la ARN polimerasa T 7.

Posteriormente, el M-M-V-R-N-A se tapa in vitro y se transfecta en las células para permitir la recuperación de la MMV infecciosa recuperación directa del MNV infeccioso utilizando el virus FAL PX que expresa la ARN polimerasa T siete para la recuperación de MMV de clones de ADNc transfectados directamente, las células se infectan primero con un virus FAL PX recombinante que expresa la ARN polimerasa T siete La infección por FAL PX dará lugar a la expresión de la ARN polimerasa T siete, así como el ARN viral enzimas que pueden tapar parte del ARN sintetizado. A continuación, el M-M-V-C-D-N-A se transfecta en las células infectadas por FPV mediante transfección mediada por lípidos. La ARN polimerasa T seven produce entonces la M-M-V-R-N-A, parte de la cual puede ser taponada por la maquinaria de taponado F-P-V-R-N-A.

Una secuencia de ribozima garantiza que cada transcripción de ARN contiene tres extremos primos definidos. Las transcripciones de MMV se traducirán en proteínas antes de la replicación, lo que conducirá a la producción de nuevas partículas infecciosas. Protocolo de transcripción y taponamiento de ARN para la recuperación de la síntesis de MMV infeccioso de transcripciones de MMV tapadas infecciosas.

En primer lugar, mezcle los siguientes reactivos, transcripción, nucleótidos tampón, agua y plásmido linealizado que contiene el M-M-V-C-D-N-A. A continuación, añada ARN y ARN polimerasa T siete a la mezcla de reacción. Hay muchos kits comerciales disponibles para este propósito y proporcionan un método reproducible para la síntesis de ARN.

La reacción de transcripción se lleva a cabo incubando la mezcla a 37 grados centígrados durante al menos dos horas. Analice un pequeño fragmento de esta reacción de transcripción en un gel agros no desnaturalizante. Primero, limpie el equipo de gel con el detergente y lave con agua libre de ARN antes de usarlo.

Asegúrese de que los geles agros se preparen utilizando reactivos libres de ARN. M-V-R-N-A funcionará en aproximadamente tres bases asesinas en un gel de rosa agrícola no desnaturalizante. Además, se puede utilizar un bioanalizador Agilent para proporcionar un método rápido de análisis de la integridad del ARN.

A continuación, el ARN debe purificarse para eliminar los nucleótidos no incorporados. Hay muchos métodos disponibles, sin embargo, en este protocolo, purificamos el ARN por precipitación de cloruro de litio como una alternativa rentable que granula el ARN por centrifugación a máxima velocidad durante 15 minutos. Retire el sobrenadante teniendo cuidado de no alterar el pellet translúcido y lave con etanol al 70%.

Vuelva a suspender la transcripción de MMV en la solución de almacenamiento de ARN y asegúrese de que se disuelva por completo. Calentar el ARN a 65 grados C puede ayudar a este proceso más adelante. Cuantificar el ARN por espectrometría.

Analice la integridad del ARN ejecutando una pequeña alícuota en un gel agros no desnaturalizante al 1%. Como puede ver, la integridad del ARN después de la precipitación de cloruro de litio debe permanecer igual para mejorar la eficiencia del taponamiento. Calentar una alícuota del ARN a 65 grados durante 10 minutos.

Coloque el tubo inmediatamente sobre hielo. Para evitar la degradación o el repliegue, prepare una mezcla de reacción de taponado según lo sugerido por el fabricante. Por lo general, agregamos alrededor de 60 microgramos de M-N-V-R-N-A a una reacción final de 100 microlitros.

Aunque la reacción se puede reducir, mezclar completamente e incubar a 37 grados durante una hora, purifique el ARN mediante precipitación de cloruro de litio como antes. Es esencial volver a comprobar la integridad del ARN antes de proceder a la transfección. Protocolo escalonado para la recuperación de MMV por electroporación de ARN en células crudas. Resus.

Suspenda el matraz de células crudas en DMEM. Asegúrese de formar una suspensión de una sola celda. Determine la concentración de células viables en un hemocitómetro utilizando la exclusión de azul de triano.

Pellet las células y resus. Suspenderlos en medios frescos libres de antibióticos alícuotas de 8 millones de células por transfección y pelletizarlos en un micro fuge. Retire el medio y lave las celdas en 500 microlitros de centrífuga PBS nuevamente y retire el PBS, vuelva a suspender las celdas a 130 microlitros de temperatura ambiente.

Solución de suspensión Neon Resus. Agregue la cantidad adecuada de ARN tapado, generalmente 1,3 microgramos por 130 microlitros de células, lo que equivale a un microgramo de ARN por cada 6 millones de células. Las células mezcladas con transcripciones se recogen en la punta de transfección de neón de 100 microlitros.

Se debe tener mucho cuidado de no introducir burbujas en esta etapa. A continuación, el electro funciona con un solo pulso a 1700 voltios durante 25 milisegundos. Libere las células en un tubo de orph final que contenga una milésima de pulgada de medios libres de antibióticos.

Distribuya las células del tubo en pocillos independientes que contengan DMEM libre de antibióticos con 10% de FCS, incube las células a 37 grados durante 24 a 72 horas. Recuperación de MMV por perfección labial de ARN en células BSR T siete como antes, las transcripciones de MMV se generan por MMV, CD, nna plásmido, LINEARIZACIÓN, T siete polimerasa, transcripción in vitro y transcripciones in vitro de taponamiento se ven afectadas por el labio en células BS RT siete. La tripsina es una monocapa de bsrt siete células y siembra 7,5 veces 10 a las cinco células viables en placas de seis pocillos.

Incuba las células a 37 grados durante la noche. Retire el medio de las células y reemplácelo con tres milésimas de pulgada de medio fresco que carezca de antibióticos. Para garantizar la máxima eficiencia de la transfección, mezcle uno o dos microgramos de M-M-V-R-N-A tapado con 100 microlitros de óptimo.

Mezclar también cuatro microlitros de lipectomía 2000 con 100 microlitros de optimum. Combine las muestras que contienen ARN y lipectomía y mézclelas bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo 15 veces. Deja la mezcla a temperatura ambiente durante 20 minutos.

A continuación, añada los complejos de transfección que contienen transcripciones de MMV tapadas a la monocapa celular. Agite el plato en direcciones perpendiculares. Incubar las células durante 24 a siete dos horas.

Protocolo para la recuperación directa de MMV infeccioso a partir de CDNA en células que expresan T siete ARN polimerasa como se describió anteriormente. Este protocolo se basa en la expresión de la ARN polimerasa T seven y las enzimas de recubrimiento viral oxx en células infectadas con la ayuda del virus oxx. M-N-V-C-D-N-A bajo el control de un promotor T seven se transfecta a las células.

En primer lugar, retire los medios de cultivo celular y añada a cada pocillo 700 microlitros de virus de la viruela F diluidos en medios libres de antibióticos. Generalmente se utiliza una multiplicidad de infección de alrededor de 0,5 PFU por célula, dar forma a las placas perpendicularmente e incubar durante una hora a 37 grados. Después. Agregue dos comidas de medios libres de antibióticos e incube las células durante una hora adicional a 37 grados para permitir la transfección de la expresión de la ARN polimerasa MNV CG NNA T, retire los medios de las células infectadas y agregue tres molinos de medios frescos sin antibióticos.

Prepare una mezcla de un microgramo de M-M-V-C-D-N-A y lipectomía como se explicó en la sección anterior. Mezcle bien preparando hacia arriba y hacia abajo. Mantenga el tubo a temperatura ambiente durante 20 minutos, luego mezcle nuevamente y agregue pasteles de gotas a la monocapa de celda.

Agite el plato suavemente en direcciones perpendiculares. Incubar las células a 37 grados durante 24 a 72 horas para confirmar la recuperación de MMV infeccioso mediante los diferentes enfoques de genética inversa que se muestran en el curso de este video para liberar varión infeccioso de las células mediante congelación y descongelación repetida. Determine el en cada muestra mediante procedimientos estándar como TCID 50 o resultados representativos del ensayo de placa.

La disponibilidad de estos sistemas genéticos inversos para estudiar mi neurovirus ha proporcionado una capacidad sin precedentes para diseccionar el papel de las secuencias virales en la replicación y patogénesis del neurovirus en el huésped natural. Ambos enfoques de genética inversa explicados en este video son altamente eficientes para la recuperación de neurovirus infecciosos y neurovirus y cultivos celulares. Como se muestra en esta figura.

MMV infeccioso, el título es superior a 10 a los cinco TCID 50 por mil se recuperan después de la transfección de las transcripciones de MM V tapadas en células crudas o BS RT siete células. La transfección de MM V-C-D-N-A en siete células BSRT previamente infectadas con la ayuda del virus de los pop asquerosos da como resultado títulos virales superiores a 10 a los cuatro TCID 50 por mil. Los títulos virales obtenidos por enfoques de genética inversa son similares a Titus rescatados en transfect con ARN, aislado de virus infecciosos, lo que pone de manifiesto la alta eficiencia de los sistemas genéticos inversos aquí descritos.