Name: Ex cultivo in vivo de la Plenaria, los cerebros en desarrollo de Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Aprende a cultivar cerebros de Drosophila ex vivo para estudiar el desarrollo del cuerpo pedunculado. Esta técnica permite analizar con alta resolución los procesos de desarrollo neuronal y evaluar tratamientos farmacológicos.

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Nos gustaría dar las gracias a todos los miembros de nuestro laboratorio para sus consejos, las discusiones y comentarios útiles sobre el manuscrito. También nos gusta especialmente dar las gracias a Marta Koch y Hassan Bassem para la excelente sugerencia que esperar hasta 1,5 horas antes de la disección de los cerebros de la APF para el cultivo en los experimentos de remodelación. Agradecemos también a la instalación de imágenes de NHGRI para el uso de su microscopio confocal. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Neurociencia Básica del Programa de Investigación Intramural del NINDS, NIH (Z01 NS003106).

A. Preparación de los medios <ol><li> Preparar medios completos por filtración esterilizante Drosophila Schneider medio suplementado con suero fetal bovino al 10% y 1% de penicilina / estreptomicina. </li><li> Medios de comunicación deben estar preparados frescos cada vez. Alternativamente, una parte alícuota de la pre-congelados medios de comunicación pueden ser descongelado antes de cada uso. </li><li> Antes de cultivo, añadir 10 g / ml de insulina y 2 g / ml ecdisona a los medios. Los fármacos se preparó como poblaciones concentradas y se congelaron en alícuotas pequeñas. Alícuotas descongeladas no volver a congelar. </li><li> Todas las soluciones de trabajo debe mantenerse a 25 ° C. </li></ol> El cultivo de los cerebros de larvas 1. La selección y la disección de los cerebros de larvas <ol><li> Añadir 500 l de medios de comunicación para una inserción de 12 mm de la cultura Millicell celular. Los cerebros disecados se coloca en estos insertos para facilitar inmunotinción fácil. </li><li> Añadir una pequeña cantidad de medios preparados para un vidrio de reloj disección. </li><li> Ucantar una pequeña espátula, recoger las larvas de tercer estadio vagando y colocarlos en el vidrio de reloj. (Suponemos que el método in vivo la cultura franco se aplicará igualmente a las larvas primero o segundo, pero no he probado esto.) </li><li> Manteniendo el extremo posterior de la larva con un par de pinzas, cuidadosamente abrir el extremo anterior con un segundo par de pinzas # 5. </li><li> Rápidamente diseccionar el cerebro, manteniendo el cordón nervioso ventral intacto. </li></ol> 2. Ex cultivo in vivo de los cerebros disecados larvarias <ol><li> Uso de pre-húmedas puntas de pipeta, transferir el cerebro con cuidado en los insertos de cultivo celular, pre-llenado con los medios de comunicación. </li><li> Cerebros de transferencia, en los medios, a una incubadora a 25 ° C hasta el deseado punto de tiempo que se alcanza. Este método funciona de manera eficiente para un máximo de 48 horas en la cultura. </li><li> Vuelva a colocar los medios de comunicación a las 8 horas. Más allá de eso, reemplazar la mitad de los medios de comunicación cada 5-6 horas. </li></ol> 3. La manipulación farmacológica deLos cerebros de larvas Este método de cultivo ex vivo puede ser utilizado para corroborar farmacológicamente interacciones genéticas demostrado previamente en nuestro laboratorio 1. <ol><li> Añadir 100 roscovitina mM y 100 mM olomoucina a los medios preparados. </li><li> Transferencia de cerebros disecados a este medio. </li><li> Los cerebros de Cultura a 25 ° C durante 24 horas. </li><li> Vuelva a colocar los medios de comunicación a las 8 horas. Más allá de eso, reemplazar la mitad de los medios de comunicación (con medicamentos) cada 5-6 horas. </li></ol> El cultivo de los cerebros de pupas 1. Selección de las pupas de Disección <ol><li> Marcar pupas blancas en las botellas y frascos. </li><li> Sólo elija pupas que son completamente blancos. Las pupas con cualquier tipo de color no deben ser incluidos. </li><li> Esta etapa es de 0 horas después de la formación Pupario (APF). </li><li> Estas pupas estará listo para la disección de 1,5 horas después de marcar. Este paso es crucial para garantizar que la poda de desarrollo se produce en ex vivo </em&gt; cultura. </li></ol> 2. La disección de las pupas <ol><li> Añadir 500 l de medios de comunicación para una inserción de 12 mm de la cultura Millicell celular. (Los cerebros disecados se coloca en estos insertos para facilitar inmunotinción fácil). </li><li> Una vez que el deseado punto de tiempo se ha alcanzado, añadir una pequeña cantidad de medios preparados para un vidrio de reloj disección. </li><li> Usando una espátula pequeña, húmeda, recoger las pupas previamente marcada para la disección y colocarlos en el vidrio de reloj. </li><li> Manteniendo el extremo posterior de las pupas con un par de pinzas, abra cuidadosamente el extremo anterior del caso pupa con un segundo par de pinzas # 5. </li><li> Rápidamente diseccionar el cerebro, manteniendo el cordón nervioso ventral intacto y unido. </li></ol> 3. Ex cultivo in vivo de los cerebros disecados pupas <ol><li> Transferir el cerebro con cuidado en los insertos de cultivo celular, pre-llenado con los medios de comunicación. </li><li> Cerebros de transferencia, en los medios, a una incubadora a 25 ° C hasta el deseado tiempo point se alcanza. Se utilizó este método para hasta 10 horas en cultivo para el experimento se muestra, pero puede extenderse a más largos períodos de observación y tratamiento, si es necesario. </li><li> Para los puntos de tiempo de más de 8 horas APF, sustituir los medios de comunicación cada 5-6 horas. </li></ol> Partir de este paso, el protocolo se mantiene sin cambios, tanto para las larvas y pupas. B. Fijación de cerebros disecados <ol><li> Una vez que el deseado punto de tiempo se alcanza, separa el medio y añadir 500 l de formaldehído al 4% en PBS 1x con 0,5% de Triton X-100 (PBST) durante 30 minutos, reemplazando con formaldehído fresco después de 15 minutos. </li><li> Asegúrese de no permitir que se seque el cerebro al reemplazar los medios de comunicación con el fijador. </li><li> Lavar formaldehído con cuatro lavados de 10 minutos de 1x PBS con 0,5% TritonX-100 (PBST). </li></ol> C. La tinción cerebros fijos <ol><li> Después de formaldehído ha sido lavada, bloquear cerebros durante 1 hora en una solución de bloqueo de 1x PBS con un 1% normalSuero de cabra y 1% de seroalbúmina bovina. </li><li> Añadir anticuerpos primarios formados en solución de bloqueo. </li><li> Los cerebros de incubar durante la noche a 4 ° C. </li><li> A la mañana siguiente, lave los anticuerpos primarios con cuatro lavados de 10 minutos de PBST. </li><li> Añadir secundaria de anticuerpos formados en solución de bloqueo. </li><li> Dejar a temperatura ambiente durante 4 horas. </li><li> Lavar la zona secundaria de anticuerpos con cuatro lavados de 10 minutos de PBST. </li></ol> D. Montaje de cerebros fijados y teñidos de Microscopía <ol><li> Equilibre los cerebros de los medios de comunicación Vectashield montaje durante 1 hora. </li><li> Monte cerebro en portaobjetos de vidrio que utilizan los medios de comunicación Vectashield montaje. </li><li> Coloque los chips de vidrio a cada lado de los cerebros antes de montar el cubreobjetos. Esto evita que los cerebros de ser aplastado, mientras se mantiene la muestra lo suficientemente delgada como para analizar todos los planos focales con un microscopio confocal. Los cerebros fueron más o menos orientada al montaje para facilitar su lectura las características de interés. Cuando sea necesario,imágenes del cerebro fueron rotados con el software de Imaris para proporcionar una visión óptima de la documentación y la medición. </li><li> Selle cubreobjetos con esmalte de uñas transparente. </li><li> Tienda desliza lejos de la luz. </li></ol> E. Representante Resultados La Figura 1 muestra un panel de tercer estadio larval de cerebros (A) de tipo salvaje moscas y (B) las moscas que expresan un derivado dominante negativo de Cdk5 (Cdk5DN) (Connell-Crowley et al., 2000). Ambos expresan la actina-GFP (verde) en las neuronas gamma MB. Como se ha descrito previamente (Trunova et al., 2011), hay una región en los axones proximales de las neuronas gamma de tipo salvaje que falla para acumular actina-GFP, mostrando así como una &quot;zona clara&quot; (A, soporte), y fasciclin dos proteínas (rojo) se acumula en los axones sólo hasta el borde ventral de la zona (línea horizontal blanca). La línea de puntos en el tercer panel de la Figura 1 (A) indica la posición de la MB, destacando el actoen la &quot;zona libre&quot; y su borde ventral. En las moscas que expresan Cdk5DN, la zona de actina claro está ausente (B) y fasciclin 2 (FasII) inmunoreactividad extiende dorsalmente a través de esa región. (Tenga en cuenta que un número variable de FasII positivo del proyecto axones horizontal a través de la MB, estos no son relevantes para el fenotipo). Barra de escala representa a 20 micras. Utilizando el método de cultivo ex vivo, que tratan de tipo salvaje moscas con una combinación de roscovitina y olomoucina, inhibidores farmacológicos de Cdk5 actividad. Figura 2 muestra un panel de tercer estadio larval cerebros de control (A) y tratados con el fármaco (B ) de tipo salvaje moscas. Al igual que las moscas que expresan una dominante negativa Cdk5 construcción, los cerebros tratados con inhibidores de la Cdk5 durante 24 horas, muestran la pérdida de característica de la zona de actina clara y cambio en los límites FasII (entre corchetes). Las líneas blancas muestran la posición de tipo salvaje frontera FasII. Barra de escala representa a 20 micras. FiguRe 3 muestra una serie representativa de los organismos de hongos Drosophila de 0-10 horas de la APF, marcado con la membrana objetivo mCD8-GFP (verde). Los paréntesis indican el cáliz, es decir, las proyecciones dendríticas de la MB. Antes de la metamorfosis, se puede ver axones MB cursan dorsoventral en haces gruesos, así como una &quot;neblina &#39;de señal fluorescente resultante de la dendrítica denso eje (soporte). Panel A muestra cerebros disecados en el momento indicado. Tenga en cuenta la poda de las dendritas en la región indicada por los soportes, de tal manera que por 6-8 hrs APF, la bruma de la señal dendríticas se ha ido (aunque la señal no se ve afectada axonal). Cerebros en el panel B fueron disecados a las 0 horas APF, antes de que el alza interna de la ecdisona (Truman y Riddiford, 2002), y cultivadas ex vivo como se indica. Estos no muestran la poda en el desarrollo de las dendritas, sino la señal dendríticas persiste durante 10 horas APF. Para evitar esto, las pupas se marcan a 0 APF horas, pero disecado de 1,5 horas APF y culta. Panell C muestra una serie representativa de estos cuerpos seta de Drosophila APF 0-10 horas. Al igual que en las muestras no cultivadas, la señal dendrítica es indetectable por 8 horas APF. Barra de escala representa a 20 micras.

<ol><li>Trunova, S., Baek, B., Giniger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdk5+regulates+the+size+of+an+axon+initial+segment-like+compartment+in+mushroom+body+neurons+of+the+Drosophila+central+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cdk5 regulates the size of an axon initial segment-like compartment in mushroom body neurons of the Drosophila central brain.</a> J. Neurosci. 31 (29), 10451-10462 (2011).</li>
<li>Nakada, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+anchored+proteins+forms+membrane+diffusion+barriers+during+neuronal+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization.</a> Nat. Cell Biol. 5 (7), 626-632 (2003).</li>
<li>Schmid, G., Strosznajder, J. B., Wesierska-Gadek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+the+p53+tumor+suppressor+protein+family+and+Cdk5%3A+novel+therapeutic+approaches+for+the+treatment+of+neurodegenerative+disease+using+selective+Cdk+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Interplay between the p53 tumor suppressor protein family and Cdk5: novel therapeutic approaches for the treatment of neurodegenerative disease using selective Cdk inhibitors.</a> Mol Neurobiol. 34 (1), 27-50 (2006).</li>
<li>Kahsai, L., Zars, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+and+memory+in+Drosophila%3A+behavior%2C+genetics%2C+and+neural+system%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Learning and memory in Drosophila: behavior, genetics, and neural system.</a> Int. Rev. Neurobiol. 99, 139-167 (2011).</li>
<li>Lee, T., Lee, A., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Drosophila+mushroom+bodies%3A+sequential+generation+of+three+distinct+types+of+neurons+from+a+neuroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast.</a> Development. 126, 4065-4076 (1999).</li>
<li>Watts, R. J., Hoopfer, E. D., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+pruning+during+Drosophila+metamorphosis%3A+evidence+for+local+degeneration+and+requirement+of+the+ubiquitin-proteasome+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Axon pruning during Drosophila metamorphosis: evidence for local degeneration and requirement of the ubiquitin-proteasome system.</a> Neuron. 38 (6), 871-885 (2003).</li>
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<li>Connell-Crowley, L., Le Gall, M., Vo, D. J., Giniger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cyclin-dependent+kinase+Cdk5+controls+multiple+aspects+of+axon+patterning+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The cyclin-dependent kinase Cdk5 controls multiple aspects of axon patterning in vivo.</a> Curr. Biol. 10 (10), 599-602 (2000).</li>
<li>Truman, J. W., Riddiford, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+insights+into+the+evolution+of+metamorphosis+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects.</a> Annu. Rev. Entomol. 47, 467-500 (2002).</li>
<li>Noguchi, T., Miller, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+actin+dynamics+in+individualization+during+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Development. 130, 1805-1816 (2003).</li>
<li>Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Drosophila+brain+neuroblasts+reveals+a+role+for+Lis1%2Fdynactin+in+spindle+assembly+and+mitotic+checkpoint+control%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control.</a> Mol. Biol. Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).</li>
<li>Brown, H. L. D., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+time-lapse+imaging+and+dominant+negative+receptors+to+dissect+the+steroid+receptor+control+of+neuronal+remodeling+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila.</a> Development. 133, 275-288 (2006).</li>
<li>Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Developing+and+Adult+Drosophila+Brains+and+Retinae+for+Live+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging.</a> J. Vis. Exp. (37), e1936(2010).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

<html> Crónicas manipulaciones genéticas de la estructura del tejido y la función, incluyendo las mutaciones y la expresión de los transgenes, por lo general producen una combinación de efectos inmediatos y finales de las consecuencias indirectas que pueden ser muy difíciles de separar. Como complemento de los métodos genéticos con la farmacología puede facilitar el interrogatorio de la evolución en el tiempo detrás de un fenotipo. Por ejemplo, este ha sido un enfoque de gran alcance para la disección de las contribucion...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de Reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> La concentración final </td></tr><tr><td> Schneider Drosophila medios de comunicación </td><td> Invitrogen </td><td> 21720-024 </td><td></td></tr><tr><td> Suero bovino fetal (inactivado por calor) </td><td> Invitrogen </td><td> 10082-147 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> La penicilina / estreptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Insulina </td><td> Invitrogen </td><td> 12585-014 </td><td> 10μg/ml </td></tr><tr><td> Ecdisona </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H5142 </td><td> 2μg/ml </td></tr><tr><td> Roscovitina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R7772 </td><td> 100 micras </td></tr><tr><td> Olomoucina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O0886 </td><td> 100 micras </td></tr><tr><td> Suero normal de cabra </td><td> Invitrogen </td><td> 50062Z </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Albúmina de suero bovino </td><td> Fisher Scientific </td><td> M9501 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Formaldehído </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D4551 </td><td> 4% </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP151 </td><td> 0,5% </td></tr><tr><td> Tampón fosfato salino </td><td> Invitrogen </td><td> 70011-044 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector Laboratories </td><td> H1000 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Millicell Inserta cultivo celular </td><td> Millipore </td><td> PI8P01250 </td><td></td></tr><tr><td> Multidish, 4 y </td><td> Thermo Scientific </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 5 Pinzas </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 11251-20 </td><td></td></tr><tr><td> Preparaciones para microscopio </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-544-7 </td><td></td></tr><tr><td> Cierre de vidrio </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-548-5M </td><td></td></tr></tbody></table>

ex cultivo in vivo de la plenaria, los cerebros en desarrollo de drosophila

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

Se describe un método para el cultivo ex vivo de cerebros completos de Drosophila. Esto puede ser usado como un contrapunto de crónicas manipulaciones genéticas para investigar la biología celular y el desarrollo de estructuras cerebrales centrales al permitir agudas intervenciones farmacológicas y formación de imágenes en vivo de procesos celulares. Como un ejemplo de la técnica, antes de trabajar de nuestro laboratorio 1 ha demostrado que un compartimiento subcelular no reconocido previamente se encuentra entre los compartimentos axonales y somatodendrítica de los axones del cerebro de Drosophila central. El desarrollo de este compartimiento, referido como el segmento inicial del axón (AIS) 2, se muestra genéticamente a depender de la quinasa neuronal específica dependiente de ciclina, Cdk5. Mostramos aquí que el tratamiento ex vivo de tipo salvaje cerebro de Drosophila larvas con la roscovitina Cdk5 específico de los inhibidores farmacológicos y olomoucina 3 se producen cambios agudos en la organización de la actina, yen la localización de la proteína de la superficie celular fasciclin 2, que imitan los cambios observados en los mutantes que carecen de actividad de Cdk5 genéticamente. Un segundo ejemplo de la técnica in vivo la cultura ex está prevista la remodelación de las conexiones del cuerpo de setas embrionario (MB), las neuronas gamma durante la metamorfosis de larva a adulto. El cuerpo de hongo es el centro de aprendizaje y la memoria olfativa en la mosca de 4, y estas neuronas gamma podar sus ramas dendrítica y axonal durante el desarrollo de la pupa y luego volver a extender las ramas en un punto de tiempo después para establecer el patrón de inervación de adultos 5. La poda de estas neuronas de la MB se ha demostrado que se producen a través de la degeneración local de ramas neuritas 6, por un mecanismo que se activa por la ecdisona, una hormona esteroide, que actúa en el receptor de ecdisona B1 7, y que es dependiente de la actividad del ubiquitina-proteasoma sistema 6. Nuestro método de cultivo ex vivo puede be utilizan para interrogar mejor el mecanismo de la remodelación de desarrollo. Se encontró que en la configuración de la cultura vivo ex, las neuronas gamma de la MB recapituló el proceso de la poda de desarrollo con un tiempo similar al que en vivo. Es esencial, sin embargo, que esperar hasta 1,5 horas después de la formación pupario antes explantar el tejido a fin de que las células de cometer irreversiblemente a la metamorfosis; disección de animales en el inicio de pupariation llevó a metamorfosis poca o ninguna en cultivo. Así, con las modificaciones apropiadas, el método in vivo cultivo ex puede ser aplicado para estudiar dinámica así como los aspectos de estado estacionario de la biología cerebro central.

Este artículo describe un método por el cual se puede imitar<em&gt; En vivo</em&gt; Desarrollo de la<em&gt; Drosophila</em&gt; Cuerpo de hongo en un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Sistema de cultivo.

Ex cultivo in vivo de la Plenaria, los cerebros en desarrollo de Drosophila

Describimos un método para el cultivo ex vivo de cerebros completos de Drosophila. Este puede utilizarse como contrapunto a las manipulaciones genéticas crónicas para...

El objetivo general de este procedimiento es cultivar cerebros enteros en desarrollo de drosófila, larvas y pupas en un entorno ex vivo. Esto se logra primero identificando drosófilas, larvas y pupas en las etapas adecuadas. A continuación, los cerebros se disecan rápidamente.Luego, los cerebros se cultivan durante el período requerido a 25 grados Celsius. Finalmente, los cerebros cultivados se fijan, tiñen, montan e imaginan. En última instancia, los resultados muestran que es posible imitar el desarrollo in vivo del cuerpo de la seta oph mediante una técnica de cultivo ex vivo.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que ahora podemos emular fenotipos in vivo en el cuerpo menisco de Drosophila en un entorno de cultivo ex vivo, lo que permite un análisis de alta resolución de la dinámica del proceso de desarrollo. Para cultivar cerebros de larva, tras preparar medio completo fresco con insulina y act Dison, añada 500 microlitros a una placa de cultivo celular de 12 milímetros con inserto para tratamiento farmacológico. Prepare medio completo con 100 micromolar de cada uno de Rosco battin y oli moin.Agregue una pequeña cantidad de medio a una placa de Petri utilizando una espátula pequeña, tome las larvas de tercer estadio errantes y colóquelas en la placa de Petri. A continuación, usando pinzas, sostenga el extremo posterior de la larva.Luego, con la pinza número cinco, abra cuidadosamente el extremo anterior y diseque rápidamente el cerebro manteniendo intacto el cordón nervioso ventral. Utilizando puntas de pipeta previamente humedecidas, transfiera cuidadosamente el cerebro al recipiente de cultivo celular preparado previamente. A continuación, prepare una cámara húmeda y coloque el recipiente dentro de la cámara.Incube el cerebro a 25 grados Celsius durante un máximo de 48 horas para cultivar cerebros de pupil. Comience marcando puy blanco en los viales. Registre esta etapa como cero horas después de la formación de ER o un PF a 1,5 horas.A PF Añada 500 microlitros de medio completo a un plato de cultivo celular de 12 milímetros con inserto. Añada una pequeña cantidad de medio preparado a un vidrio de reloj de disección. A continuación, utilizando una espátula pequeña y húmeda, tome el EPP previamente marcado para disección y colóquelo en el vidrio de reloj.La pupa blanca de la izquierda corresponde al punto de tiempo cero, y a la derecha se muestra la de 1,5 horas A PF. Luego, sujetando el extremo posterior de la pupa con un par de pinzas, utilice pinzas número cinco para abrir cuidadosamente el extremo anterior del capullo de la pupa. A continuación, retire rápidamente el cerebro manteniendo el cordón nervioso ventral intacto y adherido. Después de cortar la punta superior de una punta plástica de 20 microlitros, humedezca la punta de la pipeta y úsela para transferir cuidadosamente los cerebros de las pupas a las placas con medio.Incubarlos a 25 grados Celsius durante el tiempo deseado. Una vez que los cerebros de larvas o pupilas hayan sido incubados durante el tiempo deseado, retire el medio y agregue 500 microlitros de formaldehído al 4 % en tampón PBST. Incubar durante 15 minutos, luego reemplace con formaldehído al 4 % recién preparado en tampón y continúe la incubación durante 15 minutos adicionales.Utilice un XPBS con 0,5 % de Triton X-100 para lavar los cerebros cuatro veces durante 10 minutos cada vez. Después del último lavado, incube las muestras durante una hora en solución bloqueante.Añada anticuerpos primarios en la solución bloqueadora e incube a cuatro grados Celsius durante la noche. A la mañana siguiente, lave las muestras con PBST cuatro veces durante 10 minutos cada vez. Luego incube con anticuerpos secundarios a temperatura ambiente durante cuatro horas.Repita los pasos de lavado para montar los cerebros para microscopía. Comience por equilibrarlos y colocar el medio de montaje durante una hora, y luego móntelos sobre portaobjetos de vidrio para evitar aplastar las muestras. Coloque trozos de vidrio a ambos lados.Luego, coloque las laminillas después de sellarlas con esmalte de uñas. Almacene los portaobjetos en la oscuridad. Esta figura muestra un panel de cerebros de larvas de tercer estadio de moscas de tipo silvestre y de moscas que expresan un derivado dominante negativo de CDK5 o CDK5 dn, ambas expresan GFP-actina en neuronas del cuerpo de la seta o neuronas MB gamma, como se describió previamente. Existe una región en los axones proximales de las neuronas gamma de tipo silvestre que no acumula GFP-actina, mostrándose así como una zona clara, y fasciculadamente, la proteína se acumula en los axones solo hasta el borde ventral de esta zona.Las líneas punteadas indican la posición del MB, resaltando la zona clara de acción y su borde ventral. En moscas que expresan CDK cinco dn, la zona clara de actina está ausente y la inmunorreactividad frente dos o rápido dos se extiende dorsalmente a través de esa región. Utilizando el método presentado aquí, cerebros de moscas silvestres cultivados ex vivo fueron tratados con una combinación de inhibidores farmacológicos de la actividad de CDK cinco, ROS cottin y ene.Se muestra aquí un panel de cerebros de larvas de tercer estadio de moscas silvestres de control y tratadas con fármacos, similares a moscas que expresan un constructo dominante negativo de CDK5. Los cerebros tratados con inhibidores de CDK5 durante 24 horas muestran la pérdida característica de la zona clara de actina y un desplazamiento en el cuerpo albicante. Dos líneas blancas delimitan la posición del cuerpo albicante de tipo silvestre. Se muestra aquí una serie representativa de cuerpos en forma de hongo de Drosophila desde 0 hasta 10 horas.Un PF marcado con membrana dirigida. Ocho corchetes de GFP indican las proyecciones dendríticas del MB conocidas como el calículo antes de la metamorfosis. Los axones del MB discurren de forma dorsoventral en haces gruesos y una señal fluorescente surge del denso arbore dendrítico.Esta columna muestra cerebros diseccionados en el momento indicado. Observe la poda de las dendritas en la región indicada por los corchetes, de tal manera que entre seis y ocho horas después del PF, la señal dendrítica difusa ha desaparecido. Los cerebros de esta columna fueron diseccionados a cero horas después del PF, antes del acto interno.La espiga de Dyson y los cultivos x vivo en los tiempos indicados muestran que no hay poda del desarrollo de las dendritas. Más bien, la señal dendrítica persiste a las 10 horas a PF para sortear este PPR marcado a cero horas EPF, pero diseccionado a 1,5 horas a PF y cultivado. Esta columna muestra una serie representativa de estos cuerpos en forma de hongo DLA desde cero hasta 10 horas.Un PF como en las muestras no cultivadas, la señal dendrítica es indetectable a las ocho horas un PF. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cultivar cerebros de rosler sostenidos ex vivo. Debería ser capaz de aislar cerebros de larvas en estadio tardío o prepupas blancas, ya sea antes o después del pico hormonal que inicia la metamorfosis. Luego, debería poder analizar el material fijado mediante microscopía o utilizar los cerebros como material inicial para imágenes en vivo.

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Este video muestra la preparación de cultivos primarios de neuronas del cerebro de Drosophila pupas etapa tardía. Puntos de vista de las culturas show en vivo de crecimiento de las neuritas y la imagen de los niveles de calcio con Fura-2.

Cultivos neuronales primarios del cerebro de Drosophila pupas etapa tardía

Este video muestra el procedimiento para el aislamiento de los cerebros de los adultos Drosophila todo en la preparación para la grabación de las neuronas individuales utilizando la tecnología estándar de células enteras. Incluye imágenes de las células GFP etiquetados y las neuronas visto durante la grabación.

Las grabaciones de células enteras del cerebro del adulto de Drosophila

Preparación de desarrollo y de adultos Drosophila Los cerebros y retinas de imágenes en vivo

Se describe el procedimiento para preparar...

Visualización del sistema nervioso embrionario en Todo el montaje Drosophila Los embriones

Este video muestra un protocolo para identificar factores exógenos que inician la reactivación de las células madre neurales del cerebro de Drosophila desde su estado de reposo. Las larvas recién eclosionadas se diseccionan para aislar sus cerebros, que luego se cultivan en medios con o sin una hormona de prueba para evaluar el potencial de la hormona para inducir la reactivación y proliferación de células madre neurales.

Análisis de la reactivación de células madre neurales en explantes de cerebro de Drosophila cultivados

Fuente: Ishimoto, H. et. al., Imágenes de calcio ex vivo para visualizar las respuestas cerebrales a la señalización endocrina en Drosophila. J. Vis. Exp. (2018) Este video muestra las imágenes de calcio para estudiarDrosophila respuestas cerebrales a los neuropéptidos. Las neuronas que expresan un indicador de calcio fluorescente revelan la dinámica del calcio intracelular y las respuestas funcionales a las moléculas de señalización.

Imágenes de calcio ex vivo para estudiar las respuestas cerebrales de Drosophila a los neuropéptidos

Este protocolo detalla un método simplificado utilizado para llevar a cabo imágenes de células vivas en el contexto de un cerebro de larvas intacta. Enfoques imágenes de células vivas tienen un valor incalculable para el estudio de las divisiones asimétricas de células madre neuronales, así como otros procesos neurogénicos y de desarrollo, descubriendo constantemente los mecanismos que se pasaron por alto anteriormente.

Imágenes en vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; larvales neuroblastos

El adulto de Drosophila cerebro es un sistema valioso para el estudio de los circuitos neuronales, las funciones cerebrales superiores, y los trastornos complejos. Un método eficaz para diseccionar el tejido cerebral entera de la cabeza pequeña mosca que facilitará los estudios basados ​​en el cerebro. Aquí se describe un protocolo de disección simple, de un solo paso de cerebros adultos con una morfología bien conservada.

Un simple de un solo paso para la disección Protocolo Todo el montaje Preparación de adulto<em&gt; Drosophila</emLos cerebros&gt;

El objetivo del presente Protocolo es establecer ex vivo Drosophila larvas cerebro cultura optimizada para controlar ritmos circadianos moleculares con imágenes de Time-lapse de fluorescencia a largo plazo. También se discute la aplicación de este método a los ensayos farmacológicos.

Sola célula resolución fluorescencia vivo la proyección de imagen de relojes circadianos de Drosophila en cerebro larvas cultura

Este papel describe un protocolo para ex vivo calcio la proyección de imagen del cerebro de Drosophila . En este método, compuestos naturales o sintéticos pueden aplicarse en el búfer para poner a prueba su capacidad para activar las neuronas particular en el cerebro.

Ex Vivo Proyección de imagen de calcio para la visualización de las respuestas cerebrales a la señalización endocrina en Drosophila

Se ha establecido un método para reactivar las células madre neurales inactivas en explantes cerebrales de Drosophila cultivados. Usando este método, el papel de las señales sistémicas se puede desacoplar de las señales intrínsecas del tejido en la regulación de la inactividad, entrada y salida de las células madre neurales.

Reactivación de células madre neurales en explantes cerebrales de Drosophila cultivados

Aprende a cultivar cerebros de Drosophila ex vivo para estudiar el desarrollo del cuerpo pedunculado. Esta técnica permite analizar con alta resolución los procesos de desarrollo neuronal y evaluar tratamientos farmacológicos.

Ex cultivo in vivo de la Plenaria, los cerebros en desarrollo de Drosophila

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