Ex cultivo in vivo de la Plenaria, los cerebros en desarrollo de Drosophila

El objetivo general de este procedimiento es cultivar cerebros enteros de drosófilas, larvas y pupilas en desarrollo en un entorno ex vivo. Esto se logra identificando primero la drosophila, las larvas y los pupi en etapa apropiada. A continuación, los cerebros se diseccionan rápidamente.

Luego, los cerebros se cultivan durante el período de tiempo requerido a 25 grados centígrados. Finalmente, los cerebros cultivados se fijan, se tiñen, se montan y se obtienen imágenes. En última instancia, los resultados muestran que es posible imitar el desarrollo in vivo del cuerpo del hongo oph a través de una técnica de cultivo ex vivo.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes es que ahora podemos emular fenotipos in vivo en el cuerpo del hongo Drosophila en un entorno de cultivo ex vivo, lo que permite un análisis de alta resolución de la dinámica del proceso de desarrollo para cultivar cerebros de larvas. Después de preparar el medio fresco, completar con insulina y actuar Dyson a 500 microlitros en una placa de cultivo celular de 12 milímetros con inserto para el tratamiento farmacológico. Prepare el medio completo con 100 micromolares de Rosco battin y oli moin.

Agregue una pequeña cantidad de medio a una disección. Reloj de vidrio con una pequeña espátula, recoja las larvas errantes del tercer estadio y colóquelas en el vidrio del reloj. A continuación, con pinzas, sujete el extremo posterior de la larva.

Luego, con el número cinco, fórceps, abra cuidadosamente el extremo anterior y diseccione rápidamente el cerebro manteniendo intacto el cordón nervioso ventral. Con las puntas de pipeta prehumedecidas, transfiera con cuidado el cerebro a la placa de cultivo celular previamente preparada. A continuación, haga una cámara húmeda y coloque el plato dentro de la cámara.

Incubar el cerebro a 25 grados centígrados durante un máximo de 48 horas para cultivar los cerebros de los alumnos. Comience marcando puy blanco en los viales. Registre esta etapa como cero horas después de la formación de RE o un PF a 1,5 horas.

A PF Agregue 500 microlitros de medio completo a una placa de cultivo celular de 12 milímetros con inserto. Agregue una pequeña cantidad de medio preparado a un vidrio de reloj de disección. A continuación, con una pequeña espátula húmeda, recoja el EPI previamente marcado para la disección y colóquelo en el cristal del reloj.

El pupi blanco de la izquierda es el punto de tiempo cero, y a la derecha se muestra el PF A de 1,5 horas. Luego, mientras sostiene el extremo posterior del puy con un par de pinzas, use las pinzas número cinco para abrir cuidadosamente el extremo anterior de la caja de la pupa. A continuación, se extirpa rápidamente el cerebro, manteniendo el cordón nervioso ventral intacto y unido. Después de cortar la parte superior de una punta de plástico de 20 microlitros, humedezca la punta de la pipeta y utilícela para transferir con cuidado los cerebros de las pupilas a los platos de medium.

Incubarlos a 25 grados centígrados durante el tiempo deseado. Después de que los cerebros de las larvas o pupilas se hayan incubado durante el período de tiempo deseado, retire el medio y agregue 500 microlitros de formaldehído al 4% en tampón PBST. Incube durante 15 minutos, luego reemplácelo con formaldehído fresco tamponado al 4% e incube durante 15 minutos adicionales.

Use un XPBS con 0.5%Triton X 100 para lavar los cerebros cuatro veces durante 10 minutos cada una. Después del último lavado, incubar las muestras durante una hora. En solución de bloqueo.

Agregue anticuerpos primarios en solución de bloqueo e incube a cuatro grados centígrados durante la noche. A la mañana siguiente, lave las muestras con PBST cuatro veces durante 10 minutos cada una. A continuación, incubar en anticuerpos secundarios a temperatura ambiente durante cuatro horas.

Repita los pasos de lavado para montar los cerebros para la microscopía. Comience equilibrándolos y montando el medio durante una hora y móntelos en portaobjetos de vidrio para evitar aplastar las muestras. Coloque las virutas de vidrio a ambos lados.

A continuación, aplique los cubreobjetos después de sellarlos con esmalte de uñas. Guarde las diapositivas en la oscuridad. Esta figura muestra un panel de cerebros de larvas de tercer estadio de moscas de tipo salvaje y moscas que expresan un derivado negativo dominante de CDK five o CDK five dn, ambas expresan actina GFP en neuronas del cuerpo del hongo o MB gamma como se describió anteriormente, hay una región en los axones proximales de las neuronas gamma de tipo salvaje que no puede acumular actina GFP, De este modo, se muestra como una zona clara y fascialmente se acumulan dos proteínas en los axones solo hasta el borde ventral de esta zona.

Las líneas punteadas indican la posición del MB resaltando la zona clara actuante y su borde ventral. En moscas que expresan CDK cinco dn. La zona clara de actina está ausente y la inmunorreactividad se propaga dorsalmente a través de esa región utilizando el método presentado aquí para el cultivo ex vivo, los cerebros de moscas de tipo silvestre se trataron con una combinación de los inhibidores farmacológicos de CDK, cinco actividad, ROS, cottin y ene.

Aquí se muestra un panel de cerebros de larvas de tercer estadio de moscas de tipo salvaje controladas y tratadas con drogas similares a moscas, que expresan un CDK negativo dominante cinco cerebros de construcción tratados con inhibidores de CDK cinco durante 24 horas muestran la pérdida característica de actuar zona clara y cambio en rápido. Dos líneas blancas de límite muestran la posición del tipo salvaje rápidamente. Aquí se muestra una serie representativa de cuerpos de hongos Drosophila de cero a 10 horas.

Un PF marcado con membrana dirigida. Los ocho corchetes de MCD GFP indican las proyecciones dendríticas del MB denominado cáliz antes de la metamorfosis. Los axones MB recorren dorso ventralmente en haces gruesos y una señal fluorescente surge del dendrítico dendrítico dendrítico.

Esta columna muestra los cerebros disecados en el momento indicado. Obsérvese la poda de las dendritas en la región indicada por los paréntesis, de modo que a las seis u ocho horas por PF, la señal dendrítica de neblina ha desaparecido. Los cerebros de esta columna fueron diseccionados a las cero horas A PF antes del acto interno.

La espiga de Dyson y la xvivo cultivada en los tiempos indicados no muestran poda de desarrollo de las dendritas. Más bien, la señal dendrítica persiste a las 10 horas un PF para eludir esta PPR marcada a cero horas EPF, pero se disecciona a 1,5 horas un PF y se cultiva. Esta columna muestra una serie representativa de estos cuerpos de hongos DLA de cero a 10 horas.

A PF como en las muestras no cultivadas, la señal dendrítica es indetectable a las ocho horas un PF. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cultivar cerebros de rosler ex vivo. Debería ser capaz de aislar los cerebros de las larvas en etapa tardía o de la PrepU blanca, ya sea antes o después del pico hormonal que se compromete a la metamorfosis. A continuación, debería ser capaz de analizar el material fijo mediante microscopía o utilizar el cerebro como material de partida para la obtención de imágenes en vivo.