Una descripción visual de la disección de la vasculatura cerebral superficial y las meninges asociada y el plexo coroideo del cerebro de rata

El objetivo general de este procedimiento es diseccionar de manera eficiente y expedita las porciones de descamación y aracnoideas de las meninges y la vasculatura arterial asociada, superponiendo la superficie de la corteza del prosencéfalo y el mesencéfalo, el tálamo y los callos, así como recolectar el plexo coroideo de los ventrículos laterales. Esto se logra extirpando primero la glándula pineal y separando las meninges y los árboles arteriales hasta el prosencéfalo. En segundo lugar, las arterias y arterias de la superficie cortical se extirpan cuidadosamente, comenzando en el círculo ventral de Willis, y luego procediendo a las superficies corticales dorsales para que la cáscara y las membranas aracnoideas restantes permanezcan unidas a la vasculatura, asegurándose de minimizar la recolección de los tejidos de la superficie cortical adyacentes.

A continuación, la corteza y las fibras comisurales se diseccionan lejos del tabique y el hipocampo, exponiendo los ventrículos laterales para permitir la recolección del plexo coroideo. Finalmente, se extirpa el hipocampo, dejando al descubierto el tálamo y los callos del mesencéfalo. A continuación, se diseccionan las meninges y la vasculatura asociada que recubre esta región.

En última instancia, la integridad y especificidad de las meninges disecadas y la vasculatura arterial asociada, así como el plexo coroideo, pueden determinarse comparando los perfiles de expresión génica de cada una de estas regiones. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la investigación relacionada con los vasos vasculares que apoyan la función cerebral. Incluye similitudes y comparaciones y diferencias en la función del plexo coroideo en comparación con las meninges y su vasculatura arterial asociada con respecto al flujo sanguíneo, la función del LCR, las lesiones neurotóxicas y el traumatismo cerebral.

Para comenzar este protocolo, coloque los cerebros recién extraídos de las ratas inmediatamente después de que fueron sacrificados en solución salina normal y helada durante cinco minutos. Es importante permitir que el cerebro se enfríe durante esta cantidad de tiempo antes de la disección, de modo que las cuatro meninges de enceflina y la vasculatura arterial asociada o MAV puedan separarse de la superficie de la corteza. A continuación, coloque el cerebro en el fondo de una placa de Petri de vidrio que descansa sobre hielo con un centímetro de hielo, solución salina normal fría o solución salina tamponada con fosfato de sodio 0,1 molar a un pH de 7,4.

Toda la disección debe realizarse con el cerebro, en su mayor parte sumergido en solución salina. Para comenzar la disección, coloque el lado dorsal del cerebro hacia arriba en la placa de Petri y ubique la glándula pineal, que se encuentra en la región ventral más mimada entre los dos hemisferios. Justo rostral al cerebelo y justo debajo, o en la superficie de las meninges.

Sobre el colli. Retire la glándula pineal con dos pinzas pequeñas de punta doblada. Tenga en cuenta que la glándula pineal es de color rosado como la corteza, pero a menudo está rodeada de restos de sangre y vasculatura residuales de la extracción del cerebro.

A continuación, dale la vuelta al cerebro en la placa de Petri. A continuación, separe la arteria vertebral y las arterias más pequeñas y las meninges que cubren la protuberancia de las meninges y la vasculatura del prosencéfalo. A continuación, inicie la eliminación del MAV.

Es importante iniciar ventralmente el proceso de disección con las arterias principales del círculo de Willis, arterias cerebrales medias y arterias anteriores. A continuación, comenzando con cualquiera de los hemisferios, use pequeñas pinzas de punta doblada para cortar la arteria comunicante posterior justo después de la juntura carótida interna, separando así los árboles arteriales más anteriores y posteriores del prosencéfalo. Luego repita el mismo proceso para el hemisferio contralateral.

Ahora, agarrando el MCA y la arteria anterior con las pinzas, tire suavemente en dirección dorsal anterior para que el MAV que cubre la corteza ventral anterior se eleve sobre y alrededor del tracto olfativo. Esto elimina gran parte del MAV que cubre la corteza anterior. Gire el cerebro en un ángulo de 45 a 90 grados con respecto a la placa de Petri para que las regiones laterales más anteriores del MAV que rodean las regiones corticales laterales puedan liberarse de la corteza, agarrar el MCA y las arterias asociadas y tirar suavemente dorsalmente a lo largo de la corteza.

Si es necesario, los extremos de las pinzas se pueden usar para levantar y liberar las arterias principales de la corteza durante la disección. Ahora, extirpa las regiones laterales más posteriores del MAV. Tenga en cuenta que es mejor cambiar de un hemisferio a otro durante este proceso de recolección para asegurarse de que el MAV permanezca frío e hidratado, también cambie de hemisferio si se encuentra alguna resistencia para liberar el MAV de la corteza.

Finalmente, para eliminar las regiones más dorsales del MAV que rodean la corteza somatosensorial y motora primaria, gire el lado dorsal del cerebro hacia arriba para liberar esta sección del cerebro, use los extremos de las pinzas a lo largo del seno sagital. Esta porción del MAV cosechado puede mantenerse temporalmente en solución salina helada hasta que sea necesario para pruebas y análisis, o congelarse para su posterior procesamiento. A menudo, el MAV que cubre las regiones más posteriores de la corteza permanece adherido.

Su eliminación se muestra en una sección posterior de este video. Para extirpar el plexo coroideo, primero coloque el cerebro con el lado dorsal hacia arriba y manténgalo en su lugar con las pinzas más grandes. Luego, empuje las pinzas más pequeñas hacia abajo a través de la línea media entre los hemisferios y use los extremos para perforar la corteza y el cuerpo calloso en la parte superior de la línea media del hipocampo.

A continuación, utilice las pinzas para separar la corteza callosa del hipocampo dorsal y del tabique, exponiendo la mayor parte del ventrículo lateral. El plexo coroideo puede localizarse e identificarse por la línea roja ondulada que demarca la arteria principal que recorre su longitud. Use los dos extremos de las pinzas para hacer palanca en las paredes laterales del tercer ventrículo y agrandarlo en su extremo más mimoso.

Luego, con las pinzas pequeñas, tire de este extremo del plexo coroideo para liberarlo. A continuación, utilice las pinzas para agrandar la región muy anterior entre el tabique y la región del putamen caudado y libere el plexo coroideo también en este extremo. También se realiza el mismo procedimiento en el hemisferio contralateral para obtener el segundo plexo coroideo restante.

Una vez más, este tejido puede mantenerse temporalmente en hielo, frío, solución salina o congelado para su posterior procesamiento. Para eliminar el MAV restante que cubre las regiones más posteriores de la corteza, primero, extirpe todo el hipocampo de ambos hemisferios exponiendo el MAV sobre el tálamo y los colículos. Tenga en cuenta que la eliminación de esta porción del MAV será mucho menos difícil que su eliminación de la corteza para el MAV restante.

Al agarrar la vasculatura más grande que recubre la porción anterior del tálamo y tirar suavemente de ella, esta vasculatura se conecta a la red supracurricular y suministra sangre al hipocampo dorsal y a la red del tálamo dorsal. Aléjese coddly y, finalmente, la red supra se liberará y se podrán alcanzar las últimas porciones del círculo arterial mimoso. En este punto, se debe tener más cuidado para eliminar cualquier MAV restante en la superficie de las cortezas lineales granulares primarias, auditivas y visuales.

Cualquier MAV cortical ventral posterior restante recolectado con esta segunda sección de MAV talámico y calloso debe eliminarse y agregarse a la primera sección cortical de MAV diseccionada si se van a analizar por separado. A continuación, para comparar los perfiles de expresión génica entre la corteza parietal estriada y las regiones MAV en condiciones de control, el análisis de la expresión génica se puede realizar utilizando el genoma completo de rata Agilent 0 1 4 8 7 9, cuatro por 44, 060 matrices de oligonucleótidos mer. Se pueden encontrar más detalles sobre el procesamiento, el escaneo y el almacenamiento inicial de datos en Thomas et al.

Cuando la disección se ejecuta correctamente. Los tejidos MAV resultantes deben estar en dos entidades intactas con un peso total de entre 35 y 45 miligramos. El MAV inicialmente diseccionado que rodea la mayor parte de la corteza debe pesar unos 25 miligramos, y el que cubre el tálamo, los callos y la corteza occipital debe pesar unos 15 miligramos.

El tejido debe ser de color ligeramente rosado debido a la sangre residual en la vasculatura. El plexo coroideo bilateral extraído debe estar en dos muestras de tejido intactas, cada una con un peso de uno a dos miligramos, como se ve aquí. Aquí vemos una comparación de los perfiles de expresión génica en la corteza parietal estriada y MAV en condiciones de control.

El gráfico superior muestra la expresión en el cuerpo estriado en comparación con la corteza parietal. Si bien el gráfico inferior muestra la expresión en el MAV en comparación con la corteza parietal, se puede ver que el cuerpo estriado y la corteza parietal están mucho más estrechamente relacionados entre sí que el MAV. Aquí vemos la expresión génica diferencial en MAV en respuesta a la hipertermia en comparación con el control, en respuesta a la anfetamina en comparación con el control y en la hipertermia frente a la anfetamina.

Finalmente, aquí vemos genes con una expresión mayor de 15 veces en MAV en comparación con la corteza parietal y el cuerpo estriado caracterizados por su función. Muchos de estos genes están relacionados con el sistema vascular y/o el sistema inmunitario. Otros genes con cambios de pliegue muy grandes son las proteínas de la matriz extracelular, los transportadores de saute y el metabolismo de los lípidos y el ácido retinoico.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe tener paciencia mientras disecciona el MAV. También es importante que el cerebro permanezca sumergido en solución salina isotónica o solución salina tamponada con fosfato durante toda la disección. Además, se aconseja practicar la sección del MAV en cuatro o cinco ratas antes de obtener tejidos para la generación de datos experimentales.