Name: Una descripción visual de la disección de la vasculatura cerebral superficial y las meninges asociada y el plexo coroideo del cerebro de rata (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: Aprende a diseccionar la vasculatura cerebral superficial y el plexo coroideo en ratas. Este método permite estudiar la dinámica del líquido cefalorraquídeo y la función vascular cerebral con precisión.

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Este trabajo fue financiado por NCTR / FDA.

Aunque no se muestra en el vídeo, las ratas se les dio primero una sobredosis de 300 mg / kg de pentobarbital, lo que resulta en la anestesia en menos de 3 min y, a continuación sacrificaron por decapitación. Sus cerebros fueron luego rápidamente pero cuidadosamente retirados del cráneo y se enfrió en hielo frío solución salina normal durante 5 min. Es importante dejar que el cerebro fresco para esta cantidad de tiempo antes de la disección de la MAV, para que la MAV se puede separar de la superficie de la corteza (la parte superior de la capa I). El cerebro se colocó en el fondo de un plato de Petri de vidrio que descansa sobre hielo que estaba lleno (1 cm de profundidad) de helado de solución salina normal o de sodio 0,1 M de buffer fosfato salino pH = 7,4. Toda la disección se realiza con el cerebro en su mayor parte sumergió en solución salina. 1. Extirpación de la Glándula Pineal <ol><li> Coloque el cerebro hasta el lado dorsal (con relación a la parte inferior de la placa de Petri). La glándula pineal se encuentra en la región ventral más caudal entre los dos hemisferios sólo rostral a tél cerebelo (rebaje pineal), y está justo por debajo o en la superficie de las meninges más de los colículos. Retire la glándula pineal primero con dos pequeñas pinzas de punta dobladas. Es de color rosa como la corteza, pero es a menudo rodeada de restos de sangre y la vasculatura residual de la extracción del cerebro. </li></ol> 2. La eliminación de la MAV <ol><li> Da la vuelta al cerebro a través del &quot;boca abajo&quot; y separar la arteria vertebral, las pequeñas arterias y las meninges que cubren el puente de las meninges y la vasculatura del cerebro anterior. La eliminación de la MAV cerebro anterior es iniciada. Es importante comenzar ventralmente en el proceso de disección. Las grandes arterias principales del polígono de Willis, arterias cerebral media (MCA) y las arterias anteriores son los más fuertes y servir como &quot;andamios&quot; por la cual las arterias pequeñas y arteriolas superficiales del pial membrana puede entonces ser retirado de la corteza con el resto de las meninges. Consulte la opinión de Scremin 7 para mrepresentaciones visuales de mineral y los detalles de la vasculatura cerebral superficie. </li><li> A partir de cualquiera de los hemisferios, utilizar las pinzas dobladas pequeñas puntas para cortar la arteria comunicante posterior justo posterior a la unión carótida interna. Por lo tanto, la separación de los árboles arteriales más anterior y posterior del cerebro anterior. Repetir el mismo proceso para el hemisferio contralateral. </li><li> Agarrando la MCA y la arteria anterior con las pinzas, tirar suavemente en una dirección anterior-dorsal para que el MAV que cubre la corteza anterior ventral (piriforme, tubérculo olfatorio) se eleva por encima y alrededor del tracto olfatorio. Esto elimina gran parte de la MAV que cubre la corteza anterior (cingulado y orbital). </li><li> Girar el cerebro en un ángulo de 45 ° a 90 a la placa de Petri. Las regiones laterales, más anterior de la MAV que rodea a las regiones corticales laterales (granular insular, secundaria somatosensorial y la corteza auditiva) puede ser liberado de la corteza agarrando la MCA y arterias asociadoies y tirando suavemente dorsalmente a lo largo de la corteza. Si es necesario, los extremos de las pinzas se pueden utilizar para levantar y liberar las arterias principales de la corteza durante la disección. </li><li> Ahora quite las regiones más laterales posteriores de la MAV. (Nota, es mejor cambiar de un hemisferio al otro durante este proceso de cosecha para asegurar que la MAV permanece frío e hidratado. Además, si la resistencia en la liberación de la MAV de la corteza se encuentra en el interruptor de un hemisferio con el hemisferio contralateral temporalmente y luego volver al hemisferio original más adelante.) </li><li> Para eliminar las regiones más dorsales de la MAV que rodean la somatosensorial primaria y la corteza motora gire el cerebro hasta el lado dorsal (con relación a la parte inferior de la placa de Petri). Para liberar finalmente el Mav cerebro, utilice los extremos de las pinzas a lo largo del seno sagital. Esta porción de la MAV cosechada puede ser guardado temporalmente en solución salina enfriada con hielo hasta que las pruebas y el análisis o congelado para su posterior procesamiento. A menudola MAV que cubre las regiones más posteriores / caudal de la corteza (corteza entorrinal auditivas, visuales y más caudal) permanece unida a la corteza. Su eliminación se muestra más adelante en el video cuando el MAV entre la corteza y retrosplenial que recubre los colliculi se disecan. </li></ol> 3. La eliminación del plexo coroideo <ol><li> Coloque el lado dorsal del cerebro y mantenerlo en su lugar con las pinzas más grandes Presione las pinzas más pequeñas a lo largo de la línea media entre los hemisferios y luego utilice los extremos para perforar a través del cuerpo calloso y la corteza corpus (≈ -3,3 mm de bregma) en la parte superior de la línea media del hipocampo. </li><li> Use las pinzas para tirar de la corteza con calloso lejos del hipocampo dorsal y el tabique, exponiendo la mayor parte del ventrículo lateral. El plexo coroideo puede ser localizado e identificado por la línea ondulada de color rojo demarcación de la arteria principal que recorre su longitud. Usa los dos extremos de las pinzas para arrancar las paredes laterales de la tercera ventricle y ampliarla en el extremo más caudal (≈ -4,3 mm de bregma 8). </li><li> Uso de las pequeñas pinzas, tire de este extremo del plexo coroideo libre. Luego vaya a la región muy anterior entre el tabique y el caudado / putamen (extensión más rostral, ≈ 1,6 mm de bregma) y con las pinzas ampliar esta sección del ventrículo y tire del plexo coroideo libre. Realice el mismo procedimiento en el hemisferio contralateral al obtener el segundo plexo coroideo restante. De nuevo este tejido puede ser guardado temporalmente en solución salina enfriada con hielo hasta que las pruebas y el análisis o congelado para su posterior procesamiento. </li></ol> 4. La eliminación de la MAV que queda en el 3 º ventrículo Cubriendo el tálamo y el colículo así como en las regiones más caudal de la corteza como retroesplenial, auditivo y corteza visual <ol><li> Quite todo el hipocampo de ambos hemisferios exponiendo la MAV en el tálamo y colículo. La eliminación de losesta parte de la MAV es mucho menos difícil que la eliminación de MAV sobre la corteza. </li><li> Tire de esta parte de la MAV libre agarrando la vasculatura más grande que recubre la parte anterior del tálamo y tirando suavemente en sentido caudal. Esta vasculatura está conectado a la red collicular supra y suministra sangre al hipocampo dorsal y de la red tálamo dorsal. Tire a la basura caudalmente y libre poco a poco la red supracollicular hasta llegar a las últimas porciones de la vasculatura arterial círculo caudal. En este punto, más se debe tener cuidado para eliminar cualquier resto de MAV ventral posterior en la superficie de la retroesplenial granular, auditiva primaria y cortezas visuales. Al igual que con la otra sección de MAV cubriendo las porciones más anterior de la corteza, este tejido puede ser guardado temporalmente en solución salina enfriada con hielo hasta que las pruebas y el análisis o congelado para su posterior procesamiento. Cualquier remanente MAV posterior ventral cosechado con esta segunda sección MAV se debe quitar unad añadido a la sección de MAV primera diseccionado que cubre la corteza si han de ser analizados por separado. </li></ol> 5. Los resultados representativos Cuando la disección se realiza correctamente, los tejidos resultantes MAV deben estar en dos entidades intactas pesan alrededor de 35 a un total de 45 mg. El inicialmente diseccionado MAV que rodea la mayor parte de la corteza debe pesar aproximadamente 25 mg y la MAV que cubre el tálamo, el colículo y corteza occipital debe pesar aproximadamente 15 mg. Debe ser un poco de color rosado de la sangre residual en la vasculatura. El plexo coroideo bilateral cosechados deben estar en dos muestras de tejido intacto con un peso cada 1 a 2 mg. Aunque el exceso de agua puede eliminarse de la MAV antes de su almacenamiento o procesamiento con el uso del papel tejido tal como el utilizado en la limpieza de la lente, para evitar la pérdida de tejido que no es una buena idea para eliminar el exceso de agua de la coroides diseccionado plexo. Figura 1 se ha generado para comparando profil expresión<html> es en tres regiones (cuerpo estriado, la corteza parietal y MAV) bajo condiciones de control usando Agilent-014879 enteros Rat Genome 4x44K 60mer matrices de oligonucleótidos (G4131F, Agilent Technologies, Palo Alto, CA; NCBI GEO n º de acceso GPL7294; GSE23093 y GSE29733 que están presentes en el NCBI GEO repositorio). Los dos gráficos en la figura gráficamente muestran la expresión en 1) el cuerpo estriado en comparación con la corteza parietal y 2) la MAV en comparación con la corteza parietal. Es evidente que el cuerpo estriado y la corteza parietal son mucho más estrechamente relacionados entre sí que la MAV. Los datos que comparan el plexo coroideo con la MAV se presenta en una publicación futura. Sin embargo, es probable que los perfiles de expresión en la MAV y el plexo coroideo están más estrechamente relacionados entre sí que lo son para el cuerpo estriado y la corteza parietal. Figura 2 muestra la expresión diferencial de genes de respuesta a la hipertermia (EIH) versus AMPH en comparación MAV para controlar y entre ellos. contenido &quot;&gt; La expresión de genes de más de 11.000 genes con los oficiales símbolos de genes NCBI en MAV de animales de control se comparó con los registrados en el cuerpo estriado y la corteza parietal. Más de 2000 de estos genes tenían una expresión de 2,5 veces o más diferentes en el MAV en comparación con los dos neuronal tejidos ricos, y 550 genes tenían una diferencia de 10 veces mayor en la expresión. Algo más del 40% (253) de éstos eran genes con una expresión disminuida de 10-veces o más en MAV y estaban relacionadas con la función neuronal. Hubo 343 genes con una expresión más de 10-veces o más en comparación con MAV corteza parietal y el cuerpo estriado. Esta lista de genes se utilizó como punto de partida con el cual determinar los genes con un enriquecimiento muy alto en la MAV. Cuadro 1 se enumeran los genes con una mayor expresión de 15-veces en comparación con MAV corteza parietal y el cuerpo estriado y las clasifica con respecto a la función. Muchos de estos genes estaban relacionados con el sistema vascular y / o el sistema inmune. Estos tipos de genes debe ser enriquecida sobre 5 - a 10 - veces a causa del aumento de la vasculatura en sí y la sangre presente en ella. Sin embargo, incluso para los genes con funciones conocidas vasculares generales, un aumento por encima de 15-veces indica un enriquecimiento en MAV. También había un número de genes con cambios veces muy grandes que eran: 1) proteínas de la matriz extracelular (no específicamente relacionados con la vasculatura), 2) transportadores de soluto y 3) los lípidos y el metabolismo del ácido retinoico. Dado que el crecimiento así, pocos y diferenciación genética o factores de transcripción se encontraron. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4285/4285fig1.jpg" /> Figura 1. Comparación de la Expresión Génica en MAV con la corteza parietal y el cuerpo estriado. Parcela Volcán comparar los niveles de expresión génica de la corteza parietal y el cuerpo estriado (gráfica superior) y la corteza parietal y MAV (diagrama de abajo). Los símbolos rojos denotan los genes que son significativamente diferentes betwebaño regiones de p &lt;0,05 y tienen una expresión diferencial de 1,5 veces o más entre las regiones. Los símbolos negros representan los genes que no difieren significativamente entre las regiones (p&gt; 0,05) y están a menos de 1,5-veces difieren en la expresión. Los símbolos indican los genes de color rosa con menos de una diferencia de 1,5-veces en la expresión pero estadísticamente diferentes de manera significativa a p &lt;0,05. Los símbolos amarillos identificar los genes que tienen una expresión 1,5-veces o más, pero este cambio no es estadísticamente significativa a p &lt;0,05. Abreviaturas AMPH anfetamina EIH ambientalmente hipertermia inducida MAV meninges y la vasculatura cerebral asociada Norma normotérmica controla <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4285/4285fig2.jpg" /> Figura 2. Efectos de la hipertermia y la anfetamina sobre la expresión de genes en MAV. Volcán compararon parcelaslos niveles de expresión génica en el MAV después salina, o EIH AMPH en el punto 3 hr tiempo. Los símbolos rojos indican los genes que se consideran significativamente diferentes, mientras que los puntos negros / círculos representan los genes que no difieren significativamente entre regiones. Análisis estadístico adicional se utilizó para verificar que la expresión de las diferencias entre el control y los tratamientos eran de hecho estadísticamente significativa. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="1in"> Expresión MAV cerebral Expresión </td><td fo:width="4.5in"> NCBI Gene símbolos </td><td fo:width="1.5in"> Especificidad tejido o función informado (s) </td></tr><tr><td> &gt; 50-veces </td><td> ANXA2 a, Col8a1, Des, Esm1, Glycam1, Kl a, Lect1, Lepr, Lum, MYH11, Ogn, Tagln, Thbs2, TNNT2 </td><td> Vasculatura y corazón </td></tr><tr><td> &gt; 50-veces </td><td> CCL19, una CD74, DEFB1, Lrrc21, Mgl1, Mrc1, Msln, Pl.a2g5, PRG4, RT1-Bb, RT1-Da </td><td> Sistema Inmune </td></tr><tr><td> &gt; 50-veces </td><td> Adh1, Aebp1, Aldh1a2, GSTM2 </td><td> El ácido retinoico y procesamiento de los lípidos </td></tr><tr><td> &gt; 50-veces </td><td> Cdh1, COL3A1, COL1A2, Colec12, Cpxm2, CPZ, DCN, Emp3, GPC3, Nupr1, OMD, Pcolce Slamf9, Tmem27, Tspan8 </td><td> Matriz extracelular y uniones célula-célula </td></tr><tr><td> &gt; 50-veces </td><td> AQP1, Asgr1, Kcnj13, Slc5a5, Slc6a13, Slc6a20, Slc22a6, Sned1, Ttr </td><td> Ion y homeostasis de solutos </td></tr><tr><td> &gt; 50-veces </td><td> Alx3, CDKN1C, FOXC2, IGFBP2, IFITM1, Ifitm2, Nkx6-1, OSR1, Prrx2, SFRP1, Tbx15. Upk1b, Wisp2, Wnt6 </td><td> Desarrollo y regulación de la transcripción </td></tr><tr><td> &gt; 50-veces </td><td> Gpha2, Mfap5, Mpzl2 Plac8, Scgb1c1, Sostdc1, Steap1 </td><td> Desconocido y Otros </td></tr><tr><td> 30 a 50 veces </td&gt; <td> ANXA1 a, Angpt2, C6 a, GJB2, Ptgis, Thbd, TIMP1 </td><td> Vasculatura y corazón </td></tr><tr><td> 30 a 50 veces </td><td> Casp12, CCL2, CCR1, CD14, CXCL10, Ifitm3, Klra5, Lgals1, Lgals3, Ms4a4a, Ms4a7, Plscr1, Spp1, Xcl1 </td><td> Sistema Inmune </td></tr><tr><td> 30 a 50 veces </td><td> COL6A3, Cpxm1, Efemp1, FMod, pop, NID2 </td><td> Matriz extracelular y uniones célula-célula </td></tr><tr><td> 30 a 50 veces </td><td> Cp, CUBN, GCGR, S100A6, Scn7a, SCT, Slc4a5, Slc16a11, Slco1a5 </td><td> Ion y homeostasis de solutos </td></tr><tr><td> 30 a 50 veces </td><td> CFD, Ch25h, CRABP2, Rarres2 </td><td> El ácido retinoico y procesamiento de los lípidos </td></tr><tr><td> 30 a 50 veces </td><td> BMP6, Casp12, Dab2, Folr1, Igf2, MSX1, Tbx18, TWIST1, Wnt5b </td><td> Desarrollo y regulación de la transcripción </td></tr><tr><td> 30 a 50 veces </td><td> Cela3b, Cln6, C1qtnf7, Copz2, Dhrs7c, Gng11, Prss23, Srpx, Vim </td><td> Desconocido y Otros </td></tr><tr><td> 15 a 30 veces </td><td> Adm, Angpt1, Angptl2, BGN, Cklf a, cnn1, Cox8h, CTSK, F13a1, GJA5, Klf4, Lox, Lyz, Myl9, PROCR, PROS1, RT1-Ba, Serpinb10, Serping1, Serpinf1, TGM2, Tnmd, Trim63, Txnip a, Vamp5, VTN </td><td> Vasculatura y corazón </td></tr><tr><td> 15 a 30 veces </td><td> Ada a, Bst2, Ccl6, CD40, CD68, CTSC, Dap, Faim3, Fkbp9, Fxyd5, Fmo1, Glipr1, IER3, Ifi47, Igsf6, Msc, NFATc4, RT1-DB1, Serpinb1a, TiR4, Tubb6 </td><td> Sistema Inmune </td></tr><tr><td> 15 a 30 veces </td><td> Adamtsl4, COL1A1, CRB3, DPT, Egfl3, Fbn1, FBLN1, FBLN5, FN1, ITGB4, Lama2, Lgals3bp, LOXL1, Mfap4, MMP14, Mmp23, PPIC, Serpinh1, TIMP3 </td><td> Matriz extracelular y uniones célula-célula </td></tr><tr><td> 15 a 30 veces </td><td> Cybrd1, Selenbp1, SLC2A4, Slc9a2, Slc13a3, Slc16a4, Slc22a8, Slc22a18 </td><td> Ion y homeostasis de solutos </td></tr><tr><td> 15 a 30 veces </td><td> AGPAT2, Bdh2, Cyp26b1, Lpar3, Ltb4dh, Olr1, PON3, RBP1, RBP4 </td><td> El ácido retinoico y procesamiento de los lípidos </td></tr><tr><td> 15 a 30 veces </td><td> ATF3, Dkk4, Eya2, Ifitm7, Ltbp1, Mustn1, Nr2f2, PTRF, Sphk1, TGFBI, Tcfap2b Tcea3, Wnt2b, Wnt5a, Zic1 </td><td> Desarrollo y regulación de la transcripción </td></tr><tr><td> 15 a 30 veces </td><td> Adamts12, Adamtsl3, C1r, Crispld2, Crygn, CYP1B1, DSE, ENPEP, Enpp2, Epn3, FLNA, FMO3, GNMT, Gprc5c, HSPB1, Klc3, KRT18, Krt19, MDK, Mesp1, Ms4a6a, Ms4a6b, Ms4a11, NET1, Pdlim2, Phactr2, PLP2, Ppp1r3b, Pqlc3, Rin3, SPAG11, SULT1A1, Tmem106a, Wfikkn2 </td><td> Desconocido y Otros </td></tr></tbody></table> * Los genes incluidos en la tabla debe ser tanto la expresión por encima de más de 15-veces en el cuerpo estriado y Parietal córtex y 5-veces por encima de los niveles de fondo. La menor de las dos relaciones (MAV / estriado o MAV / corteza parietal) para cada gen se utiliza para la agrupación. unos genes se encuentran en las células endoteliales sino también probablemente juegan un papel importante en la mediación de la respuesta inmune. Tabla 1. Los genes con un * 15-veces o más mayor expresión en MAV comparación con el cuerpo estriado y la corteza parietal.

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</ol>

No tenemos nada que revelar. El trabajo presentado aquí no necesariamente representan la opinión de la Administración de Alimentos y Drogas.

Aspectos técnicos de la MAV y disección del plexo coroideo Es crítico durante la disección de la MAV tener el cerebro &quot;sumergido&quot; la mayor parte del tiempo en la solución salina normal o de sodio salina tamponada con fosfato. Permitir que la MAV y la corteza para deshidratar durante la disección tendrá como resultado la MAV fuertemente adheridas a la capa cortical I. Esto aumentará la cantidad de tejido cortical cosechado con la MAV y / o resultar en la imposibilidad de eliminar estas secciones MAV adheridas de la corteza. Además, la paciencia es necesaria durante la disección. Una vez más, si uno encuentra cierta resistencia en la eliminación de la MAV de la corteza en un hemisferio durante la disección, cambie al otro hemisferio y volver más tarde para el lado donde la resistencia fue encontrado. Este método requiere algo de práctica para perfeccionar y requiere entre 5 y 15 disecciones de &quot;práctica&quot; antes de una cosecha constante uniforme de tejido MAV se logra. El método de iniciar la disección y removal de la MAV en el círculo arterial en la base del cerebro facilita la eliminación de las meninges mediante el uso de la vasculatura más grande como apoyo &quot;andamiaje&quot;. Gran parte de la sangre originalmente en la vasculatura MAV después del sacrificio debe ser expulsado durante la disección, y menos del 5% de la RNA cosechada de MAV deberán ser de origen arterial. Es posible eliminar casi toda la sangre perfundiendo el animal con 50 a 70 ml de solución salina, usando técnicas histológicas, antes de la decapitación y la extracción del cerebro. Sin embargo, es entonces mucho más difícil de visualizar los tejidos MAV durante la disección. Las tres fuentes más probables de &quot;contaminación&quot; de los tejidos MAV son la glándula pineal, la capa cortical I tejido y tejido residual bulbo olfatorio, pero también es posible obtener tejido de la glándula pituitaria en la preparación. Contaminación pineal en el MAV es detectado por el MAV que contiene una ronda 1 a 2 mm de diámetro esfera que es de color rojo oscuro coloreado. La función primariade la glándula pineal se considera normalmente ser completamente diferente de la MAV. Su función principal es la de producir melatonina, que regula los aspectos de la ritmo circadiano 9, y en lipoxigenación 10 de precursores lipídicos. Aunque el Lox gen, que regula la actividad de la lipoxigenasa, se pensó para estar presente en los adultos, principalmente en la glándula pineal 10, nuestros resultados indican que también es consistentemente presentes en niveles significativos en MAV. Residuales corticales o olfativo resultados bulbo de contaminación en el rosáceo en forma de banda de tejido que tiene algunas MAV 1 a 2 mm de los tejidos más densos que son mucho más pálida en color incluida en ella. Esto puede ser visto a &quot;flotar&quot; la MAV en la superficie del tampón, y luego eliminando los tejidos corticales más pesado o bombilla utilizando las dos pinzas de disección. Si la contaminación de la MAV de capa cortical I tejido, tejido hipotalámico o de la glándula pineal está presente, entonces varios genes tendrá un signifiexpresión significativamente mayor que la que normalmente está presente en una &quot;limpia&quot; la disección. La contaminación de la MAV con la glándula pineal resultará en una mayor expresión de arilalquilamina N-acetiltransferasa (AANAT) que es necesaria para la síntesis de melatonina. Desafortunadamente, si la contaminación pineal se produce durante la disección MAV, los niveles de LOX en MAV no será capaz de determinar con precisión. La contaminación de la MAV con el tejido cortical resultará en una mayor expresión de genes específicos de neuronas tales como hippocalcin (HPCA), parvalbúmina (Pvalb) y / o receptor de pentraxina neuronal (Nptxr). La contaminación de MAV con tejido hipotalámico dará lugar a la expresión más elevada de la hormona de crecimiento 1 (GH1), proopiomelanocortina (POMC). En el caso de que alguna contaminación existe en los tejidos cosechados, la mayoría de estos genes pueden ser identificados y no se utiliza en el análisis de la expresión génica. Esto es particularmente importante para los genes presentes en el blo circulanteod que todavía puede estar presente en MAV o plexo coroideo. Interpretting datos de expresión génica de MAV cosechada y plexo coroideo La superficie cerebral (superficial) vasculatura junto con meninges asociados (MAV) y el plexo coroideo son necesarias para que el flujo sanguíneo cerebral y líquido cefalorraquídeo (LCR) homeostasis 4,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. La cosecha de tejido es adecuado para el análisis bioquímico y fisiológico, y la MAV se ha mostrado sensible a los daños producidos por las anfetaminas y 1,2 hipertermia a través de análisis de expresión génica. Estos resultados son acordes con lo que también se conoce sobre la hipertermia severa y la exposición a las anfetaminas a la vasculatura del cerebro en general 18,19,20. Humanos de los datos clínicos apoya la creencia de que la vasculatura subdural es sensible a los daños por anfetamina y metanfetamina 21,22. Además, las vasculaturas cerebrales mayores y menores incluídoIng. las de la capa pial de las meninges que se cosechan en MAV son de interés potencialmente alto en la investigación de los tipos de trauma en la cabeza conmoción 23,24 25. El perfil de expresión génica de corriente producido a partir de la MAV indica que la pía madre y, posiblemente, las membranas meníngeas aracnoideas puede jugar un papel mayor que la esperada en la regulación de composición CSF. En el futuro, a través del uso de técnicas de microscopía de disección, puede ser posible para separar aún más los tejidos que comprenden la MAV modo que las membranas pial y la aracnoides se puede separar de la presente vasculatura arterial más grande y, posiblemente, una de la otra. Esto permitirá una mejor interpretación de la función de cada uno de estos 3 componentes de la MAV se recogieron.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo / equipo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Solución salina normal (9 gramos de solución salina / 1 litro de H 2 O) </td><td> En casa </td><td></td><td> Disección búfer </td></tr><tr><td> 0,1 M de fosfato de sodio pH 7,4 </td><td> En casa </td><td></td><td> Disección búfer </td></tr><tr><td> La gubia ósea </td><td> Roboz </td><td> RS-8300 </td><td> Cráneo de la eliminación de hueso </td></tr><tr><td> Pinzas de punta doblada-(4 &quot;de largo y 0,8 mm de ancho punta) </td><td> Roboz </td><td> RS-5135 RS o 5137- </td><td> Pinza de disección </td></tr><tr><td> Pinzas de punta-recto (5,5 &quot;de largo) </td><td> Roboz </td><td> RS-8124 RS o 8104- </td><td> Pinza del pulgar Dressing </td></tr></tbody></table>

una descripción visual de la disección de la vasculatura cerebral superficial y las meninges asociada y el plexo coroideo del cerebro de rata

A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain

Esta presentación en video fue creado para mostrar un método de recolección de las dos estructuras altamente vasculares más importantes, no residentes en el cerebro apropiada, que la función del cerebro anterior apoyo. Ellos son la superficie cerebral (superficial) vasculatura junto con meninges asociados (MAV) y el plexo coroideo que son necesarios para el flujo de sangre cerebral y líquido cefalorraquídeo (LCR) homeostasis. El tejido recogido es adecuado para el análisis bioquímico y fisiológico, y la MAV se ha mostrado sensible a los daños producidos por las anfetaminas y 1,2 hipertermia. A su vez, los vasculaturas cerebrales mayores y menores cosechadas en MAV son de interés potencialmente alto en la investigación de los tipos de conmoción trauma en la cabeza. El MAV diseccionado en esta presentación consiste en la pía madre y algunos de la aracnoides (menos dura) de las meninges y los vasos cerebrales superficie mayor y menor. El plexo coroideo diseccionado es la estructura que reside en el lateral ventrículos según lo descrito por Oldfield y McKinley 3,4,5,6. Los métodos utilizados para la recolección de estos dos tejidos también facilitar la recolección de tejido cortical regional desprovisto de meninges y mayor superficie de la vasculatura cerebral, y es compatible con la recolección de otros tejidos del cerebro tales como el cuerpo estriado, hipotálamo, hipocampo, etc La disección de los dos tejidos se lleva del total 5 a 10 minutos. Los niveles de expresión de genes para la MAV diseccionado y el plexo coroideo, como se muestra y describe en esta presentación se puede encontrar en GSE23093 (MAV) y GSE29733 (plexo coroideo) en el repositorio de NCBI GEO. Estos datos han sido y está siendo, utilizados para ayudar a comprender mejor el funcionamiento de la MAV y el plexo coroideo y la forma neurotóxica eventos tales como la hipertermia severa y AMPH adversamente afectar su función.

Esta presentación en video muestra un método de recolección de las dos estructuras altamente vasculares más importantes que apoyan la función del cerebro anterior. Ellos son la superficie cerebral (superficial) vasculatura junto con meninges asociados (MAV) y el plexo coroideo que son necesarios para el flujo de sangre cerebral y líquido cefalorraquídeo (LCR) homeostasis.

Una descripción visual de la disección de la vasculatura cerebral superficial y las meninges asociada y el plexo coroideo del cerebro de rata

Esta presentación en vídeo se creó para mostrar un método de obtención de las dos estructuras altamente vasculares más importantes que no se encuentran dentro del cerebro...

El objetivo general de este procedimiento es diseccionar de manera eficiente y rápida la capa externa y las porciones aracnoideas de las meninges y la vasculatura arterial asociada, que recubren la superficie de la corteza del prosencéfalo y del mesencéfalo, el tálamo y los cuerpos callosos, así como obtener el plexo coroideo de los ventrículos laterales. Esto se logra primero eliminando la glándula pineal y separando las meninges y los árboles arteriales adyacentes al prosencéfalo. En segundo lugar, se retiran cuidadosamente las arterias y arteriolas de la superficie cortical, comenzando en el círculo ventral de Willis y luego avanzando hacia las superficies corticales dorsales, de modo que la capa externa y las membranas aracnoideas restantes permanezcan adheridas a la vasculatura, asegurándose de minimizar la recolección de tejidos adyacentes de la superficie cortical.A continuación, se disecan la corteza y las fibras comisurales separándolas del septo y del hipocampo, exponiendo así los ventrículos laterales para permitir la extracción del plexo coroideo. Finalmente, se extrae el hipocampo, exponiendo el tálamo y los cuerpos del mesencéfalo. Luego se diseca la meninge y la vasculatura asociada que recubren esta región.En última instancia, la integridad y especificidad de las meninges disecadas y la vasculatura arterial asociada, así como del plexo coroideo, pueden determinarse comparando los perfiles de expresión génica de cada una de estas regiones. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en investigaciones relacionadas con la vascularización que sustenta la función cerebral. Incluye similitudes, comparaciones y diferencias en la función del plexo coroideo frente a las meninges y su vasculatura arterial asociada con respecto al flujo sanguíneo, la función del LCR, los daños neurotóxicos y el trauma cerebral.Para comenzar este protocolo, coloque los cerebros recién extraídos de ratas inmediatamente después de que fueron sacrificadas en solución salina normal fría con hielo durante cinco minutos. Es importante permitir que el cerebro se enfríe durante este tiempo antes de la disección, para que las cuatro meninges cerebrales y la vasculatura arterial asociada o MAV puedan separarse de la superficie de la corteza. A continuación, coloque el cerebro en el fondo de una placa de Petri de vidrio sobre hielo con un centímetro de solución salina normal fría con hielo o solución tampón de fosfato sódico 0,1 molar a un pH de 7,4.La disección debe realizarse con el cerebro, en su mayor parte, sumergido en solución salina. Para comenzar la disección, coloque el cerebro con la cara dorsal hacia arriba en la placa de Petri y localice la glándula pineal, que se encuentra en la región ventral más caudal entre los dos hemisferios. Justo por delante del cerebelo y justo debajo, o en la superficie de las meninges.Sobre los colículos. Retire la glándula pineal utilizando dos pinzas pequeñas con punta curva. Tenga en cuenta que la glándula pineal es de color rosa, similar a la corteza, pero a menudo está rodeada por restos de sangre y vasos sanguíneos residuales provenientes de la extracción del cerebro.A continuación, gire el cerebro boca abajo en la placa de Petri. Luego separe la arteria vertebral y las arterias más pequeñas y las meninges que cubren la protuberancia del resto de las meninges y la vasculatura del prosencéfalo. A continuación, comience la eliminación del MAV.Es importante comenzar ventralmente en el proceso de disección con las arterias principales del círculo de Willis, las arterias cerebrales medias y las arterias anteriores. A continuación, comenzando por cualquiera de los hemisferios, utilice pinzas con punta curva pequeña para seccionar la arteria comunicante posterior justo posterior a la unión de la carótida interna, separando así los árboles arteriales más anteriores y posteriores del prosencéfalo. Luego repita el mismo procedimiento para el hemisferio contralateral.Ahora, sujetando la AVM y la arteria anterior con la pinza, tire suavemente en dirección anterior dorsal para que la MAV que cubre la corteza anterior ventral se levante sobre y alrededor del tracto olfativo. Esto elimina gran parte de la MAV que cubre la corteza anterior. Gire el cerebro en un ángulo de 45 a 90 grados respecto a la placa de Petri, de modo que las regiones laterales más anteriores de la MAV que rodean las regiones corticales laterales puedan separarse de la corteza; sujete la AVM y las arterias asociadas y tire suavemente en dirección dorsal a lo largo de la corteza.Si es necesario, se pueden usar los extremos de la pinza para levantar y liberar las arterias principales de la corteza durante la disección. Ahora, retire las regiones laterales más posteriores del MAV. Tenga en cuenta que es recomendable alternar de un hemisferio a otro durante este proceso de extracción para asegurar que el MAV permanezca frío e hidratado; también cambie de hemisferio si encuentra alguna resistencia al liberar el MAV de la corteza.Finalmente, para eliminar las regiones más dorsales de la MAV que rodean la corteza somatosensorial primaria y la corteza motora, gire el cerebro con el lado dorsal hacia arriba para separar esta sección del cerebro, utilizando las puntas de la pinza a lo largo del seno sagital. Esta porción de la MAV obtenida puede mantenerse temporalmente en solución salina fría con hielo hasta que sea necesaria para pruebas y análisis, o puede congelarse para su posterior procesamiento. A menudo, la MAV que cubre las regiones corticales posteriores más caudales permanece adherida.Su eliminación se muestra en una sección posterior de este video. Para retirar el plexo coroideo, coloque primero el cerebro con el lado dorsal hacia arriba y sostenlo en su lugar con la pinza grande. Luego, introduzca la pinza más pequeña hacia abajo a través de la línea media entre los hemisferios y utilice sus puntas para perforar la corteza y el cuerpo calloso hasta llegar a la parte superior de la línea media del hipocampo.A continuación, utilice la pinza para separar la corteza con el cuerpo calloso del hipocampo dorsal y el septum, exponiendo así la mayor parte del ventrículo lateral. El plexo coroideo puede localizarse e identificarse mediante la línea roja ondulada que delimita la arteria principal que recorre su longitud. Utilice los dos extremos de la pinza para separar las paredes laterales del tercer ventrículo y ampliarlo en su extremo más inferior.Luego, utilizando la pinza pequeña, tire de este extremo del plexo coroideo para liberarlo. A continuación, use la pinza para agrandar la región anterior situada entre el septum y la región del putamen caudado y libere también el plexo coroideo por este extremo. Realice asimismo el mismo procedimiento en el hemisferio contralateral para obtener el segundo plexo coroideo restante.De nuevo, este tejido puede mantenerse temporalmente en hielo, solución salina fría, o congelarse para su procesamiento posterior. Para eliminar el MAV restante que cubre las regiones coddle más posteriores de la corteza, primero retire por completo el hipocampo de ambos hemisferios, exponiendo así el MAV sobre el tálamo y los colículos. Tenga en cuenta que la eliminación de esta porción del MAV será mucho menos difícil que su eliminación de la corteza para el MAV restante.Al asir la vasculatura más grande que recubre la porción anterior del tálamo y tirar suavemente de la codilla, esta vasculatura se conecta con la red supraoculomotora y suministra sangre a la red del hipocampo dorsal y del tálamo dorsal. Tire suavemente hacia afuera y eventualmente se liberará la red supraoculomotora, permitiendo así alcanzar las últimas porciones del círculo arterial de la codilla. En este punto, se debe tener mayor cuidado para eliminar cualquier MAV restante en la superficie de las cortezas primarias granulares retros lineales, auditivas y visuales.Cualquier MAV cortical ventral posterior restante cosechada con esta segunda sección de MAV tálamo y cuerpos callosos debe eliminarse y añadirse a la primera sección de MAV cortical diseccionada si se van a analizar por separado. A continuación, para comparar los perfiles de expresión génica entre el estriado, la corteza parietal y las regiones de MAV en condiciones control, se puede realizar un análisis de expresión génica utilizando matrices oligonucleotídicas Agilent 0 1 4 8 7 9 de genoma completo de rata, cuatro por 44.060 mer. Se pueden encontrar más detalles sobre el procesamiento, escaneo y almacenamiento inicial de datos en Thomas et al.Cuando la disección se realiza correctamente, los tejidos de MAV resultantes deben consistir en dos entidades intactas que pesen aproximadamente entre 35 y 45 miligramos en total. El MAV inicialmente disecado que rodea la mayor parte de la corteza debe pesar aproximadamente 25 miligramos, y el que cubre el tálamo, los cuerpos callosos y la corteza occipital debe pesar alrededor de 15 miligramos.El tejido debe tener un color ligeramente rosado debido a la sangre residual en la vasculatura. El plexo coroideo bilateral cosechado debe estar en dos muestras de tejido intactas, cada una pesando de uno a dos miligramos, como se observa aquí. Aquí vemos una comparación de los perfiles de expresión génica en el estriado, la corteza parietal y el MAV bajo condiciones control.El gráfico superior muestra la expresión en el estriado en comparación con la corteza parietal. Mientras que el gráfico inferior muestra la expresión en el MAV en comparación con la corteza parietal, puede observarse que el estriado y la corteza parietal están mucho más estrechamente relacionados entre sí que el MAV. Aquí se muestra la expresión diferencial de genes en el MAV en respuesta a la hipertermia en comparación con el control, en respuesta a la anfetamina en comparación con el control, y en hipertermia versus anfetamina.Por último, aquí observamos genes con una expresión mayor a 15 veces en el MAV en comparación con la corteza parietal y el estriado, caracterizados por su función. Muchos de estos genes están relacionados con el sistema vascular y/o el sistema inmunitario. Otros genes con cambios de expresión muy elevados son proteínas de la matriz extracelular, transportadores de saute, y genes implicados en el metabolismo de lípidos y del ácido retinoico.Al intentar este procedimiento, es importante recordar ser paciente durante la disección de la VMA. También es fundamental mantener el cerebro sumergido en solución salina isotónica o en solución salina tamponada con fosfatos durante toda la disección. Asimismo, se recomienda practicar la sección de la VMA en cuatro o cinco ratas antes de obtener tejidos para generar datos experimentales.

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Una descripción visual de la disección de la vasculatura cerebral superficial y las meninges asociada y el plexo coroideo del cerebro de rata (Video) | JoVE Journal

Una descripción visual de la disección de la vasculatura cerebral superficial y las meninges asociada y el plexo coroideo del cerebro de rata

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