Immunoprecipitation cromatina eficiente utilizando limitación de las cantidades de biomasa

El objetivo general del siguiente experimento es detectar la unión de proteínas de unión al ADN, como los factores de transcripción, o sus modificaciones de cálculos. Esto se logra preparando primero la cromatina como segundo paso. Se establece una reacción de inmunoprecipitación de cromatina para derribar fragmentos de ADN unidos a la proteína de interés.

A continuación, el fragmento de ADN unido a la proteína de interés se amplifica mediante PCR. Se obtienen resultados que muestran un enriquecimiento de pliegues del fragmento de ADN unido a la proteína de interés en comparación con una región no unida basada en el análisis de QPCR. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la transcripción, la cromatina y la epigenética, como cuándo y dónde están presentes diferentes proteínas modificadas o no modificadas.

Sin embargo, sobre el ADN, este método puede proporcionar información sobre la regulación de los genes de las células T. También se puede aplicar a otros sistemas como linfocitos B, muestras de leucemia y líneas de células inmortalizadas. La cromatina para este experimento se preparará a partir de células T CD cuatro ingenuas esplénicas de ratón.

Para comenzar este procedimiento, agregue 37% de formaldehído a una concentración final de 1% a la suspensión de células T CD cuatro en DMEM y mueva suavemente a temperatura ambiente durante 15 minutos. Esto reticulará los complejos de proteínas del ADN. Detenga la reticulación agregando un molar de glicina a una concentración final de 125 milimolares.

Continúe meciendo durante cinco minutos a temperatura ambiente. Recoja las células por centrifugación a 200 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en cinco mililitros de PBS helado que contenga inhibidores de la proteasa, vuelva a centrifugar, lave las células de esta manera durante un total de tres veces después del lavado final, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en un mililitro de tampón de lisis celular helada que contenga inhibidores de la proteasa.

Transfiera la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitros e incube en hielo durante 15 minutos. Recoja los núcleos por centrifugación a 200 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Deseche cuidadosamente el sobrenadante, vuelva a suspender los núcleos en 500 microlitros de lisis nuclear.

Tampón que contiene inhibidores de la proteasa se incuba en hielo durante 15 minutos. A continuación, sonique las células con una sonda de 1,6 milímetros y un nivel de salida de cuatro sonicas durante 15 segundos. Enfríe la muestra en hielo durante uno o dos minutos para evitar el sobrecalentamiento y vuelva a sonicular durante 15 segundos.

Repita la sonicación y el enfriamiento durante un total de cuatro veces centrifugar, la cromatina sónica a 16.000 G durante cinco minutos. A cuatro cuatro grados centígrados. Recoja el sobrenadante transparente en un nuevo tubo de microcentrífuga.

Retirar una alícuota de 20 microlitros de sobrenadante transparente. Añadir colorante de carga de ADN y comprobar el ADN sonicado por electroforesis a través de un gel agro al 2%. El tamaño ideal del ADN sonicado para la mayoría de las aplicaciones es de 200 a 500 pares de bases.

Por último, determine la concentración de ADN utilizando un espectrofotómetro UV. La cromatina cortada puede utilizarse inmediatamente para establecer una reacción de inmunoprecipitación de cromatina o almacenarse a 80 grados centígrados negativos para la inmunoprecipitación de cromatina o diluir la cromatina sonicada en chips a una concentración de ADN de cinco a 10 microgramos por mililitro en un volumen total de dos mililitros en tampón de dilución de chips con inhibidores de la proteasa. Todos los pasos de este procedimiento deben llevarse a cabo a cero o cuatro grados centígrados.

Ahorre un 10%, que es 200 microlitros en este ejemplo de la cromatina sonicada diluida como entrada, almacene en hielo la alícuota de la muestra restante 450 microlitros en cada uno de los cuatro tubos de microview de 1,7 mililitros etiquetados como control de isotipo y anticuerpo de interés. Si se utilizan varios anticuerpos del mismo isotipo, bastará con un único control de isotipo Para realizar este análisis, se añadan de dos a cinco microgramos de anticuerpo específico en función de la especificidad del anticuerpo utilizado o del control del isotipo a los tubos respectivos. Agite los tubos durante la noche a cuatro grados centígrados para permitir la formación de complejos de anticuerpos contra la cromatina a la mañana siguiente.

Agregue 25 microlitros de perlas magnéticas de proteína G a cada mezcla y mecine durante al menos dos horas a cuatro grados centígrados. A continuación, coloque los tubos de fuga en un soporte magnético durante 15 a 20 segundos para permitir que las cuentas se acumulen en el lado magnetizado. Retire con cuidado la solución por aspiración sin alterar las perlas.

Agregue un mililitro de solución de lavado baja en sal y balancee suavemente durante cinco minutos sobre el mutador. Recoja las perlas con el soporte magnético y retire la solución de lavado. Agregue un mililitro de solución de lavado baja en sal nuevamente y mueva suavemente durante cinco minutos.

Después de quitar la solución de lavado con bajo contenido de sal, agregue un mililitro de solución de lavado con alto contenido de sal y recoja durante cinco minutos. Recoja las perlas con el soporte magnético y retire la solución de lavado. Repita el lavado con la solución de lavado con alto contenido de sal.

Una vez que retire la solución de lavado con alto contenido de sal, agregue un mililitro de solución de lavado de cloruro de litio y recoja durante cinco minutos. Recoja las perlas con el soporte magnético y retire la solución de lavado. Repita el lavado con cloruro de litio una vez.

Agregue un mililitro de solución de TE y recocine durante cinco minutos. Recoja las perlas con el soporte magnético y retire la solución de lavado. Eluir el ADN de las cuentas añadiendo 250 microlitros de roca tampón eluciana durante 15 minutos a temperatura ambiente.

Pipetea el EIT y guarda este material en un nuevo tubo de fuga de 1,7 milímetros. Repita una vez más y combine ambos elu, deseche las cuentas para invertir los enlaces cruzados. Añadir al ADN eludido cinco molares de cloruro de sodio hasta una concentración final de 0,3 molar y un microlitro de ARN.

A añadir 400 microlitros de tampón de elución a las entradas guardadas anteriormente. Para hacer el volumen de 500 microlitros a cada entrada, agregue cloruro de sodio a 0.3 molar, un microlitro de ARN, 10 microlitros de EDTA 0.5 molar, 20 microlitros de un molar tris, HCL pH 6.5 y un microlitro de proteinasa K.Selle los tubos e incube durante la noche a 65 grados Celsius en un bloque de calentamiento seco a la mañana siguiente, Deje que los tubos se enfríen a temperatura ambiente. Luego agregue un mililitro de etanol al 100% e incube durante dos horas o toda la noche a menos 80 grados centígrados.

Para precipitar la centrífuga de ADN, los tubos a 16, 000 G durante 15 minutos. Para pellet el lavado de ADN, el pellet de ADN una vez con 70%etanol y secado al aire, el pellet resuspende, el pellet de ADN en 100 microlitros de agua destilada en autoclave, purifica el ADN usando kayak, columnas de centrifugado rápido y eluye en un volumen total de 50 microlitros de tampón de elución. Este ADN ya está listo para su uso en la amplificación por PCR.

El análisis de las reservas de QPCR para obtener un enriquecimiento completo en una región de control no ligada es el aspecto más importante de este protocolo. Con el software QPCR, vaya al editor y marque los pocillos que contienen muestras de entrada de varias diluciones con sus valores de curva estándar. También etiquete los pocillos con muestras de chips desconocidos exactamente como está dispuesta la placa de PCR.

El uso de una curva estándar para interpolar las cantidades de ADN en las muestras específicas e isotipos desconocidas permite la evaluación y el emparejamiento de la calidad y la eficiencia de todos los conjuntos de cebadores en el rango de concentraciones encontradas en las muestras. Vaya al editor de subconjuntos y marque los subconjuntos, incluidos los pocillos con muestras de entrada, así como las muestras de chips desconocidas. Las muestras desconocidas se cuantificarán utilizando la curva estándar generada a partir de las concentraciones conocidas de las muestras de entrada para el análisis.

Una vez completada la amplificación por PCR, realice el análisis con ABS quant. Segunda derivada máx. Seleccione el subconjunto para el análisis y presione. Bien.

Presione calcular, que generará la curva estándar utilizando las concentraciones conocidas de muestras de entrada y mostrará la cantidad absoluta de ADN presente en las muestras desconocidas si la calidad del ADN she es buena y si los cebadores se unen específicamente a la región objetivo, la eficiencia de la PCR debe ser cercana a dos. Realice un análisis de curva de fusión con TM llamando al mismo subconjunto si está disponible. Un solo pico indica que solo se amplificó un producto específico.

La amplificación de ADN específico también se puede probar mediante electro el producto PCR, junto con la escalera de ADN a través de un gel AROS. A continuación, los datos obtenidos se exportan como un archivo de texto delimitado por tabulaciones, que se puede abrir en Microsoft Excel para su posterior análisis. Divida la cantidad de ADN para el anticuerpo específico con el control de isotipo para cebadores específicos.

Repita este paso para los cebadores de la región de control. Si se utilizan múltiples anticuerpos del mismo isotipo para diferentes inmunoprecipitaciones, normalice cada uno de ellos con los valores del mismo isotipo control. Además, si se utilizan varios pares de cebadores dirigidos, se deben utilizar las cantidades de ADN de un único conjunto de reparación de cebadores de control para la normalización de cada objetivo.

Los valores de salida representan el enriquecimiento del pliegue de inmunoprecipitación de anticuerpos específicos en cada ubicación en relación con el anticuerpo inespecífico Antecedentes de inmunoprecipitación Divida el enriquecimiento del pliegue para cebadores dirigidos con el enriquecimiento del pliegue para cebadores de la región de control para obtener el enriquecimiento en relación con una región de control no unida. Es importante destacar que debido a la generación de curvas estándar con ADN de entrada total para cada muestra, cada uno de los valores de inmunoprecipitación interpolados del estándar ya están normalizados y expresados como la fracción de entrada total por el software de la máquina. El protocolo de inmunoprecipitación de cromatina demostrado aquí controla las diferencias, si las hay, en la cantidad de ADN utilizada en la PCR mediante el uso de un par de cebadores que amplifica una región no unida del genoma, sirviendo así como control de carga.

En este ejemplo, la región codificante del gen de la beta actina del ratón se utilizó como una región no unida a la proteína de interés y el factor de transcripción y el sitio de unión a la grasa en el ratón, el promotor de IL dos se utilizó como región objetivo. Esta instantánea de una hoja de cálculo de Excel muestra el uso del protocolo de cálculo descrito en los datos de análisis de tres repeticiones experimentales en los cuadros de color amarillo, verde y morado con tres réplicas técnicas. Cada uno se utilizó para calcular el enriquecimiento de pliegues.

El enriquecimiento relativo de una proteína unida a diferentes regiones del genoma se puede comparar si se elige el mismo conjunto de control de isotipo y anticuerpos específicos. Si la especificidad del anticuerpo es buena, normalmente se observa un enriquecimiento de dos a diez veces sobre la región de control no unida. Esta figura muestra los resultados de un experimento de chip con células T CD cuatro convencionales y células T CD cuatro reguladoras aisladas de ratones.

Una pequeña fracción de células T convencionales se estimuló con PMA y micina iónica durante 30 minutos. Se observó un enriquecimiento relativo de los factores de transcripción de NFA, N grasa C uno y NFA C dos en el promotor de IL dos y se representa aquí como un enriquecimiento de pliegues sobre una región no unida Siguiendo este procedimiento. Otros métodos, como ChIP-seq, se pueden utilizar para abordar la ocupación global de factores de transcripción o los cambios globales en las marcas epigenéticas en respuesta a un estímulo.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar la inmunoprecipitación de cromatina utilizando un número limitado de células y analizar los datos de QPCI para determinar el bandeo del factor de transcripción en comparación con una región de control no unida.