Name: Immunoprecipitation cromatina eficiente utilizando limitación de las cantidades de biomasa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 29 s
Description: Aprende a realizar inmunoprecipitación de cromatina eficiente en células T primarias con muestras limitadas. Este método optimizado permite detectar interacciones proteína-ADN y modificaciones de histonas con alta sensibilidad.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado por el NIH subvenciones CA141009 y GM39067. Agradecemos a E. Parnell y R. Yarrington los comentarios sobre la parte escrita.

1. Aislamiento de ratón esplénica ingenuo CD4 de células T <ol><li> Sacrificar el ratón de una manera humana en consonancia con los protocolos de uso del Comité (IACUC) Institucional Cuidado de Animales y. Disección del bazo y colóquelo en un plato de Petri que contiene 10 ml de DMEM con 10% de SFB. </li><li> Machacar el bazo usando extremos helados de dos placas de vidrio para liberar los esplenocitos. Transferir la suspensión celular en un tubo cónico de 15 ml. </li><li> Recoger las células por centrifugación a 200 xg (~ 1200 rpm para una centrífuga clínica con un diámetro típico del rotor) durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Resuspender las células en 2 ml de tampón ACK para lisar las células rojas de la sangre, 1 min a temperatura ambiente (RT). Detener la reacción mediante la adición de 8 ml de DMEM con FBS al. </li><li> Recoger las células por centrifugación a 200 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Resuspender las células en 5 ml de DMEM que contenía FBS y pasar a través de un filtro de malla de 70 micras (BD Falcon, Cat # 352350). Contar las células y procederpara el aislamiento de células T CD4 + naïve utilizando un kit de aislamiento de CD4 (Miltenyi, Cat # 130-095-248) utilizando las instrucciones del fabricante. Recoger ingenuos células T CD4 por centrifugación a 200 xg durante 5 min a 4 ° C. Resuspender las células en 10 ml de DMEM con FBS al. </li></ol> 2. Preparación de la cromatina <ol><li> Añadir 37% de formaldehído a una concentración final de 1% a la suspensión celular en DMEM y agite con cuidado a temperatura ambiente (por ejemplo, utilizando un Nutator) durante 15 min para reticular complejos ADN: proteína. </li><li> Deja de reticulación mediante la adición de 1 M de glicina a una concentración final de 125 mM. Continuar a la roca durante 5 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Recoger las células por centrifugación a 200 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Lavar las células mediante resuspensión en 5 ml de inhibidores de proteasas que contienen PBS enfriado con hielo. Lavar con inhibidores de la proteasa que contienen helado de PBS 3 veces en total y recoger las células por centrifugación a 4 ° C. </li><li> Resuspender las células en 1 mltampón de lisis celular de hielo frío que contiene inhibidores de la proteasa. Incubar en hielo durante 15 min. La eficiencia de la lisis de las células se puede determinar mediante la resuspensión de una pequeña alícuota de las células en solución de azul de tripano al 0,4% (Sigma, Cat # T8154) y la observación con un microscopio. </li><li> Recoger los núcleos por centrifugación a 200 xg (normalmente ~ 1200 rpm) durante 5 min a 4 ° C. Elimine con cuidado el sobrenadante. </li><li> Resuspender los núcleos en 500 l de tampón de lisis nuclear que contiene inhibidores de la proteasa. Incubar en hielo durante 15 min. </li><li> Sonicar las células por medio de un aparato de ultrasonidos Misonix 3000, tamaño de la sonda 1,6 mm: Nivel de salida 4, 15 seg ráfaga, 4 veces en el hielo. Cada muestra debe ser enfriado en hielo durante 1-2 minutos antes de la sonicación de nuevo para evitar el sobrecalentamiento de las muestras. El recalentamiento puede causar la reversión de enlaces cruzados. </li><li> Centrifugar la cromatina sometida a ultrasonidos a 16.000 xg (~ 13.200 rpm en una microcentrífuga) durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Tomar una alícuota de 20 l supern claraatant, añadir colorante de carga de ADN y comprobar el ADN sonicado por electroforesis a través de un gel de agarosa al 2% (tamaño ideal de ADN sonicado para la mayoría de aplicaciones es de 200-500 pb). </li><li> Determinar la concentración de ADN utilizando un espectrofotómetro UV. Cromatina esquilada se puede utilizar inmediatamente para establecer la reacción de inmunoprecipitación de cromatina y se almacenan a -80 ° C. Normalmente se obtiene 7,5-10 g de ADN 2-3 x 10 6 células T CD4 purificadas por ratón. </li></ol> 3. Inmunoprecipitación de cromatina (Todos los pasos deben llevarse a cabo a 0-4 º C) <ol><li> Diluir sonicated cromatina a una concentración de ADN de mg / ml 5-10 (volumen total = 1 ml) en tampón de dilución chip con los inhibidores de la proteasa. </li><li> Guardar 100 l (10%) como entrada. Almacenar en hielo. </li><li> Alícuota de 450 l cada uno en dos tubos de microcentrífuga de 1,7 ml etiquetados como control de isotipo (IgG de conejo o ratón) y anticuerpo de interés. Si se utilizan múltiples anticuerpos del mismo isotipo, una sola contr isotipool será suficiente para realizar este análisis. Usted tendrá múltiples controles de isotipo si se utilizan anticuerpos de una fuente animal diferente o isotipo. </li><li> Añadir 2-5 g de anticuerpo específico, dependiendo de la especificidad del anticuerpo usado, o control de isotipo a los tubos respectivos. </li><li> Roca los tubos utilizando un Nutator durante la noche a 4 ° C para permitir la formación de complejos de la cromatina-anticuerpo. </li><li> Añadir 25 l de perlas de proteína G magnéticos (01:01 emulsión de gránulos en suspensión) a la mezcla anterior y permitir a la roca durante al menos 2 horas a 4 ° C. Cuentas de nuestro proveedor se puede utilizar directamente. </li><li> Coloque los tubos de microcentrífuga en un soporte magnético y permiten que las perlas se recogen en la parte magnetizada. </li><li> Retire con cuidado la solución por aspiración sin molestar a los granos. </li><li> Añadir 1 ml de solución de lavado bajas sal y deje mecer suavemente durante 5 min en un Nutator. Recoger las perlas usando un soporte magnético y eliminar la solución de lavado. Repetir una vez.</li><li> Añadir 1 ml de solución de lavado de sal y se deja mecer por 5 min en una Nutator. Recoger las perlas usando el soporte magnético y eliminar la solución de lavado. Repetir una vez. </li><li> Añadir 1 ml de solución de lavado de cloruro de litio y permitir a la roca durante 5 minutos en una Nutator. Recoger las perlas usando el soporte magnético y eliminar la solución de lavado. Repetir una vez. El uso de LiCl mejora la eliminación eficaz de las interacciones no específicas de cromatina con las perlas. </li><li> Añadir 1 ml de solución de TE y se deja mecer por 5 min en una Nutator. Recoger las perlas usando el soporte magnético y eliminar la solución de lavado. </li><li> Eluir el ADN a partir de las perlas mediante la adición de 250 l de tampón de elución. Roca durante 15 minutos a temperatura ambiente. Pipetear fuera el líquido eluido y guardar este material en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,7 ml. Repetir una vez más y se combinan tanto las elusiones. Deseche las cuentas. </li><li> Para invertir las reticulaciones añaden 5 M de NaCl a una concentración final de 0,3 M y 1 l de RNasa A (20 m<html> g / ml) al ADN eluido. Añadir 400 l de tampón de elución a las entradas guardadas en la etapa 3.2, para hacer que el volumen de 500 l. Para las entradas de añadir NaCl hasta 0,3 M, 1 l de RNasa A, 10 l de EDTA 0,5 M, 20 l de 1 M Tris-HCl, pH 6,5 y 1 l de proteinasa K (20 mg / ml). </li><li> Incubar los tubos durante la noche a 65 ° C en un bloque de calentamiento en seco. Para evitar la evaporación de las muestras, sello o colocar un peso en los tubos para evitar que se abra. Un horno de hibridación también se puede utilizar. </li><li> Deje enfriar los tubos a temperatura ambiente. Añadir 1 ml de etanol al 100% y se incuba 2 horas-durante la noche a -80 ° C para precipitar el ADN. </li><li> Centrifugar los tubos a 16.000 xg durante 15 min para sedimentar el ADN. Lavar el sedimento de ADN una vez con etanol al 70% y secado al aire el sedimento. Resuspender el sedimento de ADN en 100 l de agua destilada tratada en autoclave. </li><li> Purificar ADN utilizando columnas QIAquick Spin y eluyen en el volumen total de 50 l de tampón de elución. Este ADN está listo para su uso para la PCR. </li></ol>&quot;&gt; 4. Preparación de la reacción de PCR (Todos los pasos deben llevarse a cabo en el hielo) <ol><li> Recoge todas las muestras de ADN de muestras de entrada y chip correspondiente. También, recoger todos los reactivos y cebadores para la región objeto de PCR, así como una región de control. Use un &quot;hotstart&quot; Taq ADN polimerasa. Vamos a utilizar un ensayo basado en SYBR Green-para cuantificar la amplificación de ADN en este procedimiento, pero los kits qPCR Mastermix se puede utilizar si es necesario. </li><li> Hacer una dilución en serie de ADN de entrada para generar una curva estándar en el análisis de qPCR: por ejemplo, 10%, 1%, 0,1% y 0,01% en tampón de elución (de las columnas QIAquick Spin en el paso 3,18). El grado de concentración y aumento de la plantilla conjunto curva estándar pueden variar en función de los niveles esperados de enriquecimiento chip, etc dispensación 10 l de muestras de ADN de entrada en los respectivos pocillos de una placa de 96 pocillos (Genemate, cat # T-3182-1 ), por duplicado. </li><li> Dispensar 10 ml de ADN de chip de control de isotipo, así como anticuerpos específicos en la respectivapozos, por triplicado. </li><li> Hacer una &quot;mezcla maestra&quot; que contiene cualquiera de los cebadores o cebadores de control de destino (0,1 mM concentración final de cada cebador) y prescindir de 10 l en pocillos respectivos. Por ejemplo, en la plantilla a continuación dispensar maestro de la mezcla que contiene cebadores específicos en los pocillos marcado en verde y dispensar la mezcla principal con cebadores de control en los pocillos marcados en rojo. </li><li> Cubrir la placa de PCR con película de sellado plástico óptico y centrifugar a 500 xg en una centrífuga clínica (~ 1200 rpm) durante 1 min a temperatura ambiente para recoger todo lo que en la parte inferior del pozo. </li><li> Inicie la reacción de PCR. Vamos a utilizar el LightCycler 480 II (Roche) que operan LightCycler 480SW 1.5 software para ejecutar la qPCR en este ejemplo. </li></ol> Pre-incubación: 1 ciclo de: 95 º C / 5 min. Amplificación: 40 a 45 ciclos de: 94 º C / 5 seg, 60 ° C / 5 seg, 72 ° C/10 seg (temperatura de hibridación debe ser 2-3 º C inferior a la temperatur fusióne de los cebadores). Curva de fusión: 1 ciclo. Enfriamiento: 1 ciclo. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> La </td><td> 10% de entrada </td><td> 10% de entrada </td><td> Isotipo </td><td> Específico </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> B </td><td> 1% de entrada </td><td> 1% de entrada </td><td> Isotipo </td><td> Específico </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td&gt; <td></td><td></td></tr><tr><td> C </td><td> 0,1% de entrada </td><td> 0,1% de entrada </td><td> Isotipo </td><td> Específico </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> D </td><td> 0,01% de entrada </td><td> 0,01% de entrada </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> E </td><td> 10% de entrada </td><td> 10% de entrada </td><td> Isotipo </td><td> Específico </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> F </td><td> 1% de entrada </td><td> 1% de entrada </td><td> Isotipo </td><td> Específico </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> T </td><td> 0,1% de entrada </td><td> 0,1% de entrada </td><td> Isotipo </td><td> Específico </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> H </td><td> 0,01% de entrada </td><td> 0,01% de entrada </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Verde: Use cebadores de la región objetivo. Rojo: Use cebadores de la región de control. 5. Análisis <ol><li> Programa de software de la qPCR para la cuantificación de la cantidad absoluta de ADN. Es importante destacar que, el uso de una curva estándar para interpolar las cantidades de ADN en las muestras específicas y isotipo desconocidos permite la evaluación y la congruencia de la calidad y la eficiencia de todo el cebador se pone sobre la gama de concentraciones que se encuentran en las muestras. Por otra parte, también proporciona una mortalidade método fiable para convertir los valores Cq (C t o C p) a los resultados de enriquecimiento veces en relación finales que los métodos usingΔΔCq y afines. </li><li> Ir al editor de la muestra y marcar los pocillos que contienen muestras de entrada de varias diluciones (10%, 1%, 0,1% y 0,01%) con sus valores de la curva estándar. También etiquetar los pocillos con muestras de chip desconocidos, tal y como la placa de PCR se presenta. En el software equivalente utilizado en otras máquinas qPCR, designar subconjuntos correspondientes a las reacciones de cada par de cebadores, valor de la curva estándar y la muestra experimental y control de isotipo correspondiente. </li><li> En el software LightCycler, ir al editor de subconjunto y marcar los subconjuntos incluyendo los pocillos con muestras de entrada, así como las muestras de chip desconocidos. Las muestras desconocidas se cuantificaron utilizando la curva estándar generada a partir de las concentraciones conocidas de muestras de entrada para el análisis. En el software equivalente utilizado en otras máquinas qPCR, designado subconjuntos corresponding a todas las reacciones para cada uno de los pares de cebadores. </li><li> Después de la amplificación por PCR es completa, realizar el análisis con &quot;Abs Quant/2nd Derivado Max&quot; y seleccionar el subconjunto de análisis y pulse Aceptar. En el software equivalente utilizado en otras máquinas qPCR, convertir el valor Cq a la cantidad de ADN en cada subgrupo. </li><li> Pulse &quot;Calcular&quot;, que va a generar la curva estándar utilizando concentraciones conocidas de las muestras de entrada y mostrará la cantidad absoluta de ADN presente en las muestras desconocidas. </li><li> Si la calidad del ADN cizallado es buena, y si los cebadores se unen específicamente a la región objetivo, la eficiencia de PCR debe estar cerca de 2. </li><li> Realizar un análisis de la curva de fusión con &quot;Tm Calling&quot; para el mismo subconjunto, si está disponible. Un único pico indica que sólo un producto específico se amplificó. La amplificación de ADN específico también se puede probar mediante electroforesis del producto de PCR junto con escalera de ADN a través de un gel de agarosa. </li><li> Exportar datos como por tabuladoresarchivo de texto delimitado, que se puede abrir en Microsoft Excel para su posterior análisis. </li><li> Utilizando Microsoft Excel, divida la cantidad de ADN para el anticuerpo específico con el control de isotipo de primers específicos. Repita este paso para los cebadores de la región de control. Si se utilizan múltiples anticuerpos del mismo isotipo para diferentes inmunoprecipitaciones, normalizar cada uno de estos con los valores de la misma control de isotipo. Por otra parte, si se utilizan múltiples pares de cebadores específicos, las cantidades de ADN de un único par de cebadores de control de conjunto se deben utilizar para la normalización de cada objetivo (Figuras 1 y 2). Los valores de salida representan el anticuerpo inmunoprecipitación veces enriquecimiento específico en cada ubicación con respecto a los anticuerpos no específicos fondo inmunoprecipitación. </li><li> Divida el enriquecimiento veces (al isotipo control) de primers específicos con el enriquecimiento veces (al isotipo control) de cebadores de la región de control para obtener el enriquecimiento relativo a unregión no unida de control (Figura 1). Es importante destacar que, en cuenta que debido a la generación de las curvas de calibración con el total de ADN de entrada para cada muestra, cada uno de los valores interpolados a partir de inmunoprecipitación por encima de las curvas estándar ya están normalizados a, y se expresaron como, la fracción del total de entrada por el software de la máquina. </li><li> Si el rigor de los tampones utilizados para la inmunoprecipitación o lavado es demasiado alta, es posible que se observó amplificación robusta a partir de muestras inmunoprecipitadas con anticuerpos específicos, mientras que la amplificación del control de isotipo inmunoprecipitó no se observaron muestras. En tal escenario, es mejor que restar la cantidad de chip de control de isotipo de chip de anticuerpos específicos tanto para la región específica y la región no unida. Enriquecimiento relativo puede calcularse dividiendo la diferencia de la región de orientación por diferencia de región no unida (Figura 3). </li></ol>

<ol><li>Weinmann, A. S., Bartley, S. M., Zhang, T., Zhang, M. Q., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+chromatin+immunoprecipitation+to+clone+novel+E2F+target+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Use of chromatin immunoprecipitation to clone novel E2F target promoters.</a> Molecular and Cellular Biology. 21, 6820-6832 (2001).</li>
<li>Weinmann, A. S., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+unknown+target+genes+of+human+transcription+factors+using+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Identification of unknown target genes of human transcription factors using chromatin immunoprecipitation.</a> Methods. 26, 37-47 (2002).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+nuclear+localization+of+NFAT+in+Foxp3%2B+regulatory+T+cells+independent+of+calcineurin+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Constitutive nuclear localization of NFAT in Foxp3+ regulatory T cells independent of calcineurin activity.</a> J. Immunol. 188, 4268-4277 (2012).</li>
<li>Shakya, A., Kang, J., Chumley, J., Williams, M. A., Tantin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oct1+is+a+switchable%2C+bipotential+stabilizer+of+repressed+and+inducible+transcriptional+states%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Oct1 is a switchable, bipotential stabilizer of repressed and inducible transcriptional states.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286, 450-459 (2011).</li>
<li>Dahl, J. A., Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+micro+chromatin+immunoprecipitation+assay+%28microChIP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP).</a> Nature Protocols. 3, 1032-1045 (2008).</li>
<li>Lubelsky, Y., Macalpine, H. K., Macalpine, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+localization+of+replication+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide localization of replication factors.</a> Methods. 57, 187-195 (2012).</li>
<li>O'Neill, L. P., VerMilyea, M. D., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+characterization+of+the+early+embryo+with+a+chromatin+immunoprecipitation+protocol+applicable+to+small+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations.</a> Nature Genetics. 38, 835-841 (2006).</li>
<li>Sikes, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+streamlined+method+for+rapid+and+sensitive+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A streamlined method for rapid and sensitive chromatin immunoprecipitation.</a> Journal of Immunological Methods. 344, 58-63 (2009).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147, 1408-1419 (2011).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+structure+and+organization+of+eukaryotic+pre-initiation+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes.</a> Nature. 483, 295-301 (2012).</li>
<li>Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+analysis+of+ChIP-seq+experiments+for+DNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins.</a> Nature Biotechnology. 26, 1351-1359 (2008).</li>
<li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+profiles+of+STAT1+DNA+association+using+chromatin+immunoprecipitation+and+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing.</a> Nature Methods. 4, 651-657 (2007).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El protocolo anterior proporciona un método robusto de cuantificar con precisión enriquecimiento de ADN a partir de linfocitos primarios que utilizan chip. Una de las principales razones de robustez en este protocolo es la inclusión de repeticiones biológica. El protocolo anterior utiliza tres repeticiones, el enriquecimiento de la cual se calcula de forma independiente. Las salidas se promedian para proporcionar un grado de enriquecimiento y las desviaciones estándar calculadas para proporcionar una medida de la variab...

<table><tbody><tr><td>Formaldehído</td><td>Sigma</td><td>F-8775</td><td>Tienda en RT</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td>Store en 4 & deg; </td></tr><tr><td>C Inhibidor de la proteasa comprimidos Roche</td><td></td><td>04693116001</td><td>Store a 4 & deg; C</td></tr><tr><td>Proteína G perlas magnéticas</td><td>Active Motif 101945</td><td></td><td>Almacenar en 4 &deg; C</td></tr><tr><td>RNasa A (20 mg/ml)</td><td>EMD Millipore</td><td>556746</td><td>Almacenar a -20 & grados; C</td></tr><tr><td>Proteinasa K (20 mg/ml)</td><td>Roche</td><td>03115879001</td><td>Disolver en 50 mM de Tris-HCl, 10 mM de CaCl2, pH 8.0</td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA Polymerasa</td><td>Invitrogen</td><td>10966-034</td><td>Almacenar a -20 & grados; C</td></tr><tr><td>SYBR Verde I</td><td>Invitrogen</td><td>S7567</td><td>Tienda a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>1 M Glicina</td><td></td><td></td><td>Almacene en el</td></tr><tr><td>tampón de lisis celular RT (5 mM Tuberías, pH 8.0; 85 mM KCl; 0.5% NP-40)</td><td></td><td></td><td>Almacene a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>Tampón de lisis nuclear (50 mM Tris, pH 8,1; 10 mM EDTA; 1% SDS)</td><td></td><td></td><td>Almacenar en</td></tr><tr><td>RT Tampón de dilución ChIP (0,01% SDS; 1,1% Triton X-100; 1,2 mM EDTA; 16,7 mM Tris pH 8,1; 190 mM NaCl)</td><td></td><td></td><td>Almacenar a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>Tampón de lavado con baja sal (0,1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8,1; 150 mM NaCl)</td><td></td><td></td><td>Almacenar a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>Tampón de lavado con alto contenido de sal (0,1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8,1; 600 mM de NaCl)</td><td></td><td></td><td>Almacenar a 4 & grados; </td></tr><tr><td>Tampón de lavado C LiCl (0,25 M LiCl; 1% NP-40; 1% Desoxicolato de sodio, 1 mM EDTA; 10 mM Tris pH 8,0)</td><td></td><td></td><td>Almacenar a 4 grados; </td></tr><tr><td>Tampón C TE (10 mM Tris, pH 7.4, 1 mM EDTA)</td><td></td><td></td><td>Almacenar a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>Tampón de elución (1% SDS; 0,1 M NaHCO3)</td><td></td><td></td><td>Preparar fresco</td></tr><tr><td>5 M de NaCl</td><td></td><td></td><td>Almacenar en RT</td></tr><tr><td>0,5 M Almacén de EDTA</td><td></td><td></td><td>en RT</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 6,5</td><td></td><td></td><td>Almacenar en RT</td></tr><tr><td colspan="4">Tabla de Reactivos Específicos</fuerte></td></tr><tr><td>Clay Adams Marca Nutator</td><td>Becton Dickinson</td><td>Modelo: 421105</td><td></td></tr><tr><td>Soporte magnético</td><td>Promega</td><td>Z5342</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick PCR Kit de purificación</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Masonix Sonicator 3000</td><td>QSonica</td><td>Modelo: S3000</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro UV</td><td>NanoDrop Technologies</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Bloque calefactor</td><td>VWR</td><td>13259-030</td><td></td></tr><tr><td>Rotador</td><td>VWR</td><td>80085-692</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada de sobremesa</td><td>Beckman Coulter</td><td>Modelo: Microcentrífuga Allegra X-12R</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5415 D</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Mesa de equipos </td></tr></tbody></table>

immunoprecipitation cromatina eficiente utilizando limitación de las cantidades de biomasa

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Cromatina immunoprecipitation (CHIP) es un método ampliamente utilizado para la determinación de las interacciones de las diferentes proteínas con el ADN en la cromatina de las células vivas. Los ejemplos incluyen la secuencia específica de unión al ADN, histonas factores de transcripción y sus diferentes estados de modificación, enzimas tales como polimerasas de ARN y factores auxiliares, y los componentes de reparación del ADN. A pesar de su ubicuidad, hay una falta de up-to-date, metodologías detalladas, tanto para la preparación del banco de material y para un análisis preciso permitir mediciones cuantitativas de interacción. Debido a esta falta de información, y también porque, como cualquier inmunoprecipitación, las condiciones deben ser re-optimizado para los nuevos conjuntos de condiciones experimentales, el chip de ensayo es susceptible a resultados imprecisos o mal cuantitativa. Nuestro protocolo se deriva en última instancia del trabajo seminal en el factor de transcripción: interacciones ADN 1,2, pero incorpora una serie de mejoras a la sensividad y la reproducibilidad de difíciles a obtener tipos de células. El protocolo se ha utilizado con éxito 3,4, tanto utilizando qPCR para cuantificar enriquecimiento de ADN, o el uso de una variante semi-cuantitativa de la siguiente protocolo. Este análisis cuantitativo de material amplificado por PCR se realiza computacionalmente, y representa un factor limitante en el ensayo. Controles y otras consideraciones importantes incluyen el uso de un anticuerpo de isotipo, así como la evaluación de una región de control del ADN genómico, tal como una región intergénica predicho no estar obligado por la proteína en estudio (o no anticipado para mostrar los cambios en virtud las condiciones experimentales). Además, una curva estándar de material de entrada para cada muestra de chip se utiliza para obtener los niveles máximos absolutos de enriquecimiento en el material experimental. El uso de las curvas de calibración ayuda a tener en cuenta las diferencias entre los conjuntos de cebadores, sin importar lo cuidadosamente que están diseñados, así como la eficiencia de diferentescias en todo el rango de concentraciones de la plantilla para un solo grupo de cebadores. Nuestro protocolo es diferente a otros que están disponibles en el 5-8 que cubrimos ampliamente la fase posterior análisis.

La inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) de protocolo que aquí se presenta controles de las diferencias, en su caso, de la cantidad de ADN utilizado en la PCR mediante el uso de un par de cebadores que amplifica una región no unida del genoma, lo que sirve como un &quot;control de carga&quot;. En el ejemplo mostrado en la Figura 3, se ha utilizado la región de codificación del gen Actb ratón como una región no unida a nuestra proteína de interés y el sitio de unión del factor de transcripción...

Se describe un método robusto para la inmunoprecipitación de la cromatina utilizando células T primarias. El método se basa en los enfoques estándar, pero utiliza un conjunto específico de condiciones y reactivos que mejoran la eficiencia de unas cantidades limitadas de células. Es importante destacar que, se presenta una descripción detallada de la fase de análisis de datos.

Immunoprecipitation cromatina eficiente utilizando limitación de las cantidades de biomasa

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

El objetivo general del siguiente experimento es detectar la unión de proteínas que se unen al ADN, como los factores de transcripción, o sus modificaciones epigenéticas. Esto se logra primero preparando la cromatina como segundo paso. Se realiza una reacción de inmunoprecipitación de cromatina para aislar fragmentos de ADN unidos a la proteína de interés.A continuación, el fragmento de ADN unido a la proteína de interés se amplifica mediante PCR. Se obtienen resultados que muestran el enriquecimiento relativo del fragmento de ADN unido a la proteína de interés en comparación con una región no unida, según el análisis de QPCR. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la transcripción, la cromatina y la epigenética, como cuándo y dónde están presentes diferentes proteínas modificadas o no modificadas.En el ADN, aunque este método puede proporcionar información sobre la regulación génica en linfocitos T, también puede aplicarse a otros sistemas, como linfocitos B, muestras de leucemia y líneas celulares inmortalizadas. La cromatina para este experimento se preparará a partir de linfocitos T naïve CD4 esplénicos de ratón.Para comenzar este procedimiento, agregue formaldehído al 37 % a una concentración final del 1 % a la suspensión de linfocitos T CD4 en DMEM y agite suavemente a temperatura ambiente durante 15 minutos. Esto entrecruzará los complejos de ADN y proteínas. Detenga el entrecruzamiento agregando glicina 1 M a una concentración final de 125 milimolares.Continúe agitando durante cinco minutos a temperatura ambiente. Recopile las células mediante centrifugación a 200 G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Retire el sobrenadante y re suspenda las células en cinco mililitros de PBS frío con inhibidores de proteasas; centrifugue nuevamente. Lave las células de esta manera un total de tres veces. Después del último lavado, deseche el sobrenadante y re suspenda las células en un mililitro de tampón de lisis celular frío que contenga inhibidores de proteasas.Transfiera la suspensión celular a un tubo microcentrífugo de 1,7 mililitros e incube en hielo durante 15 minutos. Recopile los núcleos mediante centrifugación a 200 G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Descarte cuidadosamente el sobrenadante y resuspenda los núcleos en 500 microlitros de lisado nuclear.Tamponar con inhibidores de proteasas e incubar en hielo durante 15 minutos. A continuación, sonicar las células utilizando una sonda de 1,6 milímetros y un nivel de salida de cuatro durante 15 segundos. Enfriar la muestra en hielo durante uno o dos minutos para evitar el sobrecalentamiento y sonicar nuevamente durante 15 segundos.Repita la sonicación y enfriamiento un total de cuatro veces. Centrifugue el cromatina sonicado a 16.000 G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Recopile el sobrenadante claro en un nuevo tubo microcentrífugo.Retire una alícuota de 20 microlitros del sobrenadante claro. Añada colorante de carga para ADN y verifique el ADN sonicado mediante electroforesis en un gel de agarosa al 2%. El tamaño ideal del ADN sonicado para la mayoría de las aplicaciones es de 200 a 500 pares de bases.Finalmente, determine la concentración de ADN utilizando un espectrofotómetro UV. El cromatina fragmentado se puede utilizar inmediatamente para establecer una reacción de inmunoprecipitación de cromatina o almacenarse a 80 grados Celsius negativos para inmunoprecipitación de cromatina o chip; diluya el cromatina sonicado hasta una concentración de ADN de cinco a 10 microgramos por mililitro en un volumen total de dos mililitros en tampón de dilución para chip con inhibidores de proteasas. Todos los pasos de este procedimiento deben realizarse a entre cero y cuatro grados Celsius.Guarde el 10 %, que en este ejemplo equivale a 200 microlitros de la cromatina sonicada diluida como muestra de entrada, y coloque en hielo el resto de la alícuota. Distribuya 450 microlitros en cada uno de cuatro tubos microcentrífugos de 1,7 mililitros etiquetados como control de isotipo y anticuerpo de interés. Si se utilizan múltiples anticuerpos del mismo isotipo, un único control de isotipo será suficiente. Para realizar este análisis, agregue de dos a cinco microgramos del anticuerpo específico, según la especificidad del anticuerpo utilizado, o del control de isotipo, a los tubos respectivos. Incube los tubos con agitación suave durante la noche a cuatro grados Celsius para permitir la formación de complejos cromatina-anticuerpo. Al día siguiente por la mañana.Añada 25 microlitros de perlas magnéticas de proteína G a cada mezcla y agite durante al menos dos horas a cuatro grados Celsius. A continuación, coloque los tubos de centrífuga en un soporte magnético durante 15 a 20 segundos para permitir que las perlas se acumulen en el lado magnetizado. Retire cuidadosamente la solución por aspiración sin perturbar las perlas.Añada un mililitro de solución de lavado con baja salinidad y agite suavemente durante cinco minutos en el mutador. Recoja las perlas utilizando el soporte magnético y elimine la solución de lavado. Añada nuevamente un mililitro de solución de lavado con baja salinidad y agite suavemente durante cinco minutos.Después de eliminar la solución de lavado con baja salinidad, agregue un mililitro de solución de lavado con alta salinidad y agite durante cinco minutos. Recoja las perlas utilizando el soporte magnético y elimine la solución de lavado. Repita el lavado con la solución de lavado con alta salinidad.Una vez eliminada la solución de lavado con alta salinidad, añada un mililitro de solución de lavado con cloruro de litio y agite durante cinco minutos. Recoja las perlas utilizando el soporte magnético y elimine la solución de lavado. Repita el lavado con cloruro de litio una vez más.Añada un mililitro de solución TE y agite durante cinco minutos. Recoja las perlas utilizando el soporte magnético y elimine la solución de lavado. Eluya el ADN de las perlas añadiendo 250 microlitros de tampón de elución y agitando durante 15 minutos a temperatura ambiente.Aspire el EIT y guarde este material en un nuevo tubo fuge de 1,7 milímetros. Repita una vez más y combine ambos eluidos, deseche las perlas para revertir los enlaces cruzados. Añada al ADN eluido cloruro de sodio 5 molar hasta una concentración final de 0,3 molar y un microlitro de RNAsa.Añada 400 microlitros de tampón de elución a las muestras de entrada guardadas previamente. Para ajustar el volumen a 500 microlitros en cada muestra de entrada, agregue cloruro de sodio hasta una concentración final de 0,3 M, un microlitro de ARN, 10 microlitros de EDTA 0,5 M, 20 microlitros de Tris-HCl 1 M pH 6,5 y un microlitro de proteinasa K. Selle los tubos e incúbelos toda la noche a 65 grados Celsius en un bloque calefactor seco. A la mañana siguiente, deje que los tubos se enfríen a temperatura ambiente. Luego, añada un mililitro de etanol al 100 % e incube de dos horas a toda la noche a -80 grados Celsius.Para precipitar el ADN, centrifugar los tubos a 16.000 G durante 15 minutos. Para lavar el precipitado de ADN, lavar el pellet una vez con etanol al 70 %, secarlo al aire, luego resuspender el pellet de ADN en 100 microlitros de agua destilada autoclavada, purificar el ADN utilizando columnas rápidas kayak y eluir en un volumen total de 50 microlitros de tampón de elución. Este ADN ya está listo para su uso en la amplificación por PCR.El análisis de los residuos de QPCR para obtener un enriquecimiento completo respecto a una región de control no ligada es el aspecto más importante de este protocolo. Mediante el software de QPCR, acceda al editor y marque los pocillos que contienen muestras de entrada de diversas diluciones con sus valores de la curva patrón. Asimismo, etiquete los pocillos con muestras desconocidas de chip exactamente como esté dispuesta la placa de PCR.El uso de una curva estándar para interpolar las cantidades de ADN en las muestras desconocidas específicas y de isotipo permite evaluar y comparar la calidad y eficiencia de todos los conjuntos de cebadores en el rango de concentraciones encontrado en las muestras. Vaya al editor de subconjuntos y marque los subconjuntos, incluyendo los pocillos con muestras de entrada, así como las muestras desconocidas del chip. Las muestras desconocidas se cuantificarán utilizando la curva estándar generada a partir de las concentraciones conocidas de las muestras de entrada para el análisis.Una vez completada la amplificación por PCR, realice el análisis con cuantificación ABS. Máximo de la segunda derivada. Seleccione el subconjunto para el análisis y presione Aceptar.Pulse calcular, lo que generará la curva estándar utilizando las concentraciones conocidas de las muestras de entrada y mostrará la cantidad absoluta de ADN presente en las muestras desconocidas si la calidad del ADN es buena y si los cebadores se unen específicamente a la región diana; la eficiencia de la PCR debería ser cercana a dos. Realice un análisis de curva de disociación con determinación de TM para el mismo subconjunto, si está disponible. Un solo pico indica que solo se amplificó un producto específico.La amplificación de ADN específico también se puede comprobar mediante electroforesis del producto de PCR, junto con la escalera de ADN, en un gel AROS. Los datos obtenidos luego se exportan como un archivo de texto delimitado por tabulaciones, que puede abrirse en Microsoft Excel para su análisis posterior. Divida la cantidad de ADN para el anticuerpo específico entre el control de isotipo para los cebadores dirigidos.Repita este paso para los cebadores de la región control. Si se utilizan múltiples anticuerpos del mismo isotipo para diferentes inmunoprecipitaciones, normalice cada uno de ellos con los valores obtenidos del control del mismo isotipo. Además, si se utilizan múltiples pares de cebadores dirigidos, las cantidades de ADN de un único conjunto de cebadores control deben utilizarse para la normalización de cada diana.Los valores de salida representan el enriquecimiento específico de la inmunoprecipitación de anticuerpos en cada ubicación en relación con la inmunoprecipitación de fondo con anticuerpo no específico; divida el enriquecimiento de los cebadores dirigidos entre el enriquecimiento de los cebadores de la región control para obtener el enriquecimiento relativo a una región control no ligada. Es importante tener en cuenta que, debido a la generación de curvas estándar con el ADN total de entrada para cada muestra, cada uno de los valores de inmunoprecipitación interpolados a partir de la curva estándar ya están normalizados y expresados por el software de la máquina como una fracción del total de entrada. El protocolo de inmunoprecipitación de cromatina mostrado aquí controla las diferencias, si las hubiera, en la cantidad de ADN utilizada en la PCR mediante el uso de un par de cebadores que amplifica una región no ligada del genoma, sirviendo así como control de carga.En este ejemplo, se utilizó la región codificante del gen de la actina beta de ratón como una región no unida a la proteína de interés, y se utilizó el sitio de unión del factor de transcripción y de grasas en el promotor de IL-2 de ratón como región diana. Esta imagen de una hoja de cálculo de Excel muestra la aplicación del protocolo de cálculo descrito en el análisis de datos provenientes de tres repeticiones experimentales, indicadas en los recuadros coloreados en amarillo, verde y morado, cada uno con tres réplicas técnicas. Cada uno de ellos se utilizó para calcular el enriquecimiento relativo.El enriquecimiento relativo de una proteína unida a diferentes regiones del genoma puede compararse si se elige el mismo conjunto de anticuerpos de control de isotipo y anticuerpos específicos. Si la especificidad del anticuerpo es buena, típicamente se observa un enriquecimiento de dos a diez veces respecto a la región de control no unida. Esta figura muestra los resultados de un experimento de chip con linfocitos T CD4 convencionales y linfocitos T reguladores CD4 aislados de ratones. Se estimuló una pequeña fracción de linfocitos T convencionales con PMA e ionomicina durante 30 minutos. Se observó un enriquecimiento relativo de los factores de transcripción NFA, NfatC1 y NFA-C2 en el promotor de IL-2, lo cual se representa aquí como enriquecimiento relativo frente a una región no ligada tras seguir este procedimiento. Otros métodos, como ChIP-seq, pueden utilizarse para analizar la ocupación global de factores de transcripción o los cambios globales en marcas epigenéticas en respuesta a un estímulo.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la inmunoprecipitación de cromatina utilizando un número limitado de células, y de cómo analizar los datos de QPCI para determinar la formación de bandas del factor de transcripción en comparación con una región de control no ligada.

efficient-chromatin-immunoprecipitation-using-limiting-amounts

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

La diferenciación de ESC coincide con los cambios de tipo de células específicas en la estructura y composición de la cromatina. La detección de los cambios proporciona información valiosa sobre los mecanismos que definen stemcellness y la diferenciación celular. Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) representa un método valioso para diseccionar los mecanismos moleculares que subyacen a la diferenciación de células madre.

Inmunoprecipitación de la cromatina de células estaminales embrionarias humanas

Este video describe el protocolo para el ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), que es una técnica clásica para demostrar las interacciones proteína-ADN. Esta técnica se utiliza para identificar genes diana en células de leucemia linfocítica crónica humana.

Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina: una técnica para estudiar las interacciones proteína-ADN en células

La combinación de inmunoprecipitación de la cromatina y la secuenciación de ultra-alto rendimiento (chip-ss) puede identificar y mapear las interacciones proteína-ADN en un tejido o línea celular dada. Contorno es cómo generar una plantilla de chip de alta calidad para la posterior secuenciación, utilizando la experiencia con el factor de transcripción TCF7L2 como un ejemplo.

Generación de Plantilla ADN Immunoprecipitation cromatina alta calidad para la secuenciación de alto rendimiento (chip-ss)

Las interacciones ADN-proteína son esenciales para múltiples procesos biológicos. Durante la evaluación de las funciones celulares, el análisis de las interacciones ADN-proteína es indispensable para la comprensión de la regulación de genes. La inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) es una poderosa herramienta para analizar tales interacciones in vivo.

Análisis del promotor de ligandos c-KIT usando inmunoprecipitación de cromatina

Presentamos un protocolo basado en la filtración para aislar núcleos de alta calidad a partir de músculo esquelético de ratón reticulado en el que eliminamos la necesidad de ultracentrifugación, haciéndolo fácilmente aplicable. Mostramos que la cromatina preparada a partir de los núcleos es adecuada para la inmunoprecipitación de la cromatina y probables estudios de secuenciación con inmunoprecipitación de la cromatina.

Un método basado en la filtración para preparar núcleos de alta calidad a partir de músculo esquelético reticulado para inmunoprecipitación de cromatina

Aquí, describimos una inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) y el protocolo de preparación de biblioteca de ChIP-seq para generar perfiles de epigenómica global de muestras embrionarias de pollo baja abundancia.

Cromatina (ChIP) de la inmunoprecipitación protocolo para muestras embrionarias baja abundancia

Se presenta un nuevo protocolo para la preparación de la cromatina de músculo esquelético de ratón adulto adaptado al estudio de la regulación de los genes en las fibras musculares por inmunoprecipitación de cromatina.

Protocolo de mejora para la inmunoprecipitación de cromatina de músculo esquelético de ratón

Se trata de un método para identificar nuevas proteínas DNA-que obran recíprocamente en lugares geométricos específicos, basándose en la captura de la secuencia específica de cromatina reticular para análisis proteómicos posteriormente. No se requiere ningún conocimiento previo sobre posibles proteínas, ni modificaciones de la célula. Inicialmente desarrollado para la levadura, la tecnología ahora se ha adaptado para células de mamífero.

Adaptación de la hibridación de captura de las proteínas asociadas a cromatina para proteómica a células de mamíferos

Aquí se describe un protocolo para la inmunoprecipitación de cromatina eficiente (ChIP), seguido por secuenciación de ADN de alto rendimiento (ChIP-seq) de tejido adiposo marrón (BAT) aislado de un ratón. Este protocolo es conveniente para el mapeo de modificaciones de las histonas e investigar localización de genoma no histona proteínas de interés en vivo.

Inmunoprecipitación de cromatina del tejido adiposo marrón murino

La inmunoprecipitación por cromatina (ChIP) es una poderosa herramienta para comprender los mecanismos moleculares de la regulación genética. Sin embargo, el método implica dificultades para obtener fragmentación de cromatina reproducible mediante cizallamiento mecánico. Aquí, proporcionamos un protocolo mejorado para un ensayo ChIP usando digestión enzimática.

Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina utilizando nucleasas microcócticas en células de mamíferos

Este protocolo se centra en la preparación de cromatina a partir de tejidos congelados a presión y es adecuado para la inmunoprecipitación de cromatina reticulada (X-ChIP) seguida de un análisis cuantitativo de PCR (X-ChIP-qPCR) o enfoques de secuenciación de próxima generación (X-ChIP-seq).

Extracción de cromatina del tejido hepático quimérico congelado para el análisis de inmunoprecipitación de la cromatina

Aprende a realizar inmunoprecipitación de cromatina eficiente en células T primarias con muestras limitadas. Este método optimizado permite detectar interacciones proteína-ADN y modificaciones de histonas con alta sensibilidad.

Immunoprecipitation cromatina eficiente utilizando limitación de las cantidades de biomasa

Explorar más videos