En Vivo microinyección y electroporación del mouse Testis

Este artículo describe la microinyección y electroporación de testículo de ratón in vivo como una técnica de transfección de células de ratón testiculares para estudiar procesos únicos de la espermatogénesis. El protocolo presentado implica etapas de preparación capilar de vidrio, microinyección a través del conducto eferente, y transfección por electroporación.

El objetivo de este procedimiento es realizar la microinyección de construcciones genéticas en el testículo del ratón, seguida de electroporación InVivo. Esto permite la realización de análisis genéticos exhaustivos con el enfoque en la espermatogénesis y la función testicular. Esto se logra primero accediendo a los testículos a través de una incisión abdominal directamente encima de las glándulas PrepU.

El segundo paso es preparar el conducto eferente adjunto a los testículos para la microinyección liberando el vaso de su tejido graso. A continuación, se perfora el conducto otorrinolaringólogo con una pipeta de microinyección cargada y se administra la solución de construcción genética de la tinción a los túbulos feroces testiculares. El paso final es la transfección multilateral del testículo por electroporación.

En última instancia, el testículo transfectado se extrae después de tres días para evaluar la transfección mediante microscopía de fluorescencia o mediante mediciones luminométricas, dependiendo de las construcciones genéticas utilizadas informadas. Esta combinación de la técnica de operación del intelecto por microinyección para los testículos de ratón como métodos de transfección transitoria sin duda proporcionará muchas ventajas sobre los enfoques existentes como los animales transgénicos o los ratones knockout. Garantiza un rendimiento rápido, un bajo costo y la necesidad de habilidades técnicas moderadas.

Es de esperar que este enfoque metodológico se adapte a la técnica disponible en el campo de la investigación de la fertilidad masculina. Podría ser esencialmente útil para abordar un amplio espectro de cuestiones relacionadas con los genis experimentales y los procesos de fertilidad. Esto sería particularmente posible cuando se utiliza este método para el análisis genético en forma de experimentos de ganancia de todos los experimentos de pérdida de función.

Presumiblemente, también será muy útil para investigar elementos reguladores de, por ejemplo, genes específicos de la espermatogénesis. Para comenzar el procedimiento, anestesia a un ratón macho de seis a ocho semanas de edad con una mezcla uno a uno de 10% de ketamina y 2% de xilacina por vía subcutánea. Luego, asegúrese de que el ratón esté bajo anestesia profunda pellizcando los dedos de los pies.

Aplícale ungüento en los ojos para evitar la sequedad. A continuación, retire el vello abdominal con una afeitadora eléctrica y desinfecte la zona quirúrgica después. Haga una incisión ventral directamente sobre las glándulas PrepU en el centro del área abdominal.

Para ello, tira de la piel y realiza una pequeña incisión cutánea transversal. Luego continúe a lo largo de la capa muscular abdominal. Levante las almohadillas de grasa abdominal con cuidado para exponer los testículos adheridos y colóquelos sobre un papel estéril en el abdomen.

A continuación, utilice un microscopio estereoscópico para encontrar el conducto ORL para la microinyección. Es la unión de vasos finos entre el testículo y el epidídimo, y se encuentra adyacente a la arteria testicular. Retire el tejido graso que cubre el conducto otorrinolaringólogo con pinzas finas.

Después de eso, coloque el conducto de liberación en una tira de papel estéril, asegurándose de que el conducto sea fácilmente visible sin dañar el entorno. Más adelante, conecte la pipeta de microinyección, que se ha cargado anteriormente con la solución de plásmido coloreada, a la unidad de inyector del micromanipulador. Después de eso, coloque la aguja de microinyección paralela al conducto EENT con la punta apuntando hacia el REIT testículo.

A continuación, utilice unas pinzas finas para pelar el conducto sobre la pipeta de microinyección. Asegúrese de que la pipeta se mantenga en paralelo al conducto mientras tira de él. Dirija la aguja con cuidado hacia el testículo y deténgase justo cuando penetre en el testículo REIT directamente debajo de la túnica albugínea.

A continuación, configure los parámetros del microinyector. Posteriormente, comience a inyectar la solución de construcción génica. Controle todo el proceso de inyección observando el estado de llenado de los testículos.

Con la ayuda de la solución de plásmido coloreada, construya el testículo solo hasta dos tercios de su volumen. Para permitir una electroporación efectiva. Remoje los electrodos de la pinza en un PBS de una vez para garantizar una conductancia adecuada.

A continuación, apriete ligeramente la prueba entre los electrodos húmedos y mida la resistencia eléctrica con el electro parata. A continuación, configure el electro adecuadamente asegurándose de que se pueda aplicar corriente a los testículos con un número total de ocho pulsos cuadrados. En cuatro sitios diferentes de testículos, realice la electroporación de manera integral alrededor de todo el testículo.

Una vez finalizada la electroporación, vuelva a colocar los testículos en el abdomen lo más cerca posible de su ubicación original. Por lo tanto, la capa muscular interna era una sutura quirúrgica absorbible. A continuación, cierre la piel con clips de sutura.

Permita que el ratón se recupere de la anestesia. En una caja estéril calentada en una almohadilla térmica a 37 grados centígrados, preparada con algunas toallas de papel. La almohadilla debe asegurar el calentamiento de solo la mitad de la jaula, creando un gradiente de calor.

Además, cubra el mouse con otra hoja de toalla de papel para reducir aún más el estrés. Después de que el animal se despierte por completo, transfiéralo a una jaula nueva y completamente equipada. Pero más recuperación, monitoree el proceso de recuperación hasta que finalmente devuelva el ratón a la instalación de animales.

Esta figura muestra los testículos completos de Mount tres días después de la electroporación in vivo por detección de fluorescencia, los testículos transfectados de un ratón C 57 negro seis muestran una proteína fluorescente verde mejorada o una proteína fluorescente roja mostrada. Estas son las secciones histológicas de un testículo. Tres días después de la electroporación unilateral con PE eeg, FPC uno, las células tubarias seminíferos transfectadas se ilustran con fluorescencia verde, junto con su estructura típica organizada esféricamente.

Sus núcleos eran de contratinción con dos pro tres en azul. Mientras realiza este procedimiento, es importante tener en cuenta que los procesos de identificación del conducto otorrinolaringológico y su liberación de su tejido graso son bastante sofisticados. Por lo tanto, puede practicar primero con animales muertos antes de lograr una experiencia real en vivo.

Después del procedimiento anti de la electroporación por microinyección y la recolección de prueba final, se pueden realizar muchas técnicas como Q-R-T-P-C-R y Western blot. Por lo tanto, la xining del gen tester son patrones de expresión de proteínas, así como modificaciones postraduccionales es un hecho. Por lo tanto, por medio de estas herramientas, se podría atacar una gran variedad de temas, como la espermatogénesis, por ejemplo, con sus complejos mecanismos y regulaciones subyacentes.