Lengua electrónica Generar Patrones reconocimiento continuo para el análisis de proteínas

El objetivo general del siguiente experimento es construir una lengua electrónica basada en un enfoque combinatorio y realizar imágenes de plasma de superficie y resonancia para el análisis de proteínas. Esto se logra utilizando lactosa y lactosa sulfatada como bloques de construcción y depositando sus mezclas en la superficie dorada de un prisma para su autoensamblaje y crear una matriz de receptores combinatorios de reactividad cruzada. Como superficie de segundo paso, se aplican imágenes de plasma y resonancia, que monitorean los eventos de unión en tiempo real y producen imágenes SPR y una serie de curvas de unión cinética llamadas gramos de sensores.

A continuación, el procesamiento de datos se lleva a cabo en base a los gramos del sensor utilizando un software de computación matemática con el fin de crear un perfil de evolución continua en 2D y un paisaje de evolución continua en 3D para cada muestra, los resultados muestran que la lengua electrónica es capaz de generar distintos paisajes de evolución continua en 3D para proteínas purificadas comunes, y es eficiente para su discriminación basada en el reconocimiento de patrones. Esta técnica tiene varias ventajas sobre los métodos existentes como la gnosis clásica y electrónica y las lenguas. En primer lugar, la preparación de los receptores de canto se simplifica en gran medida.

Se puede optar por una gran diversidad de receptores reactivos cruzados mezclando un pequeño número de moléculas. En segundo lugar, gracias al enfoque combinatorio, los patrones de reconocimiento generados por nuestra lengua electrónica pueden considerarse continuos, por lo que las señales anormales pueden identificarse más fácilmente. Por lo tanto, se puede obtener un análisis más confiable para preparar la matriz combinatoria de receptores reactivos cruzados.

Primero, limpie la superficie dorada del prisma 48 horas antes de usarlo con un limpiador de plasma durante tres minutos con 75% de oxígeno, 25% de argón, 0,6 milibares y 40 vatios de potencia. A continuación, prepare 100 mililitros de solución tampón de fosfato que contenga un 10% de glicerol o PBSG. La adición de glicerol al PBS es muy importante para reducir la evaporación del solvente y los cambios en el bloque de construcción o la concentración de BBB después de la deposición.

A continuación, prepare soluciones madre de lactosa o bloque de construcción uno y lactosa sulfatada, o bloque de construcción dos de las soluciones madre. Prepare 11 soluciones puras y mezcladas con proporciones entre cero y 100% en incrementos de 10% y una concentración total de bloques de construcción de 0,1 milimolares en PBSG, deposite ocho gotas de nanolitros de estas soluciones puras y mezcladas en la superficie del prisma utilizando un observador sin contacto en un duplicado cuádruple para cada proporción con 44 puntos en total, coloque el prisma dentro de una placa de Petri que contenga un mililitro de agua ultrapura y déjelo toda la noche a temperatura ambiente para el automontaje de BB uno y BB two en la superficie de oro aquí. Se supone que la composición media de la superficie en las monocapas autoensambladas mixtas refleja la composición de la solución mixta de deposición.

Al día siguiente, lave bien el prisma con agua ultrapura antes de secarlo con un chorro de Argonne. Ajuste la incubadora en la que se colocan los aparatos de imágenes de resonancia y plasma de superficie a 25 grados centígrados para evitar cambios en el índice de refracción inducidos por la variación de temperatura durante la detección de proteínas. Inserte un prisma de enjuague no funcionalizado en la celda de flujo de cetona de poliéter éter de 10 microlitros conectada a una bomba de jeringa controlada por computadora, un desser y una válvula de inyección de presión media de seis puertos.

Llene el sistema de flujo con tampón de ejecución recién filtrado y Degas. Retire el prisma de enjuague e inserte el prisma que contiene la matriz de receptores combinacionales de reacción cruzada en las pilas de funcionamiento de la celda de flujo a un caudal de 100 microlitros por minuto. Con la ayuda de la cámara CCD, elimine las burbujas de aire presentes en la superficie del prisma pasando el tampón de ejecución.

Defina rápidamente el área de estudio para cada punto dibujando un círculo con el mismo diámetro para el área de interés basado en una imagen bien contrastada de la matriz, y con la ayuda del software integrado en el sistema de imágenes de resonancia y plasma de superficie, trace curvas de plasma, que representan curvas de reflectividad en función del ángulo de incidencia para todos los puntos. Elija el ángulo de trabajo, que es la posición en la que se registrarán las curvas cinéticas en la pendiente más alta de las curvas de reflectividad. Gire el espejo de escaneo para fijar el ángulo de trabajo seleccionado para las mediciones cinéticas.

Continúe ejecutando montones a través del sistema de flujo hasta que la señal de reflectividad para todos los puntos sea estable y constante. Luego, use una jeringa para inyectar un mililitro de lectina de maní o una solución HL en el circuito de muestra de 500 microlitros con la válvula de inyección en la posición de carga con el caudal ajustado a 100 microlitros por minuto, coloque la válvula de inyección en la posición de inyección. Inicie las mediciones cinéticas monitoreando las variaciones de reflectividad contra el tiempo simultáneamente en todos los puntos al final de la inyección de proteína.

Enjuague la matriz con el búfer en ejecución durante ocho minutos. Por último, inyecte un mililitro de 1%DS para regenerar la matriz. Repita el mismo procedimiento para las otras proteínas después de la entrada de la solución de proteínas en la celda de flujo.

La unión molecular se produce e induce un desplazamiento de las curvas plasmáticas y una variación de la reflexividad. El software de adquisición de imágenes convierte los valores de intensidad de luz medidos a niveles de escala de grises, lo que proporciona imágenes SPR y genera la variación de la reflectividad frente al tiempo en gramos del sensor. A continuación, utilice un software de cálculo matemático para trazar la reflectividad al final de cada inyección de proteínas en comparación con la proporción de bloques de construcción para generar un perfil de evolución continua en 2D para cada muestra.

Finalmente, agregue la proporción de bloques de construcción en los gramos del sensor para generar un patrón de reconocimiento continuo dependiente del tiempo llamado Un paisaje de evolución continua en 3D para cada proteína para probar la capacidad de la lengua electrónica para el análisis de proteínas comunes, se utilizaron tres proteínas, una mioglobina HL y lisozima para cada proteína. La lengüeta electrónica generó un perfil de evolución continua en 2D distinto, como se muestra en 3D. También se generaron paisajes de evolución continua para una mioglobina y lisozima de alto nivel.

La lengua electrónica es sensible a las características de la superficie de las proteínas, como la distribución de residuos de aminoácidos hidrofóbicos, neutros y cargados. Los perfiles de evolución continua obtenidos de los paisajes se pueden utilizar como huellas dactilares para la discriminación eficiente de proteínas y la identificación prospectiva basada en el reconocimiento de patrones. Al intentar este enfoque, es importante recordar seguir los procedimientos experimentales optimizados y estandarizados para garantizar una buena reproducibilidad de la lengua electrónica.

Estos procedimientos incluyen una superficie limpia y buena del prisma, la elección del ángulo de trabajo para la resonancia de plasma de superficie y la aplicación de una solución adecuada para regenerar el sistema por completo para su reutilización. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo construir la lengua electrónica basada en el enfoque COMBINATOR y las imágenes de resonancia de plasma SOFA para el análisis de proteínas. Buena suerte para tus experimentos.