Estereológico y Citometría de Flujo Caracterización de leucocitos subpoblaciones en Modelos de transitorios o isquemia cerebral permanente

El objetivo general de este procedimiento es caracterizar los subconjuntos de células mieloides de ratón del cerebro isquémico mediante dos metodologías diferentes. En primer lugar, se introduce un modelo permanente de isquemia cerebral mediante la oclusión, tanto de la arteria carótida común o ACC como del tronco distal de la arteria cerebral media o MCA generando infartos que afectan principalmente a la corteza cerebral. Luego, para la cuantificación estereológica de los subconjuntos de células mieloides, las secciones coronales seriadas del cerebro se tiñen inmunológicamente para las células de interés, y luego las células infiltradas se cuantifican mediante el enfoque del fraccionador óptico.

Alternativamente, las células mieloides se pueden aislar del tejido cerebral fresco mediante disociación mecánica, y luego teñirse y analizarse mediante citometría de flujo. En última instancia, se puede lograr una cuantificación precisa y una caracterización cualitativa detallada de los subconjuntos específicos de células mieloides que se infiltran en el cerebro del ratón después de la isquemia cerebral mediante cuantificación estereoscópica y citometría de flujo multiparamétrica, respectivamente. La principal ventaja de este modelo de isquemia seriada frente a otros existentes es que nuestra técnica tiene unas tasas de mortalidad significativamente más bajas que otros métodos, minimizando el número de animales necesarios para el estudio.

Esta área puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del accidente cerebrovascular, como ¿cuáles son las funciones de la microreactivación, la extravasación de macrófagos hematógenos o los neutrófilos en las lesiones cerebrales? La cuantificación teológica precisa de los enfoques de citometría multiparamétrica demostrados en este artículo puede proporcionar información sobre el número, el fenotipo y la función de la población de células mieloides en la respuesta inmune innata a la isquemia CE. Para ligar primero la CCA, se hace una incisión de un centímetro en la línea media alrededor de la superficie ventral del cuello del animal bajo un microscopio quirúrgico.

Una vez diseccionado, use una sutura de nylon de seis ceros para ocluir el CCA izquierdo con un nudo permanente para ligar el MCA distal. A continuación, haz una incisión horizontal en el músculo temporal de derecha a izquierda. Luego haga una segunda incisión vertical en el lado derecho del músculo temporal.

Teniendo cuidado de evitar cortar la vena temporal. Separe el músculo temporal del cráneo y sujételo con una sutura para mantener la superficie limpia del cráneo. A continuación, limpie el cráneo con solución salina fría estéril para detectar la posición exacta del ACM izquierdo a través de la transparencia del cráneo.

Una vez identificado el ACM, se utiliza una fresa de acero inoxidable para realizar una craneotomía redonda de un milímetro en el lóbulo frontal entre el arco cigomático y el hueso escamoso. Retire con cuidado el cráneo que expone el MCA. A continuación, utilice una sutura de nylon de nueve ceros para ocluir el ACM izquierdo en el tronco distal, justo antes de la bifurcación entre las ramas frontal y posterior del ACM con un nudo permanente.

Para extirpar el cerebro, decapita al ratón sacrificado justo por encima de la médula espinal y haz una incisión anterior posterior en la piel para exponer el cráneo. A continuación, haz dos cortes laterales en la unión de las paredes laterales y la base del cráneo y retira el pequeño trozo de hueso. A continuación, haz un corte a través del cráneo a lo largo de la sutura sagital y utiliza unas pinzas para extraer el cráneo que recubre cada hemisferio para exponer el cerebro.

Use una espátula para separar el cerebro del cráneo y transfiéralo a una solución de PFA al 4%. Después de tres horas, retire el PFA e incube el cerebro en una solución de sacarosa al 30% para crioproteger el cerebro. Después de 48 horas, retire la solución de sacarosa y congele el cerebro rápidamente en pentano isop de 40 grados centígrados negativos, luego use un micrótomo de congelación para hacer secciones cerebrales coronales de 30 micrómetros.

Recolección de 10 series en una solución crioconservante. Cada conjunto de series se compone de alrededor de 14 a 16 cortes coronales con una distancia entre cortes de 300 micrómetros. Asegurar un muestreo adecuado del cerebro del ratón entre 1,94 y negativo 2,46 posterior a la bgma para estimar el número total de neutrófilos infiltrados.

Después de la oclusión de MCA por un fraccionador óptico, primero inmunotiñir los neutrófilos con el anticuerpo rata anti LY seis G y el anticuerpo secundario apropiado en secciones flotantes mediante la técnica de inmunofluorescencia convencional. A continuación, monte las secciones del cerebro en portaobjetos de microscopio Super Frosts con la zona infartada colocada a la derecha y abra el software del investigador estéreo. A continuación, haga clic en el menú del administrador de secciones de serie de herramientas y agregue una nueva sección con el botón nueva sección.

Establezca el intervalo de evaluación en 10 para una fracción de muestreo de un décimo de segmento. Y luego, en el menú desplegable de contorno, seleccione la herramienta de contorno de área infartada. Dibuja un contorno para delinear el área infartada bajo el objetivo 10 x.

A continuación, cambie al objetivo 100 x en el microscopio y en el menú de objetivos. Para cuantificar los neutrófilos en el menú de sondas, ahora seleccione el fraccionador óptico y establezca la ubicación XY de los marcos de conteo en 230 para los tamaños de cuadrícula X e Y. Ahora seleccione el botón de neutrófilos de la barra de marcadores y marque los neutrófilos teñidos en el área infartada.

Exporte los resultados de la cuantificación a un archivo de hoja de cálculo para disociar el cerebro en una suspensión de una sola célula. Después de extirpar el cerebro, como se acaba de demostrar, diseccione las áreas central y por infarto de la corteza ipsilateral del cerebro de un ratón isquémico cerebral. Pesar el tejido cerebral y colocarlo en cinco mililitros de RPMI helado según la llamada de normalización entre los grupos experimentales, y luego usar un triturador de tejido con morteros de teflón para disociar el tejido en una suspensión de una sola célula.

Transfiera las suspensiones celulares a un tubo ultracentrífugo de 50 mililitros y agregue cinco mililitros más de RPMI por solución de llamada a las muestras. Luego, después de centrifugar, la célula se suspende durante 30 minutos a 7, 800 GS y 25 grados Celsius. Asegúrese de que aparezca una capa de color blanco correspondiente a la mielina en la parte superior de la solución.

Retire con cuidado la capa de mielina y filtre toda la suspensión celular, incluidas las células peletizadas, a través de un colador de malla de nailon de 40 micrómetros. Lave el colador con 10 mililitros de RPMI para asegurarse de que todas las celdas se filtren a través de la malla y luego transfiera la solución a un tubo de 50 mililitros. Agregue 20 mililitros de RPMI a las células y luego, después de girar hacia abajo, vuelva a suspender la pastilla de leucocitos.

En un mililitro de PBS, incube las células durante dos o tres minutos en cuatro mililitros de tampón de lisis a temperatura ambiente para licitar los eritrocitos y luego centrifugar las células. Etiquete las células en 200 microlitros de PBS que contengan 1% de BSA y los anticuerpos apropiados en hielo. Luego, después de 45 minutos, lavar las muestras con un mililitro de PBS frío y Resus resuspender los gránulos en 100 microlitros de tampón de flujo de fax para el análisis de citometría de flujo.

Este modelo se caracteriza por volúmenes de infarto altamente reproducibles a las 24 horas después de la oclusión de la arteria cerebral media, estimados por el método de Cavalieri. En los cortes teñidos con nial, de acuerdo con estudios previos, la infiltración de neutrófilos se correlaciona directamente con el tamaño del infarto. Además, el aislamiento de leucocitos y la caracterización por citometría de flujo permiten el aislamiento de células mieloides de la corteza del hemisferio lesional IPS de ratones isquémicos, que comprenden del 10 al 30% del total de eventos encontrados en la suspensión celular y presentan un parámetro de dispersión directa baja que se asocia con desechos celulares.

Las células CD 11 B positivas tienen un valor de dispersión directa más alto, lo que sugiere que los restos celulares no están marcados con este marcador y, como se indicó anteriormente, que se pueden excluir de análisis posteriores estableciendo el umbral de FSC en 200 neutrófilos caracterizados como LY: seis células G positivas son la población de células infiltradas más numerosa encontrada a las 24 horas después de la oclusión de MCA en el cerebro isquémico de ratón utilizando este modelo de isquemia cerebral y comprenden entre el 70 y el 80% de las células CD 11 B positivas para CD 45 altas. El resto de las células son en su mayoría una subpoblación de monocitos proinflamatorios CD 11 B, CD 45 positivos, LY seis G altos, seis C negativos altos y proinflamatorios altos, que se encuentran en números elevados en las áreas cerebrales isquémicas de 24 a 48 horas después de la oclusión de la arteria cerebral media. Este modelo P-M-C-A-O se puede realizar en 30 minutos si se realiza correctamente siguiendo el procedimiento de citometría de flujo.

Se pueden realizar otros métodos, como la clasificación de un subconjunto celular específico, para responder a preguntas adicionales como cuáles son los patrones de expresión, los cambios metabólicos o las actividades acéticas de las células mieloides en este sistema modelo. Después de ver este video solo para tener una buena comprensión de cómo crear un modelo de isquemia y, lo que es más importante, cómo caracterizar el número y el fenotipo de las células mieloides infiltrantes mediante dos enfoques diferentes en un modelo de lesión cerebral de ratón o tpe después de la isquemia.