使用"桅杆细胞敲击"小鼠分析体内桅杆细胞的功能

以下方法的总体目标是使用肥大细胞敲入小鼠分析肥大细胞在体内的功能。这是通过首先生成骨髓来源的培养肥大细胞或 BMC MC 或植入肥大细胞缺陷小鼠来实现的。在第二步中，将 BMC MCs 过继转移到肥大细胞缺陷小鼠的各个解剖部位，以产生肥大细胞敲入小鼠。

最终，通过流式细胞术和免疫组织化学分析评估过继转移的肥大细胞的数量和解剖分布，以评估移植的群体在多大程度上与野生型小鼠中发现的细胞群相似。该技术的主要优点是它允许在体内直接评估移植壁型或转基因 MA 细胞群的功能。因此，该方法可以帮助回答 MA 细胞生物学领域的关键问题，例如 MA 细胞或其产物在多大程度上可以促进小鼠生理、免疫或病理过程的特征，包括人类疾病模型。

通常，学习这种方法的个体可能会很困难，因为肥大细胞移植和缺陷可能会有所不同，具体取决于用于生成 BM CMC 的方法、注射根、注射的 BMC MC 的数量以及植入后进行体内实验前体重的周数。这种方法的视觉演示至关重要，因为除非您确切地看到它们是如何执行的，否则很难学习植入程序的各个方面。要首先提取骨髓，请使用无菌解剖工具从野生型小鼠中收获股骨、胫骨和腓骨，而无需切割任何骨骨骺。

解剖每块骨头时，用镊子固定并刮掉所有外来组织。然后，当收集到所有骨骼后，将 PBS 中的骨头放在冰上，将它们转移到无菌组织培养罩中，然后一次一个，用镊子固定每块骨头并切断两个骨骺以暴露髓腔。接下来，使用三个毫升注射器，配备 30 号针头并冲洗冷介质，将每根骨头中的所有红骨髓放入新的培养皿中。冲洗完所有骨头后，使用同一注射器通过重复轻柔抽吸和喷射来解离骨髓细胞簇。

然后将细胞悬液转移到 15 mL离心管中。用冷冲洗培养基填充试管并离心细胞复苏。将细胞沉淀悬浮在 10 mL 培养基中。

然后将骨髓细胞转移到适当大小的组织培养瓶中。培养 1 至 2 天后，在接下来的几周内，将非贴壁细胞与每只小鼠 10 mL 新鲜培养物、培养基一起转移到新培养瓶中。刚刚演示了每 3 到 4 天给细胞喂食一次。

每周一次将非粘附细胞转移到新培养瓶中，直到没有粘附细胞用于皮内植入耳针 Resus。在冷 DMEM 中以 4 乘以 10 至每毫升 7 个细胞的 4 倍悬浮 BMC MC。然后将细胞吸入配备 30 号针头的 1 毫升注射器中，并将注射器放在冰上。

接下来，通过捏住 4 到 6 周龄的肥大细胞缺陷受体小鼠的顶部捏住来确认适当的麻醉深度，并涂抹眼膏注射细胞。用食指露出并伸展耳钉的腹面，在耳朵的背面产生垂直压力。然后将 1 25 微升皮内注射 1 次 10 次 10 次于六个 BMC MC 注射到耳朵中间，然后第二次 25 微升注射到针尖。

对于腹膜内，植入将 BMC MCs 以 10 倍/毫升的速度重悬于冷 DMEM 中每毫升 7 个细胞。然后使用配备有 25 号针头的 1 毫升注射器将 200 微升培养基中的 6 个 BM CMC 注射 2 次 10 次，注射到肥大细胞缺陷受者的腹膜腔中进行静脉植入。在冷 DMEM 中以 2.5 倍 10 的比例重悬于每毫升 7 个细胞中，然后通过尾静脉在 200 微升培养基中以 5 倍 10 的比例注射到六个 BMC MC 中。

腹膜内植入后 4 至 6 周，使用配备 25 号针头的 5 毫升注射器将 5 毫升冷 PBS 注射到受体动物的腹膜腔中。按摩腹部 20 秒以收获腹膜细胞。然后使用配备 22 号针头的 5 毫升注射器缓慢抽吸腹膜灌洗液。

然后可以通过流式细胞术或组织化学评估腹膜灌洗液中的肥大细胞百分比和总细胞数。为了评估肠系膜窗口中的肥大细胞，切开腹膜以暴露肠道。将每个鼠标的肠系膜窗口安排在载玻片上，然后在汽车噪音溶液中固定一小时。

孵育结束时添加室温，风干载玻片并取出肠道。固定的肠系膜窗将保持附着在载玻片上。最后，在室温下用 chaba 染色溶液对制剂进行染色 20 分钟代表 BM CMC 在培养 15 天和 45 天后进行流式细胞术分析和奥丁蓝染色 在 DMEM 中，补充 IL 的 3 显示 BM CMC 培养 45 天，纯度为 95%，并含有大量细胞质颗粒。

因此，来自这些培养物的细胞适合植入实验，而培养 15 天的细胞则不在这些图像中。皮内 4 周成功植入耳 penny，植入肠系膜窗，腹膜植入后 6 周的腹膜腔和静脉植入后 12 周的肺按预期显示。从野生型小鼠分离的组织样品中存在肥大细胞，而在肥大细胞敲入小鼠的肥大细胞缺陷动物中未检测到肥大细胞。

然而，过继转移的 BMC MC 出现在与野生型动物中观察到的位置相似的位置。在尝试此程序时，重要的是要记住，植入和研究实验之间的间隔会因肥大细胞注射部位而异。遵守这样的间隔非常重要，以便有足够的时间让移植的细胞成熟并占据最终位置 vivo。

这种方法已经并将继续提供有关 mass cell 及其产品在体内可以做什么或不能做什么的重要信息。请始终记住，与活体动物一起工作需要经过专门培训、对实验方案进行适当审查和批准，并严格遵守动物护理的最高标准，包括在执行这些程序时注意减轻动物的疼痛和压力。