La fabricación de cristal invertida coloidal poli (etilenglicol) Andamios: Una célula Plataforma de cultivo tridimensional para ingeniería de tejidos de hígado

El objetivo general de este procedimiento es fabricar andamios de cristales coloidales invertidos a base de PEG con una matriz extracelular codificada para aplicaciones de ingeniería de tejidos hepáticos. La ingeniería de tejidos hepáticos es un campo prometedor dentro de la ingeniería de tejidos y la medicina regenerativa. Estamos creando andamios tridimensionales que permiten a las células hepáticas mantener su función durante largos períodos de tiempo.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la prueba de fármacos, ya que las células hepáticas cultivadas con este sistema pueden mantener su función durante más tiempo y presentar una mejor respuesta al fármaco. Aunque este método puede aportar información sobre la ingeniería de tejidos, también puede aplicarse a otros sistemas, como aquellos que utilizan células madre. Quien demostrará el procedimiento será Hitomi, una estudiante de posgrado de mi laboratorio.

Para preparar los moldes de microperlas, primero corte las puntas de los tubos microcentrífugos resistentes al hervido de 0,2 mililitros al nivel de 40 microlitros. Utilice pegamento impermeable para adherir las partes superiores de los tubos cortados a cubreobjetos de vidrio para microscopio y luego pegue alrededor de los moldes. A continuación, reemplace el agua en un frasco de microesferas de poliestireno con etanol al 70%.

Coloque la solución de esferas en un baño ultrasónico y someta la mezcla a sonicación a 30 vatios durante tres minutos para desagregar las esferas. Una vez preparadas las microesferas, pipetee 100 microlitros de etanol en cada uno de los moldes. A continuación, corte cuatro milímetros del extremo superior de una punta de pipeta de 200 microlitros y úsela para pipetear 25 microlitros de las microesferas de poliestireno en el molde dos veces.

Coloque los moldes en un agitador rotatorio y ajústelo a 120 rpm. Deje las muestras en el agitador durante la noche. Al día siguiente, coloque los moldes bajo un microscopio y verifique que las esferas estén ordenadas hexagonalmente.

Deje que el etanol se evapore a temperatura ambiente durante dos noches. En ese momento, coloque cuidadosamente el complejo de molde y perlas en un horno a 130 grados Celsius durante seis horas para recocer las perlas de poliestireno y formar la réplica negativa del andamio 3D. Primero, sintetice macrómeros de diacrilato de polietilenglicol utilizando protocolos establecidos, como se describe en estas dos referencias.

A continuación, prepare una solución al 50% de PEGDA en agua desionizada y centrifugue la mezcla hasta que se disuelva completamente. Para andamios conjugados con matriz extracelular, agregue un 10% adicional de PEG NHS de aceite de krill a la solución al 50% de PEGDA. Luego, prepare una solución stock al 20% del fotoiniciador en etanol al 70%.

Agregue 50 microlitros de la solución de iniciador fotoquímico por cada mililitro de la mezcla de PEGDA. Luego, vortexee la mezcla durante un minuto. A continuación, retire los moldes de las laminillas de vidrio, extraiga cuidadosamente las redes utilizando una espátula y colóquelas en tubos centrífugos separados de 1,5 mililitros.

Pipetee 300 microlitros de la solución de PEGDA en cada tubo, y luego centrifugue los tubos para permitir que la solución de PEGDA se infiltre en la red de poliestireno. A continuación, retire la red del tubo usando pinzas y seque cuidadosamente el exceso de solución de PEGDA de la superficie. Coloque la red sobre una lámina de parafina cubierta de vidrio, con la superficie plana y circular orientada hacia arriba.

Luego, exponga el andamio a luz ultravioleta de 365 nanómetros durante cinco minutos utilizando una lámpara de luz UV. Coloque alrededor de diez redes cristalinas polimerizadas de PEGDA en un vial nuevo y agregue 20 mililitros de THF. Agite los viales en un agitador orbital a 300 RPM durante seis horas.

Retire el vial cada una o dos horas y sustituya el disolvente que contiene el polímero por THF fresco. Después del último lavado, añada agua a la solución de THF usada para verificar si las esferas de PS se han disuelto completamente. Si la solución es blanca, realice lavados adicionales hasta que la solución quede transparente.

Para esterilizar los andamios, prepare un tubo microcentrífugo de 50 mililitros con dos mililitros de etanol al 70% por cada andamio y coloque los andamios en el tubo utilizando una espátula. Deje remojar los andamios en etanol durante una hora. Después de una hora, vierta cuidadosamente el etanol y reemplácelo con un volumen igual de PBS estéril.

Luego, centrifugue los andamiajes para eliminar cualquier burbuja. Almacene los andamiajes centrifugados a cuatro grados Celsius y extráigalos cada una a dos horas para reemplazar la solución con PBS fresco. Después de varios cambios en PBS, retire los andamiajes que serán recubiertos con colágeno y colóquelos en un tubo que contenga un mililitro de colágeno tipo uno por cada andamiaje a recubrir.

A continuación, centrifugue el tubo como antes y luego agite los andamios a 400 RPM en un agitador orbital durante 30 minutos. Almacene los andamios durante la noche a cuatro grados Celsius. Cultive células de hepatocarcinoma en placas de cultivo celular de 100 milímetros con 10 mililitros de medio de cultivo.

Cambie el medio cada tres días hasta que la densidad celular alcance del 75 al 80 % de la superficie de cultivo. Cuando las células estén listas, coloque cuidadosamente los andamios con la superficie plana hacia arriba en una placa de 24 pocillos. Luego, enjuague cada andamio con dos mililitros de PBS.

Aspire el PBS y agregue dos mililitros de medio de crecimiento a los andamios. Después de 30 minutos, retire el medio y deje secar el andamio durante una hora. A continuación, recolecte las células de hepatocarcinoma utilizando el método de digestión con tripsina.

Después de centrifugar las células, elimine el sobrenadante y re-suspenda el precipitado de modo que haya un millón de células por 25 microlitros. Pipetee lentamente 25 microlitros de la suspensión celular directamente encima de cada andamio. Luego, cúbrala placa y colóquela en el incubador durante la noche.

A continuación, transfiera con cuidado los andamios a una nueva placa de 24 pocillos y agregue mediante pipeta dos mililitros de medio a cada pocillo antes de devolver la placa al incubador. Se muestra aquí un microscopio electrónico de barrido del andamio. Está compuesto por una disposición hexagonal compacta de poros cuyo diámetro promedio oscila entre 100 y 105 micrones, formando interconexiones con los poros vecinos que en su mayoría tienen entre 35 y 40 micrones de diámetro.

Cuando se siembran células de hepatocarcinoma, estas crecen y proliferan en andamios previamente recubiertos con colágeno tipo uno, pero no aumentan en número en los andamios desnudos. Además, las células de hepatocarcinoma en los andamios recubiertos con colágeno mostraron una mayor función celular de manera dependiente de la concentración. En el día 14, las células de hepatocarcinoma cultivadas en andamios ICC recubiertos con 400 microgramos por mililitro secretaron más del triple de albúmina en comparación con las cultivadas en el andamio desnudo.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar asegurarse de que las esferas de poliestireno en el entramado estén dispuestas adecuadamente. Una disposición deficiente dará lugar a una mala interconectividad, lo que puede afectar negativamente la actividad celular. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo fabricar andamios de cristales coloidales invertidos basados en PEG con recubrimiento y estructura celciada.

No olvide que trabajar con tetrahidrofuran puede ser peligroso y siempre se deben tomar precauciones, como operar en un campanario de extracción y usar guantes y gafas, al realizar este procedimiento.