Name: La fabricación de cristal invertida coloidal poli (etilenglicol) Andamios: Una célula Plataforma de cultivo tridimensional para ingeniería de tejidos de hígado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Aprende a fabricar andamios de cristal coloidal invertido de PEG para ingeniería de tejido hepático tridimensional. Este método mejora el mantenimiento de la función de hepatocitos Huh-7.5 y optimiza las aplicaciones en pruebas de fármacos.

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Los autores desean agradecer el apoyo de una beca de la Fundación de Investigación Nacional (NRF -NRFF2011-01) y el Programa de Investigación Competitiva (NRF-CRP10-2012-07).

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos que divulgar.

Andamios de ingeniería de tejidos están evolucionando rápidamente para proporcionar todas las señales físicas y bioquímicas necesarias para regenerar, mantener o reparar los tejidos para la aplicación de la sustitución de órganos, el estudio de la enfermedad, el desarrollo de fármacos, y muchos otros 57. En la ingeniería de tejidos de hígado, los hepatocitos primarios humanos pierden rápidamente sus funciones metabólicas una vez aislados del cuerpo, creando una gran necesidad de andamios de ingeniería y el de...

El hígado es un órgano altamente vascularizado con una multitud de funciones, incluyendo la desintoxicación de la sangre, el metabolismo de xenobióticos, y la producción de proteínas séricas. El tejido del hígado tiene una microestructura tridimensional compleja (3D), que consta de múltiples tipos de células, canalículos biliares, sinusoides, y zonas de diferente composición biomatriz y diferentes concentraciones de oxígeno. Dada esta estructura elaborada, ha sido difícil crear un modelo de hígado adecuado in vitro 1. Sin embargo, hay una creciente demanda de funcional en modelos in vitro de alojamiento hepatocitos humanos como plataformas para la toxicidad del fármaco de prueba 2 y el estudio de enfermedades asociadas con el hígado 3. Plataformas de ingeniería de tejido hepático actual han simplificado la complejidad del hígado mediante el aislamiento de uno, o concentrarse en unos pocos, de los parámetros del hígado, es decir, co-cultivo de células 4, la composición bioquímica de la zonal microambientes 5, la dinámica de flujo de 6,7 y la configuración de la biomatriz 8. La configuración de la biomatriz se puede dividir en parámetros tales como materiales de andamiaje, la composición de proteínas de la matriz extracelular (ECM), la rigidez de la matriz, así como el diseño y la estructura del andamio. Ha habido un aumento en los estudios de ingeniería de tejidos utilizando hidrogeles sintéticos, especialmente poli (etilenglicol) (PEG) hidrogeles 9, dada la capacidad de sintonizar propiedades mecánicas, bioactividad, y la velocidad de degradación del hidrogel. En cuanto a la investigación relacionada con el hígado, se aplicó el hidrogel biocompatible para estudiar la infección por virus de la enfermedad hepática 3. Como diseño de la plataforma de hepatocitos, numerosos estudios han utilizado cultivos sándwich de hepatocitos 10,11 y encapsulación de células dentro de un hidrogel 12,13 para proporcionar el entorno 3D y célula-ECM y la interacción célula-célula que son esenciales para imitar en el microambiente vivo. Howeembargo, estas plataformas no poseen un alto grado de control y organización espacial, que conduce a propiedades no uniformes a través del andamio 14. El cristal coloidal invertida (CPI) 14 andamio es un andamio 3D altamente organizada para el cultivo celular que se introdujo por primera vez en la década de 2000. estructura única del andamio se puede atribuir al proceso de fabricación sencillo que utiliza un cristal coloidal, un enrejado ordenado de partículas coloidales de diámetro variable. En pocas palabras, para resumir el proceso, las partículas están bien ordenados y recocidas utilizando calor para formar un enrejado. La lixiviación de esta celosía, por un disolvente orgánico, en un polimerizados resultados de hidrogel en cavidades esféricas hexagonal empaquetados 15 con alta área superficial. Este andamio altamente ordenada se ha hecho previamente con ambos materiales sintéticos y naturales, incluyendo, pero no limitado a, poli (acrilamida) 16-21, poli (láctico-co-ácido glicólico) 15,22-30, Poli (etileno glicol) 31,32, poli (metacrilato de 2-hidroxietilo) 21,33-35, y quitosano 36-39. Andamios ICC hechos de materiales no-incrustantes tienden a promover esferoides celulares dentro de las cavidades 14,23,40. Múltiples tipos de células se ha demostrado que la proliferación de éxito, diferenciar y función dentro de esta configuración, incluyendo condrocitos 41, células estromales de médula ósea 42, y células madre 43,44. En cuanto a los hepatocitos, se han realizado estudios con andamios ICC hechos de Na 2 SiO 3 y poli (acrilamida), pero no PEG. Con las estrategias bioconjugation simples (es decir, a través de acoplamiento de aminas EDC / NHS), andamios a base de PEG ECM proteínas conjugadas se pueden fabricar, que puede resultar más sitios de unión de células a ser más in vivo como el medio ambiente y mejorar la función hepática. En este manuscrito y el vídeo asociado, detallamos la fabricación del andamio CPIutilizando poli diacrilato de hidrogel (etilenglicol) (PEGDA) y una celosía de poliestireno de microesferas, optimizado para hepatocarcinoma (Huh-7.5) cultura. Se demuestra las diferencias entre los andamios ICC en general no adhesivos desnudos PEGDA y la PEGDA andamio ICC revestido con colágeno en términos de topología de andamio y rendimiento de la célula. La viabilidad celular y la función se miden cualitativa y cuantitativamente para evaluar el comportamiento de células Huh-7.5.

<table><tbody><tr><td>Tubo de PCR de 0,2 ml</td><td>Axygen Scientific</td><td>PCR-02D-C</td> Pegamento Gorila a <td>prueba de ebullición</td></tr><tr><td></td><td>Gorilla Glue, Inc.</td><td>Depende del proveedor. Esto se compró en una tienda local.</td><td></td></tr><tr><td>Correderas de vidrio</td><td>VWR</td><td>631-1575</td><td>Dimensiones: 24 veces; 60 mm2</td></tr><tr><td>Esferas de poliestireno</td><td>Fisher Scientific</td><td>TSS#4314A</td><td>Diámetro = 140 &micro; m; 3x104 partículas por mililitro y distribución de tamaño del 1,4%</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>1.00983.1011</td><td>absoluto para análisis EMSURE; Diluir al 70% con agua Milli-Q</td></tr><tr><td>Baño ultrasónico</td><td>Elma</td><td>S10H</td><td>Horno de equipo</td></tr><tr><td></td><td>Nabertherm</td><td>N7/H</td><td>Equipo</td></tr><tr><td>200 &micro; l punta de pipeta</td><td>Axygen Scientific</td><td>T-210-Y-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Agitador oscilante</td><td>VWR</td><td>444-0142</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenglicol (PEG)</td><td>Merck</td><td>1.09727.0100</td><td>Mw= 4 kDa; la acrilación de monómeros PEG y la purificación del precipitado resultante producen un macrómero PEGDA con Mw = 4,6&nbsp; </td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>392932</td><td>equipo</td></tr><tr><td>Acrilato-poli(etilenglicol) - Valerato de succinimidilo</td><td>Laysan Bio</td><td>ACRL-PEG-SVA-3400-1g</td><td>Mw = 3,4 kDa</td></tr><tr><td>2-hidroxi-4'-(2-hidroxietoxi)-2-metilpropiofenona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>410896</td><td></td></tr><tr><td>Vórtice</td><td>VWR</td><td>58816-123</td><td>Equipo</td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5404 000.413</td><td></td></tr><tr><td>Película de parafina</td><td>Parafilm M&nbsp;</td><td>#PM996</td><td>Se mantiene a 9" con una intensidad permitida de 10.84&nbsp; mW/cm2</td></tr><tr><td>Foco UV Bluewave 200</td><td>Blaze Technology&nbsp;</td><td>120008, 122300</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahidrofurano (THF)</td><td>Merck</td><td>107025</td><td></td></tr><tr><td>Agitador orbital</td><td>Heidolph</td><td>543-123120-00-5</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno Tipo I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3867-1VL</td><td>De rata 1x, sin CaCl2 & MgCl2; pH = 7.2</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Gibco</td><td>20012-027</td><td>16% W/V AQ. 10 x 10&nbsp; ml</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>VWR</td><td>43368.9M</td><td>Equipo</td></tr><tr><td>Freezone 4.5 liofilizador</td><td>Labconco</td><td></td><td>7750020 Equipo Recubrimiento</td></tr> por <tr><td>pulverización catódica</td><td>Jeol Ltd.</td><td>JFC-1600</td><td>Equipo</td></tr><tr><td>Microscopio Electrónico de Barrido</td><td>Jeol Ltd.</td><td>JSM 5310</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpos primarios anti-ratón contra el colágeno tipo I</td><td>Abcam</td><td>ab6308</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario anti-ratón conjugado con Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A21121</td><td></td></tr><tr><td>Placa, cultivo de tejidos 24 pocillos, fondo plano (Nunclon)&nbsp;</td><td>Bio-Rev PTE LTD</td><td>3820-024</td><td></td></tr><tr><td>Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) 2,5 g/L de glucosa con L-Gln</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (P/S)</td><td>Life Tchnologies</td><td>15140-122 E</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Placas de cultivo sin tratar Corning</td><td>Sigma Aldrich CLS430591</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.25% Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Equipo; 37&nbsp; &deg; C, 5% de humedad</td></tr><tr><td>Forma Steri-Cycle CO2 Incubadoras</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>371</td><td></td></tr><tr><td>Hausser Bright-Line Hemacitómetro</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Viabilidad/Citotoxicidad Vivo/Muerto para células de mamíferos</td><td>Life Technologies</td><td>L3224&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ensayo CCK-8</td><td>Dojindo Laboratories</td><td>CK04-11</td><td>Reactivo de sal de monosodio (MSR)</td></tr><tr><td>Lector de microplacas Infinite 200 PRO&nbsp;</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albúmina Kit ELISA Humano</td><td>Abcam</td><td>ab108788</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610407</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153-50G</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpos primarios anti-ratón (contra CYP3A4, albúmina)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53850; sc-271605</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 etiquetado como Phalloidin</td><td>Life Technologies</td><td>A34055</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>VWR</td><td>22706.326</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>DPEC</td><td>agua Thermofisher Scientific</td><td>AM9916</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000c Espectrofotómetro</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>iScript Transcripción inversa Supermix&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1708840</td><td></td></tr><tr><td>SYBR seleccionan Master Mix para CFX</td><td>Life Technology</td><td>4472937</td><td></td></tr><tr><td>Primers (a elegir)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Real-Time System, C-1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio Rad Laboratories</td><td>SOFT-CFX-31-PATCH&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

la fabricación de cristal invertida coloidal poli (etilenglicol) andamios: una célula plataforma de cultivo tridimensional para ingeniería de tejidos de hígado

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

La capacidad para mantener la función de los hepatocitos in vitro, para el propósito de probar la citotoxicidad xenobióticos &#39;, el estudio de la infección por virus y el desarrollo de fármacos dirigidos en el hígado, requiere una plataforma en la que las células reciben señales bioquímicas y mecánicas adecuadas. sistemas recientes de ingeniería de tejidos de hígado han empleado andamios tridimensionales (3D) compuestas de hidrogeles sintéticos o naturales, dado su alta retención de agua y su capacidad de proporcionar los estímulos mecánicos necesarios por las células. Ha habido un creciente interés en el andamio invertida cristal coloidal (ICC), un desarrollo reciente, que permite a la organización espacial alta, homotipica e interacción celular heterotıpica, así como la matriz de interacción célula extracelular (ECM). En este documento, se describe un protocolo para fabricar el andamio ICC utilizando poli diacrilato (etilenglicol) (PEGDA) y el método de lixiviación de partículas. En pocas palabras, una celosía está hecho de partículas de microesferas, después de lo cual un pre-de poSe añade solución r, adecuadamente polimeriza, y las partículas se retiran, o lixiviado, usando un disolvente orgánico (por ejemplo, tetrahidrofurano). La disolución de los resultados de celosía en un andamio altamente poroso con tamaños y interconectividades que permiten los medios de comunicación para llegar a las células más fácilmente de poros controlados. Esta estructura única permite a área de superficie alta para que las células se adhieren a, así como fácil la comunicación entre los poros, y la capacidad de recubrir el andamio ICC PEGDA con proteínas también muestra un efecto marcado en el rendimiento de la célula. Se analiza la morfología del esqueleto, así como el hepatocarcinoma celular (Huh-7.5) el comportamiento en términos de viabilidad y la función de explorar el efecto de la estructura de la CPI y revestimientos de ECM. En general, este documento proporciona un protocolo detallado de un andamio emergente que tiene amplias aplicaciones en la ingeniería de tejidos, especialmente la ingeniería de tejidos del hígado.

Los resultados representativos para la caracterización estructural del andamio CPI y la comparación de la eficacia de cada condición del andamio de la CPI en el cultivo de hepatocitos se muestran y explican a continuación. Las condiciones de andamio ICC utilizados en estos resultados son recubrimientos de colágeno de 0 g / ml (desnudo), 20 mg / ml (de colágeno 20), 200 mg / ml (de colágeno 200), y 400 mg / ml (de colágeno 400) y la inicial número de células de siembra-7,5 eh es 1x10 <sup...

Este manuscrito presenta un protocolo detallado para la fabricación de una plataforma de cultivo de hepatocitos tridimensional emergente, el andamio de cristal coloidal invertido, y las técnicas concomitantes para evaluar el comportamiento de los hepatocitos. Los poros de tamaño controlable, la interconectividad y la capacidad de conjugar proteínas de la matriz extracelular con el andamio de poli(etilenglicol) (PEG) mejoran el rendimiento de las células Huh-7.5.

La fabricación de cristal invertida coloidal poli (etilenglicol) Andamios: Una célula Plataforma de cultivo tridimensional para ingeniería de tejidos de hígado

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

El objetivo general de este procedimiento es fabricar andamios de cristales coloidales invertidos a base de PEG con una matriz extracelular codificada para aplicaciones de ingeniería de tejidos hepáticos. La ingeniería de tejidos hepáticos es un campo prometedor dentro de la ingeniería de tejidos y la medicina regenerativa. Estamos creando andamios tridimensionales que permiten a las células hepáticas mantener su función durante largos períodos de tiempo.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la prueba de fármacos, ya que las células hepáticas cultivadas con este sistema pueden mantener su función durante más tiempo y presentar una mejor respuesta al fármaco. Aunque este método puede aportar información sobre la ingeniería de tejidos, también puede aplicarse a otros sistemas, como aquellos que utilizan células madre. Quien demostrará el procedimiento será Hitomi, una estudiante de posgrado de mi laboratorio.Para preparar los moldes de microperlas, primero corte las puntas de los tubos microcentrífugos resistentes al hervido de 0,2 mililitros al nivel de 40 microlitros. Utilice pegamento impermeable para adherir las partes superiores de los tubos cortados a cubreobjetos de vidrio para microscopio y luego pegue alrededor de los moldes. A continuación, reemplace el agua en un frasco de microesferas de poliestireno con etanol al 70%.Coloque la solución de esferas en un baño ultrasónico y someta la mezcla a sonicación a 30 vatios durante tres minutos para desagregar las esferas. Una vez preparadas las microesferas, pipetee 100 microlitros de etanol en cada uno de los moldes. A continuación, corte cuatro milímetros del extremo superior de una punta de pipeta de 200 microlitros y úsela para pipetear 25 microlitros de las microesferas de poliestireno en el molde dos veces.Coloque los moldes en un agitador rotatorio y ajústelo a 120 rpm. Deje las muestras en el agitador durante la noche. Al día siguiente, coloque los moldes bajo un microscopio y verifique que las esferas estén ordenadas hexagonalmente.Deje que el etanol se evapore a temperatura ambiente durante dos noches. En ese momento, coloque cuidadosamente el complejo de molde y perlas en un horno a 130 grados Celsius durante seis horas para recocer las perlas de poliestireno y formar la réplica negativa del andamio 3D. Primero, sintetice macrómeros de diacrilato de polietilenglicol utilizando protocolos establecidos, como se describe en estas dos referencias.A continuación, prepare una solución al 50% de PEGDA en agua desionizada y centrifugue la mezcla hasta que se disuelva completamente. Para andamios conjugados con matriz extracelular, agregue un 10% adicional de PEG NHS de aceite de krill a la solución al 50% de PEGDA. Luego, prepare una solución stock al 20% del fotoiniciador en etanol al 70%.Agregue 50 microlitros de la solución de iniciador fotoquímico por cada mililitro de la mezcla de PEGDA. Luego, vortexee la mezcla durante un minuto. A continuación, retire los moldes de las laminillas de vidrio, extraiga cuidadosamente las redes utilizando una espátula y colóquelas en tubos centrífugos separados de 1,5 mililitros.Pipetee 300 microlitros de la solución de PEGDA en cada tubo, y luego centrifugue los tubos para permitir que la solución de PEGDA se infiltre en la red de poliestireno. A continuación, retire la red del tubo usando pinzas y seque cuidadosamente el exceso de solución de PEGDA de la superficie. Coloque la red sobre una lámina de parafina cubierta de vidrio, con la superficie plana y circular orientada hacia arriba.Luego, exponga el andamio a luz ultravioleta de 365 nanómetros durante cinco minutos utilizando una lámpara de luz UV. Coloque alrededor de diez redes cristalinas polimerizadas de PEGDA en un vial nuevo y agregue 20 mililitros de THF. Agite los viales en un agitador orbital a 300 RPM durante seis horas.Retire el vial cada una o dos horas y sustituya el disolvente que contiene el polímero por THF fresco. Después del último lavado, añada agua a la solución de THF usada para verificar si las esferas de PS se han disuelto completamente. Si la solución es blanca, realice lavados adicionales hasta que la solución quede transparente.Para esterilizar los andamios, prepare un tubo microcentrífugo de 50 mililitros con dos mililitros de etanol al 70% por cada andamio y coloque los andamios en el tubo utilizando una espátula. Deje remojar los andamios en etanol durante una hora. Después de una hora, vierta cuidadosamente el etanol y reemplácelo con un volumen igual de PBS estéril.Luego, centrifugue los andamiajes para eliminar cualquier burbuja. Almacene los andamiajes centrifugados a cuatro grados Celsius y extráigalos cada una a dos horas para reemplazar la solución con PBS fresco. Después de varios cambios en PBS, retire los andamiajes que serán recubiertos con colágeno y colóquelos en un tubo que contenga un mililitro de colágeno tipo uno por cada andamiaje a recubrir.A continuación, centrifugue el tubo como antes y luego agite los andamios a 400 RPM en un agitador orbital durante 30 minutos. Almacene los andamios durante la noche a cuatro grados Celsius. Cultive células de hepatocarcinoma en placas de cultivo celular de 100 milímetros con 10 mililitros de medio de cultivo.Cambie el medio cada tres días hasta que la densidad celular alcance del 75 al 80 % de la superficie de cultivo. Cuando las células estén listas, coloque cuidadosamente los andamios con la superficie plana hacia arriba en una placa de 24 pocillos. Luego, enjuague cada andamio con dos mililitros de PBS.Aspire el PBS y agregue dos mililitros de medio de crecimiento a los andamios. Después de 30 minutos, retire el medio y deje secar el andamio durante una hora. A continuación, recolecte las células de hepatocarcinoma utilizando el método de digestión con tripsina.Después de centrifugar las células, elimine el sobrenadante y re-suspenda el precipitado de modo que haya un millón de células por 25 microlitros. Pipetee lentamente 25 microlitros de la suspensión celular directamente encima de cada andamio. Luego, cúbrala placa y colóquela en el incubador durante la noche.A continuación, transfiera con cuidado los andamios a una nueva placa de 24 pocillos y agregue mediante pipeta dos mililitros de medio a cada pocillo antes de devolver la placa al incubador. Se muestra aquí un microscopio electrónico de barrido del andamio. Está compuesto por una disposición hexagonal compacta de poros cuyo diámetro promedio oscila entre 100 y 105 micrones, formando interconexiones con los poros vecinos que en su mayoría tienen entre 35 y 40 micrones de diámetro.Cuando se siembran células de hepatocarcinoma, estas crecen y proliferan en andamios previamente recubiertos con colágeno tipo uno, pero no aumentan en número en los andamios desnudos. Además, las células de hepatocarcinoma en los andamios recubiertos con colágeno mostraron una mayor función celular de manera dependiente de la concentración. En el día 14, las células de hepatocarcinoma cultivadas en andamios ICC recubiertos con 400 microgramos por mililitro secretaron más del triple de albúmina en comparación con las cultivadas en el andamio desnudo.Al intentar este procedimiento, es importante recordar asegurarse de que las esferas de poliestireno en el entramado estén dispuestas adecuadamente. Una disposición deficiente dará lugar a una mala interconectividad, lo que puede afectar negativamente la actividad celular. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo fabricar andamios de cristales coloidales invertidos basados en PEG con recubrimiento y estructura celciada.No olvide que trabajar con tetrahidrofuran puede ser peligroso y siempre se deben tomar precauciones, como operar en un campanario de extracción y usar guantes y gafas, al realizar este procedimiento.

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