Name: La fabricación de cristal invertida coloidal poli (etilenglicol) Andamios: Una célula Plataforma de cultivo tridimensional para ingeniería de tejidos de hígado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Aprende a fabricar andamios de cristal coloidal invertido de PEG para ingeniería de tejido hepático tridimensional. Este método mejora el mantenimiento de la función de hepatocitos Huh-7.5 y optimiza las aplicaciones en pruebas de fármacos.

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Los autores desean agradecer el apoyo de una beca de la Fundación de Investigación Nacional (NRF -NRFF2011-01) y el Programa de Investigación Competitiva (NRF-CRP10-2012-07).

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos que divulgar.

Andamios de ingeniería de tejidos están evolucionando rápidamente para proporcionar todas las señales físicas y bioquímicas necesarias para regenerar, mantener o reparar los tejidos para la aplicación de la sustitución de órganos, el estudio de la enfermedad, el desarrollo de fármacos, y muchos otros 57. En la ingeniería de tejidos de hígado, los hepatocitos primarios humanos pierden rápidamente sus funciones metabólicas una vez aislados del cuerpo, creando una gran necesidad de andamios de ingeniería y el de...

El hígado es un órgano altamente vascularizado con una multitud de funciones, incluyendo la desintoxicación de la sangre, el metabolismo de xenobióticos, y la producción de proteínas séricas. El tejido del hígado tiene una microestructura tridimensional compleja (3D), que consta de múltiples tipos de células, canalículos biliares, sinusoides, y zonas de diferente composición biomatriz y diferentes concentraciones de oxígeno. Dada esta estructura elaborada, ha sido difícil crear un modelo de hígado adecuado in vitro 1. Sin embargo, hay una creciente demanda de funcional en modelos in vitro de alojamiento hepatocitos humanos como plataformas para la toxicidad del fármaco de prueba 2 y el estudio de enfermedades asociadas con el hígado 3. Plataformas de ingeniería de tejido hepático actual han simplificado la complejidad del hígado mediante el aislamiento de uno, o concentrarse en unos pocos, de los parámetros del hígado, es decir, co-cultivo de células 4, la composición bioquímica de la zonal microambientes 5, la dinámica de flujo de 6,7 y la configuración de la biomatriz 8. La configuración de la biomatriz se puede dividir en parámetros tales como materiales de andamiaje, la composición de proteínas de la matriz extracelular (ECM), la rigidez de la matriz, así como el diseño y la estructura del andamio. Ha habido un aumento en los estudios de ingeniería de tejidos utilizando hidrogeles sintéticos, especialmente poli (etilenglicol) (PEG) hidrogeles 9, dada la capacidad de sintonizar propiedades mecánicas, bioactividad, y la velocidad de degradación del hidrogel. En cuanto a la investigación relacionada con el hígado, se aplicó el hidrogel biocompatible para estudiar la infección por virus de la enfermedad hepática 3. Como diseño de la plataforma de hepatocitos, numerosos estudios han utilizado cultivos sándwich de hepatocitos 10,11 y encapsulación de células dentro de un hidrogel 12,13 para proporcionar el entorno 3D y célula-ECM y la interacción célula-célula que son esenciales para imitar en el microambiente vivo. Howeembargo, estas plataformas no poseen un alto grado de control y organización espacial, que conduce a propiedades no uniformes a través del andamio 14. El cristal coloidal invertida (CPI) 14 andamio es un andamio 3D altamente organizada para el cultivo celular que se introdujo por primera vez en la década de 2000. estructura única del andamio se puede atribuir al proceso de fabricación sencillo que utiliza un cristal coloidal, un enrejado ordenado de partículas coloidales de diámetro variable. En pocas palabras, para resumir el proceso, las partículas están bien ordenados y recocidas utilizando calor para formar un enrejado. La lixiviación de esta celosía, por un disolvente orgánico, en un polimerizados resultados de hidrogel en cavidades esféricas hexagonal empaquetados 15 con alta área superficial. Este andamio altamente ordenada se ha hecho previamente con ambos materiales sintéticos y naturales, incluyendo, pero no limitado a, poli (acrilamida) 16-21, poli (láctico-co-ácido glicólico) 15,22-30, Poli (etileno glicol) 31,32, poli (metacrilato de 2-hidroxietilo) 21,33-35, y quitosano 36-39. Andamios ICC hechos de materiales no-incrustantes tienden a promover esferoides celulares dentro de las cavidades 14,23,40. Múltiples tipos de células se ha demostrado que la proliferación de éxito, diferenciar y función dentro de esta configuración, incluyendo condrocitos 41, células estromales de médula ósea 42, y células madre 43,44. En cuanto a los hepatocitos, se han realizado estudios con andamios ICC hechos de Na 2 SiO 3 y poli (acrilamida), pero no PEG. Con las estrategias bioconjugation simples (es decir, a través de acoplamiento de aminas EDC / NHS), andamios a base de PEG ECM proteínas conjugadas se pueden fabricar, que puede resultar más sitios de unión de células a ser más in vivo como el medio ambiente y mejorar la función hepática. En este manuscrito y el vídeo asociado, detallamos la fabricación del andamio CPIutilizando poli diacrilato de hidrogel (etilenglicol) (PEGDA) y una celosía de poliestireno de microesferas, optimizado para hepatocarcinoma (Huh-7.5) cultura. Se demuestra las diferencias entre los andamios ICC en general no adhesivos desnudos PEGDA y la PEGDA andamio ICC revestido con colágeno en términos de topología de andamio y rendimiento de la célula. La viabilidad celular y la función se miden cualitativa y cuantitativamente para evaluar el comportamiento de células Huh-7.5.

<table><tbody><tr><td>Tubo de PCR de 0,2 ml</td><td>Axygen Scientific</td><td>PCR-02D-C</td> Pegamento Gorila a <td>prueba de ebullición</td></tr><tr><td></td><td>Gorilla Glue, Inc.</td><td>Depende del proveedor. Esto se compró en una tienda local.</td><td></td></tr><tr><td>Correderas de vidrio</td><td>VWR</td><td>631-1575</td><td>Dimensiones: 24 veces; 60 mm2</td></tr><tr><td>Esferas de poliestireno</td><td>Fisher Scientific</td><td>TSS#4314A</td><td>Diámetro = 140 &micro; m; 3x104 partículas por mililitro y distribución de tamaño del 1,4%</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>1.00983.1011</td><td>absoluto para análisis EMSURE; Diluir al 70% con agua Milli-Q</td></tr><tr><td>Baño ultrasónico</td><td>Elma</td><td>S10H</td><td>Horno de equipo</td></tr><tr><td></td><td>Nabertherm</td><td>N7/H</td><td>Equipo</td></tr><tr><td>200 &micro; l punta de pipeta</td><td>Axygen Scientific</td><td>T-210-Y-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Agitador oscilante</td><td>VWR</td><td>444-0142</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenglicol (PEG)</td><td>Merck</td><td>1.09727.0100</td><td>Mw= 4 kDa; la acrilación de monómeros PEG y la purificación del precipitado resultante producen un macrómero PEGDA con Mw = 4,6&nbsp; </td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>392932</td><td>equipo</td></tr><tr><td>Acrilato-poli(etilenglicol) - Valerato de succinimidilo</td><td>Laysan Bio</td><td>ACRL-PEG-SVA-3400-1g</td><td>Mw = 3,4 kDa</td></tr><tr><td>2-hidroxi-4'-(2-hidroxietoxi)-2-metilpropiofenona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>410896</td><td></td></tr><tr><td>Vórtice</td><td>VWR</td><td>58816-123</td><td>Equipo</td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5404 000.413</td><td></td></tr><tr><td>Película de parafina</td><td>Parafilm M&nbsp;</td><td>#PM996</td><td>Se mantiene a 9" con una intensidad permitida de 10.84&nbsp; mW/cm2</td></tr><tr><td>Foco UV Bluewave 200</td><td>Blaze Technology&nbsp;</td><td>120008, 122300</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahidrofurano (THF)</td><td>Merck</td><td>107025</td><td></td></tr><tr><td>Agitador orbital</td><td>Heidolph</td><td>543-123120-00-5</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno Tipo I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3867-1VL</td><td>De rata 1x, sin CaCl2 & MgCl2; pH = 7.2</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Gibco</td><td>20012-027</td><td>16% W/V AQ. 10 x 10&nbsp; ml</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>VWR</td><td>43368.9M</td><td>Equipo</td></tr><tr><td>Freezone 4.5 liofilizador</td><td>Labconco</td><td></td><td>7750020 Equipo Recubrimiento</td></tr> por <tr><td>pulverización catódica</td><td>Jeol Ltd.</td><td>JFC-1600</td><td>Equipo</td></tr><tr><td>Microscopio Electrónico de Barrido</td><td>Jeol Ltd.</td><td>JSM 5310</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpos primarios anti-ratón contra el colágeno tipo I</td><td>Abcam</td><td>ab6308</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario anti-ratón conjugado con Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A21121</td><td></td></tr><tr><td>Placa, cultivo de tejidos 24 pocillos, fondo plano (Nunclon)&nbsp;</td><td>Bio-Rev PTE LTD</td><td>3820-024</td><td></td></tr><tr><td>Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) 2,5 g/L de glucosa con L-Gln</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (P/S)</td><td>Life Tchnologies</td><td>15140-122 E</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Placas de cultivo sin tratar Corning</td><td>Sigma Aldrich CLS430591</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.25% Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Equipo; 37&nbsp; &deg; C, 5% de humedad</td></tr><tr><td>Forma Steri-Cycle CO2 Incubadoras</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>371</td><td></td></tr><tr><td>Hausser Bright-Line Hemacitómetro</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Viabilidad/Citotoxicidad Vivo/Muerto para células de mamíferos</td><td>Life Technologies</td><td>L3224&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ensayo CCK-8</td><td>Dojindo Laboratories</td><td>CK04-11</td><td>Reactivo de sal de monosodio (MSR)</td></tr><tr><td>Lector de microplacas Infinite 200 PRO&nbsp;</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albúmina Kit ELISA Humano</td><td>Abcam</td><td>ab108788</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610407</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153-50G</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpos primarios anti-ratón (contra CYP3A4, albúmina)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53850; sc-271605</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 etiquetado como Phalloidin</td><td>Life Technologies</td><td>A34055</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>VWR</td><td>22706.326</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>DPEC</td><td>agua Thermofisher Scientific</td><td>AM9916</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000c Espectrofotómetro</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>iScript Transcripción inversa Supermix&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1708840</td><td></td></tr><tr><td>SYBR seleccionan Master Mix para CFX</td><td>Life Technology</td><td>4472937</td><td></td></tr><tr><td>Primers (a elegir)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Real-Time System, C-1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio Rad Laboratories</td><td>SOFT-CFX-31-PATCH&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

la fabricación de cristal invertida coloidal poli (etilenglicol) andamios: una célula plataforma de cultivo tridimensional para ingeniería de tejidos de hígado

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

La capacidad para mantener la función de los hepatocitos in vitro, para el propósito de probar la citotoxicidad xenobióticos &#39;, el estudio de la infección por virus y el desarrollo de fármacos dirigidos en el hígado, requiere una plataforma en la que las células reciben señales bioquímicas y mecánicas adecuadas. sistemas recientes de ingeniería de tejidos de hígado han empleado andamios tridimensionales (3D) compuestas de hidrogeles sintéticos o naturales, dado su alta retención de agua y su capacidad de proporcionar los estímulos mecánicos necesarios por las células. Ha habido un creciente interés en el andamio invertida cristal coloidal (ICC), un desarrollo reciente, que permite a la organización espacial alta, homotipica e interacción celular heterotıpica, así como la matriz de interacción célula extracelular (ECM). En este documento, se describe un protocolo para fabricar el andamio ICC utilizando poli diacrilato (etilenglicol) (PEGDA) y el método de lixiviación de partículas. En pocas palabras, una celosía está hecho de partículas de microesferas, después de lo cual un pre-de poSe añade solución r, adecuadamente polimeriza, y las partículas se retiran, o lixiviado, usando un disolvente orgánico (por ejemplo, tetrahidrofurano). La disolución de los resultados de celosía en un andamio altamente poroso con tamaños y interconectividades que permiten los medios de comunicación para llegar a las células más fácilmente de poros controlados. Esta estructura única permite a área de superficie alta para que las células se adhieren a, así como fácil la comunicación entre los poros, y la capacidad de recubrir el andamio ICC PEGDA con proteínas también muestra un efecto marcado en el rendimiento de la célula. Se analiza la morfología del esqueleto, así como el hepatocarcinoma celular (Huh-7.5) el comportamiento en términos de viabilidad y la función de explorar el efecto de la estructura de la CPI y revestimientos de ECM. En general, este documento proporciona un protocolo detallado de un andamio emergente que tiene amplias aplicaciones en la ingeniería de tejidos, especialmente la ingeniería de tejidos del hígado.

Los resultados representativos para la caracterización estructural del andamio CPI y la comparación de la eficacia de cada condición del andamio de la CPI en el cultivo de hepatocitos se muestran y explican a continuación. Las condiciones de andamio ICC utilizados en estos resultados son recubrimientos de colágeno de 0 g / ml (desnudo), 20 mg / ml (de colágeno 20), 200 mg / ml (de colágeno 200), y 400 mg / ml (de colágeno 400) y la inicial número de células de siembra-7,5 eh es 1x10 <sup...

Este manuscrito presenta un protocolo detallado para la fabricación de una plataforma de cultivo de hepatocitos tridimensional emergente, el andamio de cristal coloidal invertido, y las técnicas concomitantes para evaluar el comportamiento de los hepatocitos. Los poros de tamaño controlable, la interconectividad y la capacidad de conjugar proteínas de la matriz extracelular con el andamio de poli(etilenglicol) (PEG) mejoran el rendimiento de las células Huh-7.5.

La fabricación de cristal invertida coloidal poli (etilenglicol) Andamios: Una célula Plataforma de cultivo tridimensional para ingeniería de tejidos de hígado

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

El objetivo general de este procedimiento es fabricar andamios de cristales coloidales invertidos a base de PEG con una matriz extracelular codificada para aplicaciones de ingeniería de tejidos hepáticos. La ingeniería de tejidos hepáticos es un campo prometedor dentro de la ingeniería de tejidos y la medicina regenerativa. Estamos creando andamios tridimensionales que permiten a las células hepáticas mantener su función durante largos períodos de tiempo.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la prueba de fármacos, ya que las células hepáticas cultivadas con este sistema pueden mantener su función durante más tiempo y presentar una mejor respuesta al fármaco. Aunque este método puede aportar información sobre la ingeniería de tejidos, también puede aplicarse a otros sistemas, como aquellos que utilizan células madre. Quien demostrará el procedimiento será Hitomi, una estudiante de posgrado de mi laboratorio.Para preparar los moldes de microperlas, primero corte las puntas de los tubos microcentrífugos resistentes al hervido de 0,2 mililitros al nivel de 40 microlitros. Utilice pegamento impermeable para adherir las partes superiores de los tubos cortados a cubreobjeto

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Describimos una plataforma basada en el chip para el cultivo en tres dimensiones de las células de micro-biorreactores. Un chip puede albergar hasta 10 millones de euros. células que pueden ser cultivadas bajo condiciones definidas con precisión en lo que respecta al flujo de fluidos, etc tensión de oxígeno en un asa estéril, cerrado de circulación.

Basada en el chip tridimensional de cultivo celular en perfundido Micro-biorreactores

Para la creación de estructuras altamente organizadas de tejido complejo, se deben ensamblar múltiples tipos de materiales y células en un compuesto integrado.  Este diseño combinatorio incorpora láminas de células estratificadas específicas de órganos con dos materiales distintos derivados de la biología que contienen una fuerte base de matriz fibrosa y células endoteliales para mejorar la formación de nuevos vasos.

Ingeniería de tejidos: Construcción de un multicelular 3D Andamios para la entrega de láminas de células en capas

La matriz extracelular específica del tejido (ECM) es un mediador clave de la función celular. Este artículo describe métodos para la síntesis de espumas y microportadores que son estables en cultivo sin la necesidad de reticulación química para aplicaciones en 3D avanzados en modelos de cultivo celular in vitro o como matrices biodegradables pro-regenerativas puros ECM-derivado.

La fabricación de espumas y microportadores derivados de la matriz extracelular como específica de tejido de cultivo celular y las plataformas de entrega

Este protocolo describe la fabricación de microcryogels elástico macroporoso 3D integrando microfabricación con tecnología cryogelation. A cargar con las células, se generan microtissues 3D, que puede ser fácilmente inyectados en vivo para facilitar la terapia regenerativa o montado en arreglos de discos para en vitro screening de drogas de alto rendimiento.

Microtissues 3D para la terapia regenerativa inyectable y drogas de alto rendimiento

Aquí, presentamos un protocolo para obtener sistemas 3D-cultura en uno mismo-montaje de andamios péptido para promover la diferenciación de condrocitos articulares humanos dedifferentiated en tejido similar al cartílago.

Cultivo de células de mamífero en andamios tridimensionales péptido

Este protocolo presenta un modelo biomimético 3D con compartimento estromal fibromático que lo acompaña. Preparado con hidrogeles fisiológicamente relevantes en proporciones que imitan las propiedades biofísicas de la matriz extracelular estromal, un mediador activo de interacciones celulares, crecimiento tumoral y metástasis.

Un modelo biomimético para el cáncer de hígado para estudiar las interacciones tumorales-estroma en un entorno 3D con propiedades biofísicos ajustables

Las enfermedades hepáticas son inducidas por muchas causas que promueven la fibrosis o la cirrosis. El trasplante es la única opción para recuperar la salud. Sin embargo, dada la escasez de órganos trasplantables, se deben explorar alternativas. Nuestra investigación propone la implantación de andamios de colágeno en tejido hepático a partir de un modelo animal.

Implantación de andamio de matriz de colágeno tridimensional como estrategia de regeneración hepática

El presente protocolo optimiza los métodos de perfusión/descelularización in situ hepática y microscopía de dos fotones para establecer una plataforma confiable para visualizar la dinámica de la remodelación de la matriz extracelular (MEC) durante la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA).

Imágenes 3D de la matriz extracelular hepática en un modelo de ratón de esteatohepatitis no alcohólica

Los organoides revolucionan el modelado personalizado de tejidos para el desarrollo de órganos, el descubrimiento de fármacos y la investigación de enfermedades. La ingeniería de organoides avanza en la creación de intrincados tejidos sintéticos. El objetivo es integrar la morfogénesis, la tecnología de ensamblaje y las biomatrices para avanzar en la ingeniería de tejidos. Este protocolo ayuda a modelar la organogénesis hepática y a establecer directrices para la construcción de tejidos...

Técnicas de cultivo in vitro para modelar la organogénesis del hígado, construir ensamblajes y diseñar tejidos sintéticos utilizando líneas celulares humanas

Este protocolo presenta una técnica optimizada de perfusión hepática de colagenasa en dos pasos en un modelo de rata y muestra el uso de hepatocitos aislados para el cultivo in vitro a largo plazo de organoides 3D.

Perfusión hepática de rata y aislamiento primario de hepatocitos: un antiguo procedimiento crucial para el cultivo de organoides 3D de última generación

Aprende a fabricar andamios de cristal coloidal invertido de PEG para ingeniería de tejido hepático tridimensional. Este método mejora el mantenimiento de la función de hepatocitos Huh-7.5 y optimiza las aplicaciones en pruebas de fármacos.

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