Generación de inmunoprecipitación de la cromatina nativa secuenciación bibliotecas para el análisis de densidad de nucleosoma

El objetivo general de este procedimiento es generar bibliotecas de secuenciación de inmunoprecipitación de cromatina nativa para el análisis de la densidad de nucleosomas. Este método puede responder a preguntas de epigenética, como la revelación de características epigenómicas en una población celular a un solo nivel de nucleosoma y la resolución de firmas heterogéneas de cromatina en sus elementos continuos. La principal ventaja de esta técnica es utilizar la propiedad de la MNasa de acceso preferencial a la región abierta de la cromatina para generar una medición que combina la accesibilidad de la MNasa con la modificación de histonas.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque no pueden obtener una digestión óptima de la MNasa. Comience este protocolo con la preparación de la célula como se describe en el protocolo de texto. El primer día, descongele cada pellet de celda en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 10 segundos.

Luego, transfiera las células a hielo. A cada gránulo de celda, agregue inmediatamente un tampón de lisis helado one-X más un PIC x-X hasta una concentración final de 10.000 celdas por 20 microlitros. Mezclar 10 veces pipeteando hacia arriba y hacia abajo sin crear burbujas.

Trabajando en hielo, alícuota 20 microlitros por pocillo de los lisados resultantes en una placa de 96 pocillos. Cubra el plato con el sello de plástico antes de incubar en hielo durante 20 minutos. Etiquete la placa como MNase y registre los pocillos en una clave de plantilla.

Justo antes de completar la lisis de 20 minutos, diluya la enzima MNasa one con el tampón de dilución MNasa one hasta una concentración final de 20 unidades por microlitro y manténgalo en hielo. Trabajando en hielo, prepare la mezcla maestra de digestión MNase one como se describe en el protocolo de texto. Luego, alícuota 20 microlitros de la mezcla maestra por cada fila de muestras, más cinco microlitros de volumen adicional en una placa de depósito de 96 pocillos.

Después de que los lisados terminen de incubarse, retire la placa de digestión MNase del hielo. Con una pipeta multicanal, agregue 20 microlitros de MNnase una mezcla maestra de digestión en cada fila de muestras y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces. Cambia las puntas entre filas.

Luego, incube la placa a temperatura ambiente durante exactamente cinco minutos. Para detener la reacción después de cinco minutos, use una pipeta multicanal para agregar seis microlitros de EDTA de 250 micromolares en cada fila de muestras y mezcle hacia arriba y hacia abajo varias veces. Asegúrate de cambiar las puntas entre filas.

Después de la adición de EDTA, cambie el ajuste de la pipeta a 20 microlitros y mezcle 10 veces como antes para asegurar la detención completa de la reacción de digestión. Finalmente, agregue seis microlitros de tampón de lisis 10X a cada fila de muestras digeridas con MNase y mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces. Cubra el plato con un sello de plástico e incube en hielo durante 15 minutos.

Prepare la placa del complejo de perlas de anticuerpos y la placa de pre-aclaramiento como se describe en el protocolo de texto. Gire rápidamente ambas placas centrifugando durante 10 segundos a 200 veces G. Luego, coloque la placa compleja de perlas de anticuerpos en un imán de placa y espere 15 segundos para que la solución se aclare. Retire y deseche con cuidado el sobrenadante con una pipeta sin alterar las perlas.

Luego, retire la placa del imán de la placa y manténgala en hielo. Coloque la placa de reacción de prelimpieza en un imán de placa y espere 15 segundos para que las perlas se separen y la solución se aclare. Sin alterar las perlas, utilice una pipeta para transferir cuidadosamente el sobrenadante a los pocillos correspondientes de la placa del complejo de perlas de anticuerpos mantenida en hielo.

Mezcle cada pozo suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo 15 veces. Selle bien la placa con una cubierta de placa de aluminio e incube durante la noche a cuatro grados centígrados en una plataforma giratoria. Después de la incubación, vuelva a etiquetar la placa IP Reaction.

El segundo día, ajuste el mezclador de calentamiento a 65 grados centígrados, luego prepare un tampón de lavado con bajo contenido de sal y un tampón de lavado con alto contenido de sal en hielo. Gire rápidamente la placa de reacción IP durante 10 segundos a 200 veces G.Coloque la placa de reacción IP en un imán de placa y espere 15 segundos para que la solución se aclare. Con una pipeta multicanal, sin alterar las perlas, retire y deseche con cuidado el sobrenadante.

Retire el plato del imán de la placa y colóquelo sobre hielo. A cada fila de muestras en la placa de reacción IP, agregue 150 microlitros de tampón de lavado bajo en sal helado y mezcle lentamente hacia arriba y hacia abajo durante 10 veces para volver a suspender completamente las perlas. Vuelva a colocar la placa de reacción IP en el imán de la placa y retire el sobrenadante como antes.

Luego, vuelva a colocar la placa en hielo y repita los pasos de lavado para un total de dos lavados. Trabajando con hielo, agregue 150 microlitros del tampón de lavado con alto contenido de sal a cada fila de muestras en la placa de reacción IP. Mezcle las muestras lentamente pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces para volver a suspender completamente las perlas.

Después de retirar el sobrenadante como antes, coloque la placa de reacción IP en hielo y enfríe previamente una nueva placa de 96 pocillos a su lado. A cada fila de muestras en la placa de reacción IP, agregue 150 microlitros del tampón de lavado con alto contenido de sal y mezcle lentamente 10 veces pipeteando hacia arriba y hacia abajo para volver a suspender completamente las perlas. Después de la resuspensión, transfiera cada fila de muestras a la fila correspondiente de la nueva placa de 96 pocillos preenfriada.

Deseche el plato viejo. Coloque la nueva placa de reacción IP en el imán de la placa y deseche el sobrenadante como antes. Mantenga el plato a temperatura ambiente.

A cada fila de muestras en la placa de reacción IP, agregue 30 microlitros del tampón de elución ChIP y mezcle lentamente pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces. Tenga cuidado de evitar la formación de burbujas. Selle la placa con una cubierta de PCR e incube en un mezclador de calentamiento a 65 grados Celsius durante 1 1/2 horas con una velocidad de mezcla de 1, 350 RPM.

Después de una incubación de 1 1/2 hora, gire la placa de reacción IP a 200 veces G durante un minuto a cuatro grados Celsius. Luego, coloque la placa de reacción IP en un imán de placa y espere a que la solución se aclare. Con una pipeta multicanal, sin alterar las perlas, transfiera con cuidado 20 microlitros del sobrenadante a una nueva placa de 96 pocillos utilizando puntas nuevas para cada fila.

Etiquete la placa IP Reaction y manténgala a temperatura ambiente. Proceda a la digestión de proteínas seguida de la construcción de la biblioteca como se describe en el protocolo de texto. Aquí se muestran los resultados representativos de la cromatina digerida por MNasa óptima, subdigerida y sobredigerida antes de la generación de la biblioteca.

El perfil de digestión óptima está dominado por tamaños de fragmentos de nucleosoma únicos, mientras que no se digiere en exceso para permitir la recuperación de fragmentos de nucleosoma de orden superior. La digestión subóptima de la cromatina también será evidente en el perfil de la biblioteca de secuenciación generada a partir del material IP. Para validar las bibliotecas mediante qPCR, se evaluó el enriquecimiento de pliegues de las bibliotecas IP con respecto a la biblioteca de entrada para los objetivos positivos y negativos.

Además, la inspección de las lecturas alineadas de las bibliotecas con un alto enriquecimiento de pliegues evaluado por qPCR en un navegador del genoma debería revelar enriquecimientos visualmente detectables en comparación con la biblioteca de entrada. Las bibliotecas de secuenciación ChIP de densidad de nucleosomas exitosas contendrán réplicas altamente correlacionadas con una porción significativa de lecturas alineadas dentro de picos enriquecidos identificados por MACS2. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos días si se realiza correctamente.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar bibliotecas de secuenciación de inmunoprecipitación de cromatina nativa para el análisis de densidad de nucleosomas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe asegurarse de que la cromatina se digiera de manera óptima y solo usar anticuerpos que muestren una alta afinidad con el epítopo de interés y muestren poca o ninguna reactividad cruzada con otros epítopos. Siguiendo este procedimiento, se puede realizar un modelado computacional de la accesibilidad de MNase para responder a preguntas como las firmas epigenéticas debidas a la heterogeneidad dentro de una población celular.

Este método proporciona información sobre el efecto combinatorio de la posición de los nucleosomas y la densidad local, así como la modificación postraduccional de sus subunidades de histonas, y se puede aplicar a cualquier sistema, como humanos o ratones, células primarias y tejidos congelados.