Generación de inmunoprecipitación de la cromatina nativa secuenciación bibliotecas para el análisis de densidad de nucleosoma

El objetivo general de este procedimiento es generar bibliotecas de inmunoprecipitación de cromatina nativa para el análisis de secuenciación de densidad de nucleosomas. Este método puede responder preguntas en epigenética, como revelar características epigenómicas en una población celular a nivel individual de nucleosomas y resolver firmas de cromatina heterogéneas en sus elementos continuos. La ventaja principal de esta técnica es aprovechar la propiedad de la MNasa de acceso preferencial a las regiones de cromatina abierta para generar una medición que combine la accesibilidad de la MNasa con la modificación de histonas.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque no podrán obtener una digestión óptima con MNasa. Comience este protocolo con la preparación de las células tal como se describe en el protocolo escrito. En el día uno, descongele cada pellet celular en un baño de agua a 37 grados Celsius durante 10 segundos.

Luego, transfiera las células a hielo. A cada pellet celular, agregue inmediatamente un tampón de lisis frío al hielo al 1X más PIC al 1X hasta una concentración final de 10.000 células por 20 microlitros. Mezcle 10 veces pipeteando hacia arriba y hacia abajo sin crear burbujas.

Trabajando en hielo, alícuota 20 microlitros por pocillo de los lisados resultantes en una placa de 96 pocillos. Cubra la placa con el sello de plástico antes de incubar en hielo durante 20 minutos. Etiquete la placa como MNase y registre los pocillos en una clave de plantilla.

Poco antes de que finalice la lisis de 20 minutos, diluya la enzima MNasa uno con el tampón de dilución de MNasa uno hasta una concentración final de 20 unidades por microlitro y manténgala en hielo. Trabajando en hielo, prepare la mezcla maestra de digestión de MNasa uno según se describe en el protocolo escrito. A continuación, alícuote 20 microlitros de la mezcla maestra por cada fila de muestras, más cinco microlitros de volumen adicional en una placa de depósito de 96 pocillos.

Una vez finalizada la incubación de los lisados, retire la placa de digestión con MNasa del hielo. Utilizando una pipeta multicanal, agregue 20 microlitros de la mezcla maestra de digestión con MNasa a cada fila de muestras y mezcle pipeteando arriba y abajo 10 veces. Cambie las puntas entre cada fila.

A continuación, incube la placa a temperatura ambiente durante exactamente cinco minutos. Para detener la reacción después de cinco minutos, utilice una pipeta multicanal para añadir seis microlitros de EDTA 250 micromolar a cada fila de muestras y mezcle de arriba abajo varias veces. Asegúrese de cambiar las puntas entre filas.

Después de la adición de EDTA, cambie la configuración de la pipeta a 20 microlitros y mezcle 10 veces como antes para asegurar la detención completa de la reacción de digestión. Finalmente, agregue seis microlitros de tampón de lisis 10X a cada fila de las muestras digeridas con MNasa y mezcle bien pipeteando arriba y abajo 10 veces. Cubra la placa con un sello de plástico e incube en hielo durante 15 minutos.

Prepare la placa del complejo de anticuerpo con perlas y la placa de pre-limpieza según se describe en el protocolo escrito. Centrifugue rápidamente ambas placas durante 10 segundos a 200 veces G. A continuación, coloque la placa del complejo de anticuerpo con perlas sobre un imán de placa y espere 15 segundos hasta que la solución se vuelva transparente. Retire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta y deséchelo, sin perturbar las perlas.

A continuación, retire la placa del imán para placas y déjela sobre hielo. Coloque la placa de reacción de pre-limpieza sobre un imán para placas y espere 15 segundos para que las perlas se separen y la solución se vuelva transparente. Sin perturbar las perlas, use una pipeta para transferir cuidadosamente el sobrenadante a los pozos correspondientes de la placa de complejo de perlas con anticuerpo mantenida sobre hielo.

Mezcle suavemente cada pocillo pipeteando hacia arriba y hacia abajo 15 veces. Selle el pocillo con una cubierta de aluminio para placas e incube durante la noche a cuatro grados Celsius en una plataforma rotatoria. Tras la incubación, vuelva a etiquetar la placa como Reacción de IP.

El segundo día, ajuste el mezclador de calentamiento a 65 grados Celsius y luego prepare un tampón de lavado con bajo contenido de sal y un tampón de lavado con alto contenido de sal sobre hielo. Centrifugue brevemente la placa de reacción de inmunoprecipitación durante 10 segundos a 200 veces G. Coloque la placa de reacción de inmunoprecipitación sobre un imán para placas y espere 15 segundos hasta que la solución se vuelva transparente. Utilizando una pipeta multicanal, sin perturbar los microperlas, retire y deseche cuidadosamente el sobrenadante.

Saque la placa del imán para placas y colóquela en hielo. A cada fila de muestras en la placa de reacción de IP, agregue 150 microlitros de tampón de lavado con bajo contenido salino enfriado con hielo y mezcle lentamente hacia arriba y hacia abajo 10 veces para resuspender completamente las perlas. Vuelva a colocar la placa de reacción de IP sobre el imán para placas y elimine el sobrenadante como antes.

Luego, coloque la placa nuevamente sobre hielo y repita los pasos de lavado para un total de dos lavados. Trabajando sobre hielo, agregue 150 microlitros del tampón de lavado de alto contenido salino a cada fila de muestras en la placa de reacción de inmunoprecipitación. Mezcle lentamente las muestras pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces para resuspender completamente las perlas.

Después de eliminar el sobrenadante como antes, coloque la placa de reacción de IP en hielo y enfríe previamente una nueva placa de 96 pocillos al lado. A cada fila de muestras en la placa de reacción de IP, añada 150 microlitros del tampón de lavado con alta salinidad y mezcle lentamente 10 veces pipeteando hacia arriba y hacia abajo para resuspender completamente las perlas. Tras la resuspensión, transfiera cada fila de muestras a la fila correspondiente de la nueva placa de 96 pocillos previamente enfriada.

Deseche la placa antigua. Coloque la nueva placa de reacción de IP sobre el imán para placas y deseche el sobrenadante como antes. Mantenga la placa a temperatura ambiente.

A cada fila de muestras en la placa de reacción de IP, agregue 30 microlitros del tampón de elución de ChIP y mezcle lentamente pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces. Tenga cuidado de evitar la formación de burbujas. Selle la placa con una cubierta para PCR e incúbela en un mezclador térmico a 65 grados Celsius durante 1 1/2 horas con una velocidad de agitación de 1.350 RPM.

Después de una incubación de 1 hora y media, centrifugar la placa de reacción de inmunoprecipitación a 200 × g durante un minuto a cuatro grados Celsius. A continuación, colocar la placa de reacción de inmunoprecipitación en un imán para placas y esperar a que la solución se aclare. Utilizando una pipeta multicanal, sin perturbar las perlas, transferir cuidadosamente 20 microlitros del sobrenadante a una nueva placa de 96 pocillos, utilizando puntas nuevas para cada fila.

Etiquete la placa como Reacción IP y manténgala a temperatura ambiente. Continúe con la digestión de proteínas seguida de la construcción de la biblioteca, tal como se describe en el protocolo escrito. Aquí se muestran resultados representativos de cromatina digerida con MNasa óptima, subdigerida y sobredigerida antes de la generación de la biblioteca.

El perfil óptimamente digerido está dominado por tamaños de fragmentos de nucleosomas individuales, sin estar sobre-digerido, para permitir la recuperación de fragmentos de nucleosomas de orden superior. La digestión subóptima de la cromatina también será evidente en el perfil de la biblioteca de secuenciación generada a partir del material de IP. Para validar las bibliotecas mediante qPCR, se evaluó el enriquecimiento relativo de las bibliotecas de IP con respecto a la biblioteca de entrada para dianas positivas y negativas.

Además, la inspección de las lecturas alineadas de bibliotecas con un alto enriquecimiento por plegado evaluado mediante qPCR en un navegador genómico debe revelar enriquecimientos visualmente detectables en comparación con la biblioteca de entrada. Las bibliotecas exitosas de secuenciación ChIP para densidad de nucleosomas contendrán réplicas altamente correlacionadas con una porción significativa de lecturas alineadas dentro de los picos enriquecidos identificados por MACS2. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en dos días si se lleva a cabo adecuadamente.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar bibliotecas de inmunoprecipitación de cromatina nativa seguida de secuenciación para el análisis de la densidad de nucleosomas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar asegurarse de que la cromatina esté digerida de manera óptima y utilizar únicamente anticuerpos que muestren una alta afinidad con el epítopo de interés y que presenten poca o ninguna reactividad cruzada con otros epítopos. Tras seguir este procedimiento, se puede realizar un modelado computacional de la accesibilidad de MNasa para responder preguntas como las firmas epigenéticas debidas a la heterogeneidad dentro de una población celular.

Este método proporciona información sobre el efecto combinatorio de la posición del nucleosoma y la densidad local, así como sobre la modificación postraduccional de sus subunidades histónicas, y puede aplicarse a cualquier sistema, como humanos o ratones, células primarias y tejidos congelados.