Name: Generación de inmunoprecipitación de la cromatina nativa secuenciación bibliotecas para el análisis de densidad de nucleosoma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Aprende a generar bibliotecas de ChIP-seq nativo para analizar la densidad de nucleosomas mediante digestión con MNase y medición de modificaciones de histonas. Este protocolo optimizado permite estudiar características epigenéticas a nivel de nucleosoma individual.

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A.L. fue apoyado por una beca de postgrado canadiense de los institutos canadienses de investigación en salud. Este trabajo fue financiado por becas del genoma British Columbia y los institutos canadienses de investigación en salud (CIHR-120589) como parte de la canadiense epigenética, medio ambiente y Consorcio iniciativa de investigación en salud y por el programa de Instituto de investigación de Terry Fox Proyecto beca #TFF-122869 M.H. y un Instituto de investigación de Terry Fox nuevo investigador Premio (Grant # 1039) a M.H.

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Dada la naturaleza combinatoria de la modificación de la cromatina y en la regulación transcripcional del nucleosoma, un método que permite mediciones simultáneas de estas características es probable que proporcionar nuevas penetraciones en la regulación epigenética. El protocolo de ndChIP-seq presentado aquí es un protocolo nativo de ChIP-seq optimizado para permitir la interrogación simultánea de la modificación de las histonas y la densidad de nucleosoma en células primarias9,10. ndChIP-seq utiliza la digestión enzimática de la cromatina que, cuando está juntado a secuenciación masivamente paralela extremo apareado y un modelo de distribución Gaussian de la mezcla, permite las modificaciones de las histonas de investigación a nivel individual nucleosoma y la deconvolución de perfiles epigenómica impulsado por heterogeneidad dentro de una población. Mediante este protocolo, hemos divulgado previamente una única distribución de tamaños de fragmento precipitado inmuno, determinado por extremo apareado leer límites, asociados con Estados de cromatina específico definidos por la ChromHMM10,24.
La calidad de una biblioteca de ndChIP-seq depende de múltiples factores, tales como especificidad de anticuerpo y sensibilidad, condiciones óptimas de digestión MNase y calidad de la cromatina. La especificidad de los anticuerpos utilizados es crucial en la producción de éxito ndChIP-seq biblioteca. Un anticuerpo ideal muestra alta afinidad contra el epitopo de interés con poca reactividad cruzada con otros epitopos. Es igualmente importante seleccionar granos magnéticos con la afinidad más alta para el anticuerpo de la opción.
MNase la digestión es una reacción crítica y sensibles al tiempo y concentración en el presente Protocolo. Por lo tanto, al procesar las muestras múltiples, es importante que cada reacción se incuba durante un tiempo equivalente (véase el paso 2.2). La calidad de la cromatina es otro factor que afecta significativamente el resultado de ndChIP-SS. fragmentado cromatina provoca un óptimo Perfil de digestión MNase y resultados en las bibliotecas con una baja relación señal a ruido. Muestras primarias con baja viabilidad celular o degradan la cromatina, como formalina-fijo tejido parafina-encajado de (FFPE) no se recomiendan para este protocolo.
La adición de una foto durante la extracción de cromatina reduce indeseado (es decir, al azar) cromatina fragmentación y conserva la integridad de colas de las histonas. Como tal, PIC debe agregarse al tampón de lisis y almacenador intermediario de la inmunoprecipitación justo antes de usar. Mientras que selecciona las células mediante citometría de flujo, seleccione para células viables y asegúrese de células se ordenan en un índice del flujo bajo para aumentar la precisión de la estimación del número de celular y viabilidad de las células. Evitar clasificar las células directamente en tampón de lisis. El búfer de vaina diluiría el tampón de lisis y evita eficaz permeabilización de la membrana celular a MNase. Dependiendo de un tipo de células u organismo, se requiera la titulación de MNase para obtener una óptima digestión.
ndChIP-seq en células de mamíferos requiere una profundidad mínima secuencia de 50 millones emparejado-Lee (fragmentos 25 millones) para marcas estrechas y Lee emparejado 100 millones (50 millones de fragmentos) para la entrada y grandes marcas. El algoritmo de distribución Gaussian de la mezcla no funcionará óptimamente en las bibliotecas que han sido ordenadas a una profundidad significativamente por debajo de esta recomendación. ndChIP-seq no va clasificar promotores con poca separación entre el valor de la distribución ponderada de mono - y di-nucleosoma fragmento longitudes en mono - o di-nucleosoma dominado promotores. Por lo tanto, estos promotores deben eliminarse en el análisis posterior. Réplicas biológicas pueden generarse para aumentar la confianza en las distribuciones previstas e identificar variabilidad técnica en la construcción de la digestión y la biblioteca de MNase.
A diferencia de las anteriores iteraciones de protocolos nativos de ChIP-seq, seq ndChIP proporciona los medios para investigar efecto combinatorio de modificación de estructura y las histonas de la cromatina mediante la utilización de fragmento tamaño post inmunoprecipitación para integrar la densidad de nucleosoma, determinada por la accesibilidad de MNase, con medidas de modificación de las histonas. Aplicación de ndChIP-seq para primaria de células y tejidos será proporcionar nuevas penetraciones en la naturaleza integradora de la regulación epigenética y permitir la identificación de la firma epigenética debido a la heterogeneidad de la población.

El genoma eucariota se empaqueta en cromatina mediante repetición de las estructuras del nucleosoma que consiste de dos copias de cuatro proteínas de histonas (p. ej., H2A, H2B, H3 y H4) circunscritos por 146 pares de bases de ADN1,2. Complejos de remodelación de cromatina controlan nucleosoma posición dentro de los límites de promotor del gen y participan en la regulación de la expresión génica mediante la alteración de accesibilidad de la DNA para factores de transcripción y la ARN polimerasa maquinaria3, 4.
Colas aminos terminal de las histonas en el nucleosoma son sometidas a diversas modificaciones covalentes, incluyendo acetilación, metilación, fosforilación, ubiquitylation, la sumoilación, formylation y la hidroxilación de los aminoácidos específicos5 , 6 , 7 , 8. posiciones y grados de estas modificaciones determinan un estado de cromatina que influyen en la cromatina estructura y control de acceso de los complejos moleculares que permiten la activación de la transcripción7. Dado que ambos modificación de densidad y las histonas del nucleosoma desempeñan un papel en el control local de la transcripción genética, hemos desarrollado un enfoque nativo de viruta que permite la medida simultánea de la densidad del nucleosoma y la histona modificación9, 10.
ChIP-seq nativo toma ventaja de la nucleasa de micrococo endonucleasa (MNase) para digerir la cromatina intacta en su estado nativo dentro del núcleo11,12, una propiedad que ha sido aprovechada para asignar nucleosoma posicionamiento13 , 14 , 15. densidad de nucleosoma ChIP-seq (ndChIP-seq) aprovecha la propiedad de acceso preferencial de MNase abrir regiones de la cromatina para generar medidas que combinan la accesibilidad MNase con histona modificación10. ndChIP-seq es adecuado para la elaboración de perfiles de modificaciones de las histonas en las células primarias raras, tejidos y células cultivadas. Aquí, presentamos un protocolo detallado que permite la generación de conjuntos de datos de secuencia adecuado para un marco analítico descrito anteriormente trabajo10 que integra el fragmento tamaño post inmunoprecipitación, determinada por extremo apareado leer límites, a al mismo tiempo investigar accesibilidad MNase con medidas de modificación de las histonas. Anteriormente, la aplicación del presente Protocolo a 10.000 sangre del cordón umbilical humano primario derivado CD34+ células y células madre embrionarias humanas revelaron relaciones únicas entre modificaciones de la estructura e histonas de la cromatina dentro de estos tipos10 de la célula . Dada su capacidad para medir simultáneamente el nucleosoma accesibilidad y modificación de las histonas, ndChIP-seq es capaz de revelar epigenómica características en una población de células en un nivel único de nucleosoma y resolver las firmas heterogéneas en su elementos constitutivos. Un ejemplo de la exploración de poblaciones celulares heterogéneas por ndChIP seq es investigación de promotores bivalentes, donde H3K4me3, una marca activa y H3K27me3, una marca represiva, están presentes10.

<table><tbody><tr><td>1M Tris-HCl &ndash; pH 7.5</td><td>Thermo Scientific</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>1M Tris-HCl &ndash; pH 8</td><td>Thermo Scientific</td><td>15568-025</td><td></td></tr><tr><td>0.5M EDTA</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>5M NaCl</td><td>Sigma</td><td>1001385276</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>1001412354</td><td></td></tr><tr><td>Desoxicolato de Sodio</td><td>Sigma 1001437582</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Thermo Scientific</td><td>15525-017</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>100% EtOH</td><td>NA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos con fondo en V (AB 1400)</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1400-L</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Gilson P2</td><td>Mandel</td><td>F144801</td><td></td></tr><tr><td>Gilson P10 pipeta</td><td>Mandel</td><td>F144802</td><td></td></tr><tr><td>Gilson P20 pipeta</td><td>Mandel</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>Gilson P100 pipetman</td><td>Mandel</td><td>F123615</td><td></td></tr><tr><td>Gilson P200 pipetman</td><td>Mandel</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>Gilson P1000 pipetman</td><td>Mandel</td><td>F123603</td><td></td></tr><tr><td>Micrococcal Nucleasa&nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0247S</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Mixer C (Mezclador de bloque calefactor)</td><td>Eppendorf</td><td>5382000023</td><td></td></tr><tr><td>Multi 12 canales Pippet P20</td><td>Rainin</td><td>17013803</td><td></td></tr><tr><td>Multi 12 canales Pippet P200</td><td>Rainin</td><td>17013805</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Tubo LoBind</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml Tubo LoBind</td><td>Eppendorf</td><td>22431005</td><td></td></tr><tr><td>Cubierta de placa de plástico</td><td>Edge Bio</td><td>48461</td><td></td></tr><tr><td>Cubierta de PCR</td><td>Bio Rad</td><td>MSD-1001</td><td></td></tr><tr><td>Cubierta de placa de aluminio</td><td>Bio Rad</td><td>MSF-1001</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de elución (tampón EB)</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>1M DTT</td><td>Sigma 646563</td><td></td><td></td></tr><tr><td>centrífuga Eppendorf 5810R&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>22625004</td><td></td></tr><tr><td>Agua ultrapura</td><td>Thermo Scientific</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>Dinaperlas de proteína G</td><td>Thermo Scientific</td><td>10001D</td><td></td></tr><tr><td>Dexas de proteína A</td><td>Thermo Scientific</td><td>10001D</td> Inhibidor de <td></td></tr><tr><td>la proteasa Cóctel</td><td>Calbiochem</td><td>539134</td><td></td></tr><tr><td>Plataforma giratoria</td><td>Mandel</td><td>1b109-12052010</td><td></td></tr><tr><td>Imán de placa</td><td>Alpaqua</td><td>2523</td><td></td></tr><tr><td>Tira abovedada de 12 tapas</td><td>Bio Rad</td><td>TCS1201</td><td></td></tr><tr><td>Buffer G2</td><td>Qiagen</td><td>1014636</td><td></td></tr><tr><td>Proteasa</td><td>Qiagen</td><td>19155</td><td></td></tr><tr><td>Imán de tubo (DynaMag-2)</td><td>Thermo Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Imán de tubo (DynaMag-2)</td><td>LabCore</td><td>730-006</td><td></td></tr><tr><td>Depósito de plástico en forma de V</td><td>Mandel</td><td>S0100A</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Mandel</td><td>C1801</td><td></td></tr><tr><td>Mini Fuge</td><td>Mettler Toledo</td><td>XS2035</td><td></td></tr><tr><td>Báscula analítica</td> Mandel <td>LB109-12052010</td><td></td><td>Tampón de</td></tr><tr><td>reacción de ligadura rápida, 5X</td><td>NEB</td><td>B6058S</td><td></td></tr><tr><td>ADN polimerasa I, fragmento grande (klenow)</td><td>NEB</td><td>M0210S</td> Fragmento de <td></td></tr><tr><td>Klenow (3'-5' exo)</td><td>NEB</td><td>M0212S</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN polimerasa</td><td>NEB</td><td>M0203S</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polinucleótido quinasa</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla de solución de desoxinucleótido, 10mM</td><td>NEB</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>dATP Solución 10mM</td><td>NEB</td><td>N0440S</td><td></td></tr><tr><td>Quick T4 DNA Ligasa</td><td>NEB</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5'-Trifosfato (ATP), 25mM</td><td>NEB</td><td>P0756S</td><td></td></tr><tr><td>ADN Polimerasa</td><td>Thermo Scientific</td><td>F549L</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2</td><td>NEB</td><td>B7002S</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada de Hank's</td><td>Thermo Scientific</td><td>14025076</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino&nbsp;</td><td>Solución</td> salina <td>A3160702</td><td></td></tr><tr><td>tampón de fosfato Thermo Scientific&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>H3K4me3</td><td>Señalización celular</td><td>9751S</td><td></td></tr><tr><td>H3K4me1</td><td>Diagenode</td><td>C15410037</td><td></td></tr><tr><td>H3K27me3</td><td>Diagenode</td><td>pAb-069-050</td><td></td></tr><tr><td>H3K36me3</td><td>Abcam</td><td>ab9050</td><td></td></tr><tr><td>H3K9me3</td><td>Diagenode</td><td>C15410056</td><td></td></tr><tr><td>SeraMag&nbsp; superparamagnético perlas</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generación de inmunoprecipitación de la cromatina nativa secuenciación bibliotecas para el análisis de densidad de nucleosoma

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Presentamos una inmunoprecipitación de cromatina nativa modificado protocolo experimental (ChIP-seq) compatible con una mezcla Gaussian distribución basada metodología de análisis (densidad de nucleosoma ChIP-seq; ndChIP-seq) que permite la generación de la secuencia Mediciones combinadas de accesibilidad nucleasa micrococcal (MNase) con la modificación de las histonas genoma. Posición de nucleosoma y densidad local y la modificación postraduccional de sus subunidades de las histonas, actúan en concierto para regular Estados de transcripción local. Medidas combinatorias de accesibilidad del nucleosoma con la modificación de las histonas generada por seq ndChIP permite la interrogación simultánea de estas características. La metodología ndChIP-seq es aplicable a una pequeña cantidad de células primarias inaccesibles para cross-linking basada en protocolos de ChIP-seq. Tomados en conjunto, ndChIP-seq permite la medida de modificación de las histonas en combinación con densidad de nucleosoma local para obtener nuevos conocimientos sobre los mecanismos comunes que regulan la transcripción del RNA dentro de poblaciones celulares primaria rara.

Presentamos una inmunoprecipitación de cromatina nativa modificada secuencia (ChIP-seq) metodología para la generación de la secuencia de bases de datos adecuadas para un marco analítico de nucleosoma densidad ChIP-seq, integración de la accesibilidad de la nucleasa micrococcal (MNase) con medidas de modificación de las histonas.

Generación de inmunoprecipitación de la cromatina nativa secuenciación bibliotecas para el análisis de densidad de nucleosoma

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

El objetivo general de este procedimiento es generar bibliotecas de inmunoprecipitación de cromatina nativa para el análisis de secuenciación de densidad de nucleosomas. Este método puede responder preguntas en epigenética, como revelar características epigenómicas en una población celular a nivel individual de nucleosomas y resolver firmas de cromatina heterogéneas en sus elementos continuos. La ventaja principal de esta técnica es aprovechar la propiedad de la MNasa de acceso preferencial a las regiones de cromatina abierta para generar una medición que combine la accesibilidad de la MNasa con la modificación de histonas.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque no podrán obtener una digestión óptima con MNasa. Comience este protocolo con la preparación de las células tal como se describe en el protocolo escrito. En el día uno, descongele cada pellet celular en un baño de agua a 37 grados Celsius durante 10 segundos.Luego, transfiera las células a hielo. A cada pellet celular, agregue inmediatamente un tampón de lisis frío al hielo al 1X más PIC al 1X hasta una concentración final de 10.000 células por 20 microlitros. Mezcle 10 veces pipeteando hacia arriba y hacia abajo sin crear burbujas.Trabajando en hielo, alícuota 20 microlitros por pocillo de los lisados resultantes en una placa de 96 pocillos. Cubra la placa con el sello de plástico antes de incubar en hielo durante 20 minutos. Etiquete la placa como MNase y registre los pocillos en una clave de plantilla.Poco antes de que finalice la lisis de 20 minutos, diluya la enzima MNasa uno con el tampón de dilución de MNasa uno hasta una concentración final de 20 unidades por microlitro y manténgala en hielo. Trabajando en hielo, prepare la mezcla maestra de digestión de MNasa uno según se describe en el protocolo escrito. A continuación, alícuote 20 microlitros de la mezcla maestra por cada fila de muestras, más cinco microlitros de volumen adicional en una placa de depósito de 96 pocillos.Una vez finalizada la incubación de los lisados, retire la placa de digestión con MNasa del hielo. Utilizando una pipeta multicanal, agregue 20 microlitros de la mezcla maestra de digestión con MNasa a cada fila de muestras y mezcle pipeteando arriba y abajo 10 veces. Cambie las puntas entre cada fila.A continuación, incube la placa a temperatura ambiente durante exactamente cinco minutos. Para detener la reacción después de cinco minutos, utilice una pipeta multicanal para añadir seis microlitros de EDTA 250 micromolar a cada fila de muestras y mezcle de arriba abajo varias veces. Asegúrese de cambiar las puntas entre filas.Después de la adición de EDTA, cambie la configuración de la pipeta a 20 microlitros y mezcle 10 veces como antes para asegurar la detención completa de la reacción de digestión. Finalmente, agregue seis microlitros de tampón de lisis 10X a cada fila de las muestras digeridas con MNasa y mezcle bien pipeteando arriba y abajo 10 veces. Cubra la placa con un sello de plástico e incube en hielo durante 15 minutos.Prepare la placa del complejo de anticuerpo con perlas y la placa de pre-limpieza según se describe en el protocolo escrito. Centrifugue rápidamente ambas placas durante 10 segundos a 200 veces G. A continuación, coloque la placa del complejo de anticuerpo con perlas sobre un imán de placa y espere 15 segundos hasta que la solución se vuelva transparente. Retire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta y deséchelo, sin perturbar las perlas.A continuación, retire la placa del imán para placas y déjela sobre hielo. Coloque la placa de reacción de pre-limpieza sobre un imán para placas y espere 15 segundos para que las perlas se separen y la solución se vuelva transparente. Sin perturbar las perlas, use una pipeta para transferir cuidadosamente el sobrenadante a los pozos correspondientes de la placa de complejo de perlas con anticuerpo mantenida sobre hielo.Mezcle suavemente cada pocillo pipeteando hacia arriba y hacia abajo 15 veces. Selle el pocillo con una cubierta de aluminio para placas e incube durante la noche a cuatro grados Celsius en una plataforma rotatoria. Tras la incubación, vuelva a etiquetar la placa como Reacción de IP.El segundo día, ajuste el mezclador de calentamiento a 65 grados Celsius y luego prepare un tampón de lavado con bajo contenido de sal y un tampón de lavado con alto contenido de sal sobre hielo. Centrifugue brevemente la placa de reacción de inmunoprecipitación durante 10 segundos a 200 veces G. Coloque la placa de reacción de inmunoprecipitación sobre un imán para placas y espere 15 segundos hasta que la solución se vuelva transparente. Utilizando una pipeta multicanal, sin perturbar los microperlas, retire y deseche cuidadosamente el sobrenadante.Saque la placa del imán para placas y colóquela en hielo. A cada fila de muestras en la placa de reacción de IP, agregue 150 microlitros de tampón de lavado con bajo contenido salino enfriado con hielo y mezcle lentamente hacia arriba y hacia abajo 10 veces para resuspender completamente las perlas. Vuelva a colocar la placa de reacción de IP sobre el imán para placas y elimine el sobrenadante como antes.Luego, coloque la placa nuevamente sobre hielo y repita los pasos de lavado para un total de dos lavados. Trabajando sobre hielo, agregue 150 microlitros del tampón de lavado de alto contenido salino a cada fila de muestras en la placa de reacción de inmunoprecipitación. Mezcle lentamente las muestras pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces para resuspender completamente las perlas.Después de eliminar el sobrenadante como antes, coloque la placa de reacción de IP en hielo y enfríe previamente una nueva placa de 96 pocillos al lado. A cada fila de muestras en la placa de reacción de IP, añada 150 microlitros del tampón de lavado con alta salinidad y mezcle lentamente 10 veces pipeteando hacia arriba y hacia abajo para resuspender completamente las perlas. Tras la resuspensión, transfiera cada fila de muestras a la fila correspondiente de la nueva placa de 96 pocillos previamente enfriada.Deseche la placa antigua. Coloque la nueva placa de reacción de IP sobre el imán para placas y deseche el sobrenadante como antes. Mantenga la placa a temperatura ambiente.A cada fila de muestras en la placa de reacción de IP, agregue 30 microlitros del tampón de elución de ChIP y mezcle lentamente pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces. Tenga cuidado de evitar la formación de burbujas. Selle la placa con una cubierta para PCR e incúbela en un mezclador térmico a 65 grados Celsius durante 1 1/2 horas con una velocidad de agitación de 1.350 RPM.Después de una incubación de 1 hora y media, centrifugar la placa de reacción de inmunoprecipitación a 200 × g durante un minuto a cuatro grados Celsius. A continuación, colocar la placa de reacción de inmunoprecipitación en un imán para placas y esperar a que la solución se aclare. Utilizando una pipeta multicanal, sin perturbar las perlas, transferir cuidadosamente 20 microlitros del sobrenadante a una nueva placa de 96 pocillos, utilizando puntas nuevas para cada fila.Etiquete la placa como Reacción IP y manténgala a temperatura ambiente. Continúe con la digestión de proteínas seguida de la construcción de la biblioteca, tal como se describe en el protocolo escrito. Aquí se muestran resultados representativos de cromatina digerida con MNasa óptima, subdigerida y sobredigerida antes de la generación de la biblioteca.El perfil óptimamente digerido está dominado por tamaños de fragmentos de nucleosomas individuales, sin estar sobre-digerido, para permitir la recuperación de fragmentos de nucleosomas de orden superior. La digestión subóptima de la cromatina también será evidente en el perfil de la biblioteca de secuenciación generada a partir del material de IP. Para validar las bibliotecas mediante qPCR, se evaluó el enriquecimiento relativo de las bibliotecas de IP con respecto a la biblioteca de entrada para dianas positivas y negativas.Además, la inspección de las lecturas alineadas de bibliotecas con un alto enriquecimiento por plegado evaluado mediante qPCR en un navegador genómico debe revelar enriquecimientos visualmente detectables en comparación con la biblioteca de entrada. Las bibliotecas exitosas de secuenciación ChIP para densidad de nucleosomas contendrán réplicas altamente correlacionadas con una porción significativa de lecturas alineadas dentro de los picos enriquecidos identificados por MACS2. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en dos días si se lleva a cabo adecuadamente.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar bibliotecas de inmunoprecipitación de cromatina nativa seguida de secuenciación para el análisis de la densidad de nucleosomas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar asegurarse de que la cromatina esté digerida de manera óptima y utilizar únicamente anticuerpos que muestren una alta afinidad con el epítopo de interés y que presenten poca o ninguna reactividad cruzada con otros epítopos. Tras seguir este procedimiento, se puede realizar un modelado computacional de la accesibilidad de MNasa para responder preguntas como las firmas epigenéticas debidas a la heterogeneidad dentro de una población celular.Este método proporciona información sobre el efecto combinatorio de la posición del nucleosoma y la densidad local, así como sobre la modificación postraduccional de sus subunidades histónicas, y puede aplicarse a cualquier sistema, como humanos o ratones, células primarias y tejidos congelados.

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Genética

En este video, demostramos la técnica de inmunoprecipitación de cromatina para identificar sitios de unión a proteínas en regiones específicas del ADN genómico de células precursoras de oligodendrocitos a través de la inmunoprecipitación selectiva de fragmentos de cromatina unidos a proteínas. Este método ayuda a estudiar la interacción de varias proteínas reguladoras, incluidos los factores de transcripción implicados en la regulación génica.

Inmunoprecipitación de cromatina para identificar sitios de unión a proteínas diana en el ADN genómico

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Generación de Plantilla ADN Immunoprecipitation cromatina alta calidad para la secuenciación de alto rendimiento (chip-ss)

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Generación de inmunoprecipitación de la cromatina nativa secuenciación bibliotecas para el análisis de densidad de nucleosoma

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