Inyección de nanopartículas de Retroductal a la glándula submaxilar de ratón

El objetivo general de este procedimiento es administrar nanomateriales directamente a la glándula submandibular murina. La principal ventaja de esta técnica es que logra la entrega directa de compuestos a la glándula submandibular sin pasar por la circulación sistémica. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de la disfunción de las glándulas salivales después de la radioterapia para las neoplasias malignas de cabeza y cuello.

Por lo general, los individuos nuevos en este método pueden verse desafiados al localizar y canular el conducto submandibular mientras el animal está sedado. Para comenzar este procedimiento, corte tres centímetros de un tubo de catéter intracraneal de calibre 32 con alambre insertado para formar un extremo biselado aproximadamente 45 grados con respecto al eje largo. Confirme que el cable sea al menos un centímetro más largo que el tubo.

La creación de un borde biselado en el tubo facilitará la canulación ductal. Si el tubo se dobla durante el procedimiento, se debe cortar un borde biselado nuevo. A continuación, cargue 50 microlitros de solución de nanopartículas de PSMA u otro material de inyección en una jeringa Hamilton.

Para reducir la probabilidad de traumatismo por excavación durante la inyección, conecte el tubo del catéter a la jeringa y expulse el volumen muerto. Inspeccione la solución de inyección para asegurarse de que la nanopartícula esté completamente solvatada para evitar la obstrucción ductal. A continuación, prepare la solución de atropina a 0,1 miligramos por mililitro.

Para visualizar el punto de entrada ductal, coloque un ratón anestesiado en posición prona en una platina personalizada. Luego aplique ungüento en los ojos para evitar la sequedad durante el procedimiento. Después, asegure los incisivos maxilares sobre una viga de metal y use una banda elástica para aplicar tensión hacia abajo detrás de los incisivos mandibulares.

Alinee el ratón debajo del microscopio de disección para visualizar la base de la mandíbula. Para ensanchar la boca, use un retractor de acero curvo personalizado para aplicar tensión a la mucosa bucal bilateralmente. Para visualizar la papila submandibular, agarre y levante suavemente la lengua del suelo de la boca con pinzas romas.

Coloque un trozo de algodón entre la lengua y la mucosa bucal para permitir una mayor manipulación dentro de la cavidad bucal. Para realizar la canulación ductal y la colocación de la vía, sujete el tubo del catéter con una inserción de alambre. Para un control manual óptimo durante la canulación, alinee el tubo con la curvatura de las pinzas.

Con el microscopio de disección, mueva las pinzas y el alambre hacia el campo de visión. Con el inserto de alambre, aplique suavemente presión en la base de una papila submandibular para producir una pequeña punción mucosa superficial que facilitará la entrada posterior del tubo del catéter. Si encuentra resistencia, corte las puntas biseladas frescas tanto en el tubo como en la inserción del alambre con unas tijeras de disección afiladas.

Después de la entrada, retire el estilete y, a continuación, con el microscopio de disección, confirme la presencia de saliva en el lugar de la punción. Posteriormente, retraiga el estilete más adentro del tubo. Evite movimientos forzados o bruscos del estilete que puedan causar sangrado o comprometer la integridad ductal.

Para asegurarse de que el tubo de inyección encajará en la abertura del conducto de Wharton, inserte el tubo que contiene el estilete como una guía rígida en la perforación realizada anteriormente. Para evitar que la contrapresión se prolongue hasta la obstrucción ductal, retire el tubo. Bajo el microscopio, asegúrese de que se pueda ver una abertura en la papila submandibular.

Si se produce un sangrado visible, retire el estilete y vuelva a intentar los procedimientos en la papila submandibular opuesta. A continuación, sin mover el ratón, administre un miligramo por kilogramo de solución de atropina por vía intraperitoneal para reducir la elevación durante el procedimiento. Luego, espere de cinco a 10 minutos.

Bajo el microscopio de disección, inserte el tubo de la jeringa en el orificio. Si encuentra resistencia, corte un extremo biselado nuevo en el tubo y vuelva a intentarlo. Una vez que el tubo esté en su lugar dentro de la papila submandibular, avance lentamente de tres a cinco milímetros dentro del conducto.

Luego, suelte el tubo de las pinzas. Para mejorar el sellado entre el tubo y la papila submandibular, seque la interfaz secando suavemente con una gasa durante un minuto. Inspeccione para confirmar que la posición del tubo no haya cambiado durante el secado.

En este procedimiento, inyecte el material a una velocidad de 10 microlitros por minuto. Asegúrese de que el ratón permanezca sedado y no muestre signos de angustia. Después de la inyección, mantenga la presión de la jeringa durante cinco minutos para mejorar la retención del material dentro del conducto de Wharton y la glándula submandibular.

Inspeccione la papila submandibular periódicamente para asegurarse de que el tubo no salga del orificio ductal. El mantenimiento de la presión de inyección mejorará la eficacia de la administración retroductal. Con pinzas finas, agarre y retire suavemente el tubo de la papila submandibular.

Retire el retractor y el algodón de la cavidad bucal antes de alejar el ratón de la plataforma. Para verificar la administración de nanopartículas, el sistema de imágenes in vivo muestra la lateralización de la señal fluorescente roja al lado tratado del ratón una hora después de la inyección. Y esta imagen muestra que la señal de la nanopartícula ha disminuido significativamente 24 horas después de la inyección.

Para confirmar la persistencia de las nanopartículas en las glándulas submandibulares 24 horas después de la inyección, se seccionaron y se observaron mediante imágenes fluorescentes. Aquí se muestran las glándulas submandibulares de control no inyectadas teñidas para acuaporina 5 y queritina cinco, marcando las células secretoras de acinos y ductales, respectivamente. En las glándulas submandibulares inyectadas con nanopartículas retroductales, las tinciones de acuaporina cinco y queritina cinco muestran una morfología normal de la glándula y nanopartículas absorbidas tanto en acinos como en conductos.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 20 minutos si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe evitar cualquier movimiento extraño que pueda desalojar la cánula o alterar el sello hecho entre el tubo y la papila submandibular. Después del procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la inmunotinción, la extracción de ARN o la citometría de flujo para evaluar la expresión génica o la localización de nanomateriales en la glándula submandibular.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores de glándulas salivales seleccionaran y probaran compuestos para la prevención de la xerostomía. Después de ver este vídeo, debería tener una buena comprensión de cómo administrar nanomateriales directamente a la glándula submandibular murina mediante la canulación del conducto de Wharton.