Name: Inyección de nanopartículas de Retroductal a la glándula submaxilar de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-03T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Aprende a inyectar nanopartículas poliméricas por vía retraductal en la glándula submaxilar de ratón. Este método permite la administración directa de compuestos terapéuticos, evitando la circulación sistémica y minimizando efectos secundarios.

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Investigación en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de odontología y el Instituto Nacional de cáncer (NCI) de los institutos nacionales de salud Premio número R56 DE025098, DE027695 UG3 y F30 CA206296 Craniofacial Research (NIDCR). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud. Este trabajo también fue apoyado por la NSF DMR 1206219 y la innovación de la IADR en Premio de Cuidado Oral (2016).
Nos gustaría agradecer a Jayne Gavrity por su ayuda en la realización de experimentos IVIS. Nos gustaría agradecer a Karen Bentley por su entrada y asistencia en la realización de EM. Nos gustaría agradecer su ayuda con IHC Weng Pei-Lun. Nos gustaría agradecer a Matthew Ingalls por su ayuda en la preparación de la figura. Nos gustaría agradecer al Dr. Elaine Smolock y Emily Wu lectura crítica de este manuscrito.

Todo en vivo los procedimientos descritos a continuación fueron aprobados por el Comité de la Universidad sobre los recursos de la Universidad de Rochester, Rochester, NY.
1. preparación
<ol><li>Con tubo de 32G catéter intracraneal con inserción de alambre, corte 3 cm del tubo para formar un extremo biselado, aproximadamente 45° al eje longitudinal. Confirman que el cable es más largo que el tubo de al menos 1 cm.</li>
	<li>Coloque 50 μl de solución de nanopartículas PSMA (figura 1), u otro material de inyección, en una jeringa Hamilton. Para reducir la probabilidad de barotrauma durante la inyección, acople el tubo del catéter, con el mandril quitado, a la jeringa y expulse el volumen muerto.</li>
	<li>Revise la solución de la inyección para asegurarse de que la nanopartícula es completamente solvatados para prevenir obstrucción ductal después de la administración.</li>
	<li>Preparar solución de atropina 0,1 mg/ml. Nota: Debido a atropina es sensible a la luz y se degrada con el tiempo, esta solución debe ser hecha el día de la inyección y protegida de la luz hasta que administra.</li>
</ol>2. acceder y visualizar el punto de entrada Ductal
<ol><li>Pesar ratones C57/BL6 utilizando una balanza analítica.</li>
	<li>Utilizando una jeringa de 0.5 mL con aguja 29 x ½", anestesiar ratones con una solución salina estéril inyectada por vía intraperitoneal de 100 mg/kg ketamina y 10 mg/kg xilacina. Proceder al paso siguiente cuando el ratón deja de responder a estímulos, que ocurre generalmente dentro de 5 a 10 minutos después de la inyección. Nota: Este procedimiento también puede realizarse con isoflurano, pero requerirá de un cono de nariz personalizado que permita el acceso a la cavidad oral.</li>
	<li>Para evitar la sequedad durante el procedimiento, aplique lubricante a los ojos y colocar el ratón en una posición prona en un escenario personalizado. Nota: Para mantener las condiciones apropiadas para el procedimiento intraoral, herramientas deben desinfectarse o esterilizarse antes de cada uso.</li>
	<li>Asegurar los incisivos sobre una viga de metal para abrir la cavidad bucal y usar una banda elástica para aplicar tensión hacia abajo detrás de los incisivos mandibulares (figura 2A).</li>
	<li>Alinear el ratón bajo el microscopio de disección que se visualiza la base de la mandíbula.</li>
	<li>Para ensanchar la boca, usar un retractor de acero personalizado, curvado para aplicar tensión bilateralmente en la mucosa bucal.</li>
	<li>Para visualizar las papilas submaxilares, sujete y levante suavemente la lengüeta del piso de la boca usando fórceps romos. Nota: Las papilas aparecerán como dos protuberancias pálidas debajo de la lengua (figura 2B).</li>
	<li>Para facilitar la visualización y manipulación más dentro de la cavidad oral, coloque el algodón entre la lengua y la mucosa bucal.</li>
</ol>3. ductal canulación y la colocación de la línea
<ol><li>Con fina, pinzas curvas, agarre tubo del catéter con la inserción de alambre. Para el óptimo control manual durante la canulación, alinee el tubo con la curvatura de las pinzas (Figura 3A).</li>
	<li>Usando el microscopio de disección, mover las pinzas y el alambre en el campo de visión. Nota: El cable debe que sobresale del tubo.</li>
	<li>Suavemente aplique presión en la base de una papila submaxilar utilizando el cable incluido para producir un pinchazo pequeño, superficial, mucosa (0,076 mm de diámetro) que facilitará la posterior entrada de los tubos del catéter (0,25 mm de diámetro). Si se encuentra resistencia, corte frescos puntas biseladas en la tubería y la inserción de alambre con unas tijeras de disección agudas.</li>
	<li>Después de la entrada, retirar el estilete y, usando el microscopio de disección, confirmar la presencia de saliva en el sitio de punción. Evitar movimientos fuertes o bruscos (retirada o inserción) el estilete que puede causar sangrado o comprometer integridad ductal.</li>
	<li>Retire el estilete dentro de la tubería (figura 3B).</li>
	<li>Para asegurar que la tubería de inyección se ajusta a la abertura del conducto de Wharton, inserte el tubo que contiene el estilete rígido guía en la punción anterior (figura 2 C). Nota: Si no se realiza rápidamente, hinchazón local puede impedir la reinserción.</li>
	<li>Para evitar la presión por obstrucción ductal prolongada, retirar el tubo. Inspeccione para verificar que una apertura, visible bajo microscopía, puede verse en la papila submaxilar. Si se presenta sangrado visible, retire el estilete y vuelva a intentar desde el paso 3.2 en las papilas submaxilares opuestas.</li>
	<li>Sin mover el ratón, administrar una inyección intraperitoneal de solución de atropina de 1 mg/kg, para reducir la salivación durante el procedimiento. Espere 5-10 minutos.</li>
	<li>Sostenga el extremo del tubo de la jeringa e inserte en el orificio usando el microscopio de disección (figura 3). Si se encuentra resistencia, corte un extremo biselado fresco a la tubería y el reintento.</li>
	<li>Una vez que la tubería esté en su lugar dentro de la papila submaxilar, avanzar lentamente 3-5 mm en el conducto. Suelte el tubo de las pinzas.</li>
	<li>Para mejorar el sello entre la tubería y la papila submaxilar, seque la interfaz frotando suavemente con una gasa durante 1 minuto.</li>
	<li>Revise para confirmar que la posición de la tubería no ha cambiado durante el secado.</li>
</ol>4. inyección
<ol><li>Inyectar el material a una velocidad de 10 μl/min Revise para confirmar que el ratón permanece sedado y no muestra señales de incomodidad (Figura 2D). Nota: Las inyecciones de 15-50 μl son bien toleradas. La inyección de volúmenes grandes puede causar barotrauma.</li>
	<li>Después de la inyección, mantener la presión de la jeringa por 5 min mejorar la retención del material dentro del conducto de Wharton y SMG (figura 4). Inspeccione la papila submaxilar periódicamente para asegurar que la tubería no sale el orificio ductal.</li>
	<li>Con unas pinzas finas, sujete y retire suavemente el tubo de las papilas submaxilares. Nota: Es normal observar algunas salida flúida de las papilas.</li>
	<li>Retire el separador y algodón de la cavidad oral antes de mover el ratón de la etapa. Nota: El animal no se debe dejar desatendido hasta que ha recuperado la conciencia suficiente para mantener el recumbency esternal. Además, aseguran que el ratón no se encuentra con otros ratones hasta que se recuperó completamente.</li>
</ol>5. verificación y análisis
Nota: Una en vivo sistema de proyección de imagen (IVIS) puede utilizarse para evaluar la retención de las nanopartículas fluorescencia marcadas después de la inyección (como se muestra 1 h y 24 h después de la inyección en la figura 5).
<ol><li>Para visualizar mejor la señal fluorescente dentro de SMG, a través de la piel, quitar la piel ventral que cubría las metralletas por afeitarse o usar un depilatorio químico. Nota: Después de eutanasia, SMG tejido también puede recolectarse, fijo (noche en paraformaldehído al 4%) y teñido usando immunohistochemistry para confirmar la persistencia de fluorescencia etiquetada NP un día después de la inyección (figura 6).</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Retroductal inyección es crítica para la entrega de la droga localizada en la glándula salival. Esta técnica tiene aplicaciones en la detección de agentes terapéuticos para las condiciones incluyendo el síndrome de Sjögren y RIH9,10,28. Directa del fármaco en el SMG vía la inyección de retroductal ofrece una ventaja clave sobre la administración sistémica en su potencial para reducir los efectos off-target, incluyendo activación...

Disfunción de las glándulas salivales tiene muchas etiologías, incluyendo el síndrome de Sjögren, una pérdida mediada autoinmune del tejido secretor funcional e hiposalivación inducida por la radiación (ROG), una secuela común de cabeza y cuello cáncer radioterapia1. Pérdida de la función salival debido a cualquier condición predispone a los individuos a oral y sistémica de la infección, caries dental, disfunción digestiva y deglución, debilitación de discurso y depresión mayor1,2,3. Como resultado, calidad de vida sufre significativamente, con las intervenciones que se limita a la paliación de los síntomas más que curar4. Para investigar nuevas terapias en vivo, es de interés para administrar compuestos bioactivos directamente a la glándula salival.
Retroductal inyectable es un método valioso para entregar compuestos bioactivos directamente a las glándulas salivales y comprobar la eficacia en la enfermedad, lesión, o en la homeostasis del tejido normal. Las tres glándulas salivales mayores son la parótida (PG), el submaxilar (SMG) y sublingual (SLG), todos de que está vacía en la cavidad bucal a través de conductos excretores. La anatomía de la murine SMG permite acceso directo a través de la canulación del conducto de Wharton, ubicada en el piso de la boca bajo la lengua5. Tras la canulación, fármacos solvatados pueden administrarse directamente en el SMG. Después del parto de retroductal, difusión extra glandular está limitada por la cápsula de tejido circundante que regula el intercambio de material con el que rodea las estructuras6. El SMG y su conducto están estructurados de manera similar en los seres humanos y habitualmente se acceden durante el SMG cirugía y sialoendoscopy7. En humanos y ratones, la PG es además accesible a través del conducto de Stensen en la mucosa bucal8.
En modelos murinos de RIH, inyección de retroductal SMG se ha utilizado para ofrecer terapéutica incluyendo factores de crecimiento, células primarias, vectores adenoviral, citoquinas y compuestos antioxidantes modulan la respuesta celular a la lesión, y reducir el tejido daño5,9,10,11,12,13,14,15,16. El más notable éxito clínico de retroductal inyectable es la administración de un vector adenoviral para dirigir la expresión de un canal de agua (Acuaporina 1; AQP1) en pacientes después de la radiación para cáncer de cabeza y cuello17.
Previamente, hemos desarrollado y demostrado la eficacia de un sistema de nanopartículas poliméricas-siRNA retroductally inyectada para proteger la función de la glándula salival de RIH11,18,19,20. Como una extensión de nuestro trabajo en el pasado, aquí, demostramos nuestro protocolo para la inyección de SMG de retroductal usando una nanopartícula fluorescente etiquetada (NP) capaz de cargar y entregar de lo contrario poco solubles drogas21,22, 23.
Se ha sintetizado lo NP de un copolímero del diblock compuesto de poli (estireno-alt-maleico anhydride)-b-poly(styrene) (PSMA) a través de la adición reversible cadena fragmentación (balsa) polimerización, tal como se describe anteriormente21. A través del intercambio de solvente, estos polímeros montan espontáneamente uno en estructuras de micelas NP con una hidrofóbica interior e hidrofílico exterior21. El NPs están marcado con rojo Texas fluoróforo para permitir la verificación de la entrega de la NP en las glándulas sin sacrificar el animal. Imágenes de animales en vivo y immunohistochemistry SMG se muestra en 1 h y 1 día después de la inyección.
Este actualizado y protocolo reproducible de la canalización debe permitir que otras personas lograr la inyección de retroductal. Esperamos que esta refinada técnica será fundamental para en vivo estudios y desarrollo terapéutico24,25.

<table><tbody><tr><td>Clorhidrato de pilocarpina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6503</td><td>Pilocarpina</td></tr><tr><td>Student Vannas Tijeras de resorte</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-9</td><td>Tijeras de resorte para traqueostomía</td></tr><tr><td>Solución salina estéril</td><td>Medline</td><td></td><td>RDI30296H solución salina</td></tr><tr><td>Dumont #7 Pinzas Fine</td><td>Science Tools</td><td>11274-20</td><td>Pinzas curvas Pinzas</td></tr><tr><td>Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>Pinzas</td></tr> rectas <tr><td>Pinzas de patrón estándar</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td>Pinzas romas</td></tr><tr><td>Tijeras finas- carburo de tungsteno</td><td>Fine Science Tools</td><td>14568-09</td><td>Tijeras de disección</td></tr><tr><td>Microhematocrito Tubos capilares heparinizados</td><td>Fisher Scientific</td><td>22362566</td><td>Tubos capilares</td></tr><tr><td>Ungüento</td> <td>lubricante para los ojosRefresh</td><td>N/A</td><td>Refresh Lacri-Lube</td></tr><tr><td>Goat polyclonal anti-Nkcc1</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>SC-21545</td><td>Nkcc1 Anticuerpo</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroclorhidrato)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>GraphPad Prisma</td><td>GraphPad</td><td>ver6.0</td><td>Software estadístico</td></tr><tr><td>Aplicador con punta de algodón</td><td>Medline</td><td>MDS202000</td><td>Aplicador para ungüento ocular</td></tr><tr><td>0.5cc Jeringa de insulina, 29G x 1/2"</td><td>BD</td><td>7629</td><td>Jeringa para inyección intraperitoneal</td></tr></tbody></table>

inyección de nanopartículas de retroductal a la glándula submaxilar de ratón

Retroductal Nanoparticle Injection to the Murine Submandibular Gland

Dos objetivos comunes de la terapéutica de la glándula salival son prevención y cura de la disfunción del tejido siguiendo ya sea autoinmune o lesión por radiación. Por entregar localmente compuestos bioactivos a las glándulas salivales, mayores concentraciones de tejido pueden lograrse con seguridad frente a la administración sistémica. Además, de tejido de la blanco los efectos de la acumulación extra glandular de material pueden dramáticamente reducidos. En este sentido, retroductal la inyección es un método ampliamente utilizado para la investigación de la glándula salival biología y Fisiopatología. Retroductal administración de factores de crecimiento, células primarias, vectores adenoviral y fármacos de molécula pequeña se ha demostrado para apoyar la función de la glándula en el entorno de la lesión. Previamente hemos demostrado la eficacia de una estrategia de nanopartículas-siRNA de retroductally inyectado para mantener la función de la glándula después de la irradiación. Aquí se detalla un método altamente eficaz y reproducible para administrar nanomateriales a la glándula submaxilar murina a través del conducto de Wharton (figura 1). Describir el acceso a la cavidad bucal y delinear los pasos necesarios al conducto de Wharton cannulate, con más observaciones que sirven como controles de calidad durante todo el procedimiento.

Inyección de Retroductal puede utilizarse para administrar NPs a SMG murino (figura 1). Aquí entregamos 50 μg PSMA NPs marcado con rojo Texas fluoróforo.
La colocación correcta del mouse permite de fácil acceso y visualización del piso de la boca (figura 2A-B). Las papilas submaxilares son identificadas como dos protuberancias carnosas debajo de la leng...

Entrega local de la droga a las glándulas submaxilares es de interés en biología de la glándula salival de entendimiento y para el desarrollo de nuevas terapias. Presentamos un protocolo de inyección de retroductal actualizada y detallada, diseñado para mejorar entrega exactitud y reproducibilidad experimental. La aplicación presentada en este documento es el de nanopartículas poliméricas.

Inyección de nanopartículas de Retroductal a la glándula submaxilar de ratón

Two common goals of salivary gland therapeutics are prevention and cure of tissue dysfunction following either autoimmune or radiation injury. By locally ...

El objetivo general de este procedimiento es administrar nanomateriales directamente a la glándula submandibular murina. La principal ventaja de esta técnica es que logra la entrega directa de compuestos a la glándula submandibular sin pasar por la circulación sistémica. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de la disfunción de las glándulas salivales después de la radioterapia para las neoplasias malignas de cabeza y cuello.Por lo general, los individuos nuevos en este método pueden verse desafiados al localizar y canular el conducto submandibular mientras el animal está sedado. Para comenzar este procedimiento, corte tres centímetros de un tubo de catéter intracraneal de calibre 32 con alambre insertado para formar un extremo biselado aproximadamente 45 grados con respecto al eje largo. Confirme que el cable sea al menos un centímetro más largo que el tubo.La creación de un borde biselado en el tubo facilitará la canulación ductal. Si el tubo se dobla durante el procedimiento, se debe cortar un borde biselado nuevo. A continuación, cargue 50 microlitros de solución de nanopartículas de PSMA u otro material de inyección en una jeringa Hamilton.Para re

retroductal-nanoparticle-injection-to-the-murine-submandibular-gland

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Un protocolo para la canalización de la glándula salival submaxilar del ratón a través de conductos de Wharton se describe. Para este experimento, la solución de azul tripán se usa como un tintorero para demostrar cómo esta técnica efectiva entrega infusiones en la glándula blanco, y sugerir la fiabilidad de este nuevo enfoque como un potencial clínico de drogas / terapia celular para la regeneración de las glándulas salivales.

Canulación de la glándula salival submaxilar del ratón a través del conducto de Wharton

Este vídeo describe una técnica de inyección intraductal en la que administramos mezcla inyectable en los conductos de las glándulas mamarias de ratón.

Inyección intraductal: administración de la mezcla inyectable en los conductos de la glándula mamaria del ratón

El video muestra una técnica de inyección guiada por ultrasonido para administrar medicamentos terapéuticos en las glándulas salivales de un paciente humano.

Una inyección guiada por ultrasonido de medicamentos terapéuticos en glándulas salivales humanas

Microscopía intravital es una poderosa herramienta que permite obtener imágenes diferentes procesos biológicos en los animales vivos. En este artículo, presentamos un método detallado para obtener imágenes de la dinámica de las estructuras subcelulares, tales como los gránulos de secreción, en las glándulas salivales de ratones vivos.

Microscopia intravital para formar imágenes de estructuras subcelulares en ratones vivos que expresan proteínas fluorescentes

Un protocolo para la entrega intraductal no invasiva de los reactivos acuosos para la glándula mamaria de ratón se describe. El método se aprovecha de la inyección localizada en los pezones de las glándulas mamarias dirigidos específicamente conductos mamarios. Esta técnica es adaptable para una variedad de compuestos que incluyen ARNsi, agentes quimioterapéuticos y moléculas pequeñas.

Inyección intraductal de entrega de la droga localizada a la glándula mamaria de ratón

Los ganglios linfáticos son los tejidos inmunológicos que orquestan la respuesta inmunitaria y son un objetivo crítico para las vacunas. Los biomateriales se han empleado para dirigirse mejor a los ganglios linfáticos y para controlar la administración de antígenos o adyuvantes. Este papel describe una técnica que combina estas ideas para inyectar partículas biocompatibles del polímero en nodos de linfa.

Inyección de ganglios intra-linfáticos de partículas de polímero biodegradables

La hipofunción de las glándulas salivales, un efecto adverso importante de la radioterapia de cabeza y cuello, disminuye la calidad de vida del paciente. La demostración de la eficacia de nuevas terapias en modelos animales es un requisito previo antes de la transición clínica. Este protocolo describe la administración retroductal y la irradiación local de las glándulas submandibulares de rata.

Retroductal submandibular Glándula instilación y con localización fraccionado irradiación en un modelo de rata de hipofunción salival

Se describe un protocolo para exponer quirúrgicamente y estabilizar la glándula salival submaxilar murina intravital imagen usando microscopia intravital vertical. Este protocolo es fácilmente adaptable a otras glándulas exocrinas de la cabeza y región del cuello de los ratones y otros roedores pequeños.

Preparación de glándula salival submaxilar murino para la microscopia Intravital vertical

Las glándulas salivales se han propuesto como un sitio objetivo tisular para la terapia génica, especialmente en el área de la vacunación por transferencia de genes. Demostramos la entrega de genes en un modelo de primates no humanos utilizando infusión de parótida retrógrada.

Infusión de la glándula parótida retrógrada a través del conducto de Stensen en un primate no humano para la entrega de genes vectores

En el presente protocolo, la función de barrera endotelial de la glándula submandibular (SMG) se evaluó inyectando diferentes trazadores fluorescentes ponderados molecularmente en las venas angulares de modelos animales de prueba in vivo bajo un microscopio de escaneo láser de dos fotones.

In vivo Detección de permeabilidad vascular en glándula submandibular de ratón

Las imágenes inmunofluorescentes están limitadas por la capacidad de observar procesos biológicos complejos y dependientes del tiempo en una sola instantánea en el tiempo. Este estudio describe un enfoque de imágenes en vivo realizado en cortes de glándula submandibular de ratón cortados con precisión. Este enfoque permite la observación en tiempo real de las interacciones célula-célula durante la homeostasis y los procesos de regeneración y reparación.

Interrogación de las interacciones célula-célula en la glándula salival a través de imágenes de células vivas ex vivo

Aprende a inyectar nanopartículas poliméricas por vía retraductal en la glándula submaxilar de ratón. Este método permite la administración directa de compuestos terapéuticos, evitando la circulación sistémica y minimizando efectos secundarios.

Inyección de nanopartículas de Retroductal a la glándula submaxilar de ratón

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