Recopilación y procesamiento de datos de cristalografía de neutrones para modelar átomos de hidrógeno en estructuras de proteínas

La cristalografía de neutrones es una técnica estructural para determinar las posiciones de los átomos de hidrógeno en macromoléculas biológicas. Las estructuras de neutrones revelan los estados de protonación y las orientaciones de las moléculas de agua para dilucidar los mecanismos de reacción y las interacciones de unión. A diferencia de la difracción de rayos X, la difracción de neutrones tiene la ventaja de ser una técnica no destructiva.

Las proteínas con grupos fotosensibles o metalosensores pueden estudiarse sin sufrir daños por radiación. Para realizar la cristalografía de proteínas de neutrones, se montan grandes y frágiles cristales de proteínas en capilares de cuarzo para la recopilación de datos a temperatura ambiente. El montaje capilar de cristales no se realiza de forma rutinaria, lo que hace que la demostración de esta técnica sea instructiva.

Para la recolección de cristales, abra la caja de sándwich sellada que contiene los cristales de proteínas en una placa de vidrio siliconado de gran volumen de nueve pocillos y use una micropipeta para transferir de 10 a 20 microlitros de la solución del depósito de cristalización a un portaobjetos de vidrio. Evalúe los cristales con un microscopio. Use un microbucle de tamaño adecuado para recolectar un cristal y colocar el cristal en la gota de la solución del depósito.

Para el montaje de cristales, tome un capilar de cuarzo de dos milímetros de diámetro y 50 milímetros de longitud, aspire el tampón del depósito con una pipeta y llene un extremo del capilar con el tampón del depósito. Utilice un lazo de montaje para colocar suavemente el cristal en el tampón del depósito dentro del capilar de cuarzo. Golpee el tubo para mover el tampón del depósito y el cristal por el capilar y use una pipeta larga y delgada para aspirar la solución alrededor del cristal.

Use una mecha de papel delgada para secar cuidadosamente el cristal y secar las paredes capilares y agregue de 20 a 50 microlitros de solución tampón deuterada al final del capilar. Use una varilla de calor para derretir una porción de cera de abejas e inserte suavemente el capilar en la cera de abejas derretida hasta que se forme un sello hermético. Reemplace el tampón deuterado con 20 a 50 microlitros de tampón deuterado fresco en los días dos, seis y 10 después del montaje del cristal y vuelva a sellar el capilar con cera de abeja fresca derretida después de cada intercambio de vapor como se demuestra.

Después de al menos dos semanas de intercambio de vapor, use masilla para asegurar el capilar de cuarzo en la varilla de muestra del goniómetro del difractómetro de neutrones IMAGINE que se ha asegurado a la etapa de muestra del instrumento y baje la muestra y la pala en el haz de neutrones y el área del detector. Abra el programa de adquisición de datos en la computadora de control Beamline y haga clic en la pestaña de configuración para configurar la estrategia de recopilación de datos e ingresar los parámetros del experimento, incluido el nombre del instrumento y el nombre de las imágenes que se recopilarán. Haga clic en la pestaña Recopilar e introduzca los parámetros de recopilación de datos, incluido el tiempo de exposición y el número de fotogramas que se recopilarán.

Dentro de la interfaz gráfica de usuario de óptica, haga clic en 2,78 para el mínimo lambda y 4,5 para el máximo lambda para establecer el cuasirango para la recopilación de datos. Haga clic en iniciar análisis para iniciar la recopilación de datos. Después de la recopilación de datos de neutrones, recopile un conjunto de datos de rayos X correspondiente en el mismo cristal a la misma temperatura.

Antes de la recolección de datos criogénicos, retire la solución del depósito de la caja sándwich y llene la caja sándwich con la solución tampón del depósito deuterada, deje equilibrar durante una semana y repita tres veces. Después de tres rondas más de intercambio de soluciones de depósito, recoja el cristal con un microbucle y sumerja el cristal en una solución crioprotectora durante dos horas antes de montar el cristal en un microbucle unido a una montura de cristal criogénico. Sumerja el cristal montado y el montaje criogénico en nitrógeno líquido.

Cuando el cristal está congelado, monte el cristal en la etapa de muestra del difractómetro de neutrones macromoleculares equipada con una corriente criogénica. Compruebe que el cristal está montado y centrado para la recopilación de datos, complete la información de la propuesta y haga clic en el icono de carpeta para cargar la tabla de estrategia de recopilación de datos y, a continuación, haga clic en enviar para iniciar la recopilación de datos. Los neutrones difractados se harán visibles en tiempo real a medida que sean detectados por los detectores de tiempo de vuelo MaNDi.

Para el refinamiento conjunto de datos de rayos X y neutrones, primero abra CCP4 y seleccione convertir para modificar el programa MTZ extendido para que coincida con los indicadores de datos libres de R de los datos de neutrones con los de los datos de rayos X. Importe el archivo de reflexión de datos de neutrones en formato MTZ. Seleccione importar datos R gratuitos de otro archivo MTZ e importe el archivo MTZ de rayos X.

Asigne un nombre al nuevo archivo MTZ coincidente y haga clic en ejecutar. A continuación, abra el paquete de software Phoenix y, en refinamiento, haga clic en listo para establecer. Cargue el archivo de coordenadas de la proteína, seleccione agregar hidrógenos al modelo si está ausente y seleccione HD en sitios intercambiables, H en otro lugar en el menú desplegable.

Seleccione agregar deuterio a las moléculas de solvente y haga clic en ejecutar para comenzar. Para refinar la estructura, en la pestaña de refinamiento, abra el fénix. Refinar el programa para configurar el refinamiento utilizando los datos de rayos X y neutrones.

En la pestaña configurar, introduzca el archivo PDB de la estructura de rayos X resuelta. Cargue el archivo MTZ a partir de los datos de neutrones. Asigne los datos del archivo MTZ como datos de neutrones en neutron R libre.

Cargue el archivo MTZ de los datos de rayos X y asígnelo como datos de rayos X y libre de rayos X. En Configuración de refinamiento, confirme que se ha seleccionado la estrategia de refinamiento estándar y aumente el número de ciclos a cinco. Seleccione todos los parámetros, avanzados, e hidrógenos.

Cambie el modelo de refinamiento de hidrógeno a individual y apague el ADP que conduce a la fuerza, luego busque nuclear. Seleccione usar las distancias nucleares de X-HD. Haga clic en ejecutar para iniciar el refinamiento.

Para la construcción de modelos en Phoenix, haga clic en abrir en Coot. En Coot, visualice la densidad de electrones de rayos X y los mapas de densidad de longitud de dispersión de neutrones. Seleccione el administrador de visualización y elimine el mapa de densidad de longitud de dispersión de neutrones 2FOFC de

Seleccione abrir MTZ y seleccione abrir MTZ y abra el archivo mtz de datos de neutrones. Para las opciones de amplitudes y fases, seleccione no_fill_neutron datos en los menús desplegables para abrir los mapas de densidad de longitud de dispersión de neutrones sin relleno. Realice una inspección visual de los residuos para determinar si el modelo se ajusta a los datos y analice los picos del mapa de densidad de diferencia de los sitios intercambiables de hidrógeno y deuterio para determinar la orientación y ocupación correctas.

Reoriente las moléculas de agua de acuerdo con los mapas de neutrones SLD y las interacciones de enlaces de hidrógeno. Ajuste el estado de protonación y la orientación de los sitios intercambiables de hidrógeno-deuterio del residuo proteico de acuerdo con los mapas SLD de neutrones. Realice más rondas de construcción y refinamiento de modelos interactivos para obtener una estructura completa.

Los cristales de proteínas hidrogenadas cultivados en tampón a base de agua miden aproximadamente 1.000 por 900 micras. Los cristales se pueden montar en capilares de cuarzo para el intercambio de vapor con tampón a base de óxido de deuterio durante tres semanas antes de la recopilación de datos de difracción de neutrones. Los datos de difracción de neutrones se recopilaron durante varios días con una resolución de 2,30 angstrom y se recopiló un conjunto de datos de difracción de rayos X en el mismo cristal.

Los picos en los mapas de densidad de longitud de dispersión de neutrones de FO menos FC proporcionan información valiosa sobre la orientación de residuos como la paragina y los picos positivos en los mapas de densidad de longitud de dispersión de neutrones de FO menos FC también son muy informativos para determinar los estados de protonación de los residuos con grupos titulables como la histidina. Las superposiciones de mapas de los mapas de densidad de longitud de dispersión de electrones y neutrones para moléculas de agua indican que, si bien las interacciones de los enlaces de hidrógeno se pueden inferir a partir de los datos de rayos X, los neutrones proporcionan información clara sobre las posiciones de estos enlaces de hidrógeno. Los mapas de omisión de densidad de longitud de dispersión de neutrones se pueden utilizar para determinar las orientaciones de los grupos funcionales de la cadena lateral de hidrógeno-deuterio.

Los mapas de densidad de longitud de dispersión de neutrones en los que los átomos de hidrógeno no intercambiables están unidos al carbono parecen incompletos en comparación con sus homólogos del mapa de densidad electrónica debido a la cancelación de densidad. Por lo tanto, es preferible realizar un refinamiento conjunto de una muestra con datos de rayos X y neutrones en el que los datos de rayos X se puedan utilizar para determinar la posición de la columna vertebral de la proteína. La cristalografía de proteínas neutrónicas requiere cristales grandes.

Se debe tener cuidado durante la manipulación y el montaje de los cristales para evitar dañar los cristales, que pueden agrietarse fácilmente y comprometer la calidad de los datos. La cristalografía de proteínas de neutrones proporciona información sobre el mecanismo de reacción de las proteínas, revelando potencialmente residuos catalíticamente relevantes o moléculas de agua cuyo papel puede ser investigado más a fondo por cinética, mutagénesis o espectroscopia.