Fabricación y etiquetado de microburbujas con trazadores fluorescentes y radiactivos

Las microburbujas son partículas susceptibles a los ultrasonidos llenas de gas con capacidades únicas de imagen y terapia contra el cáncer. Sus utilidades en evolución se pueden avanzar estratégicamente mediante la construcción de microburbujas rastreables impulsadas por aplicaciones. Nuestro objetivo es facilitar este objetivo mediante el desarrollo de un protocolo de fabricación de microburbujas lipídicas que permita la generación personalizable de microburbujas no marcadas, radiomarcadas, fluorescentes y multimodales.

Lograr un marcado de radio de microburbujas eficiente y estable es un desafío no trivial. Las microburbujas lipídicas son frágiles y, por lo tanto, someterlas a calor, tiempo y pasos de purificación en los enfoques de radioetiquetado posteriores a la fabricación puede perturbar sus propiedades físico-químicas y su estabilidad. Por otro lado, el radioetiquetado prefabricado requiere equipos especializados y una mayor exposición a la radiación.

Superamos estos desafíos desarrollando un nuevo protocolo híbrido en el que la quelación de radioisótopos ocurre antes de la activación de microburbujas, pero después de la formación de suspensión de lípidos. Este enfoque de un solo recipiente facilita por primera vez el etiquetado de radio de microburbujas de alta eficiencia y sin purificación que conserva las propiedades químicas físicas de las partículas. Una ventaja adicional clave es la versatilidad de los protocolos. Se puede incorporar durante la fabricación de microburbujas personalizadas y adaptarse a suspensiones de lípidos de microburbujas preformadas, como las disponibles comercialmente. Se puede aplicar con éxito en diversas composiciones de lípidos y quelantes de microburbujas y, en consecuencia, puede generar microburbujas radiactivas, fluorescentes o trimodales personalizadas.

Juntas, estas propiedades permiten el rastreo representativo multimodal de las cáscaras lipídicas de microburbujas que pueden avanzar en los conocimientos mecanicistas y respaldar el avance de las terapias de ultrasonido centradas en microburbujas en muchos dominios, incluido el estudio farmacocinético de microburbujas, las imágenes multimodales, la planificación del tratamiento y la habilitación de terapias sinérgicas.

[Narrador] Para comenzar a usar una micropipeta, agregue un mililitro de solución AA-PGG a lo largo de los bordes de la película lipídica de microburbujas de su elección en un vial, evitando la formación de burbujas. Cubra parcialmente la abertura del vial con la tapa, dejando suficiente espacio para insertar la línea de perfluoropentano o PFP. Haga fluir PFP en el espacio de cabeza del vial durante 20 segundos por encima del líquido y tape el vial. Sumerja la mitad inferior del vial en un baño de agua de 70 a 80 grados Celsius durante un minuto. Luego sonique el vial durante 30 segundos en baños de sonicador a 69 grados Celsius. Después de la sonicación, limpie el vial y déjelo enfriar a temperatura ambiente. Vuelva a llenar el espacio de cabeza del vial con gas PFP. Luego tape el vial y selle los bordes con Parafilm. Para configurar un baño de agua a 60 grados Celsius en un plato cristalizador, coloque una barra de agitación magnética en el plato y colóquela en un plato de agitación caliente con temperatura controlada. Inserte una sonda térmica en el agua para controlar la temperatura y ajustar la velocidad de agitación para crear un embudo débil pero visible. Con unas pinzas, transfiera un vial sellado que contenga cobre 64 en forma de cloruro cúprerico en ácido clorhídrico normal 0,1 a un calibrador de dosis. Registre la actividad del cobre 64 y el tiempo. Con unas pinzas, retire el vial del calibrador de dosis y colóquelo en un recipiente con plomo. Para calcular el valor en megabecquerelios por mililitro, divida la actividad anotada en el calibrador de dosis por el volumen de cobre 64. Destape la suspensión lipídica y asegúrela en un soporte para viales. Luego destape el vial de cobre 64, manipulando el vial con fórceps. Usando una micropipeta, transfiera un volumen de solución de cobre 64 correspondiente a 40 a 250 megabecquerelios de actividad a la suspensión lipídica. Con unas pinzas planas con punta de goma, gire la suspensión de lípidos radiactivos hacia arriba y hacia abajo al menos cinco veces para mezclar el cobre 64 con la suspensión. Mientras el vial está boca arriba, mueva suavemente la tapa mientras estabiliza el vial. Con cuidado, destape parcialmente el vial e inserte una línea PFP equipada con aguja. Llene el espacio de cabeza del vial con PFP durante 20 segundos. Luego tape y selle el vial con parafilm. Mida la actividad del vial con un calibrador de dosis y registre el tiempo. A continuación, coloque el vial en un soporte de espuma para que la mitad inferior del vial quede expuesta al calor. Sumerja el soporte en el baño de agua agitado a 60 grados centígrados y caliente durante una hora. Mientras tanto, para preparar las tiras iTLC, corte el papel de cromatografía de microfibra de vidrio en tiras. Caliente las tiras en un horno de secado de vidrio a 80 grados centígrados para activar. Después de una hora, retire el vial del baño de agua y limpie sus bordes con papel de seda. Gire el vial hacia arriba y hacia abajo con pinzas con punta de goma. Mientras el vial está en posición vertical, mueva la tapa mientras estabiliza el vial. Retire el parafilm y limpie alrededor de la tapa para eliminar el agua atrapada. Detecte uno o dos microlitros de la suspensión lipídica a un centímetro del centro inferior de una tira iTLC activada. Deja que la mancha se seque. Con una micropipeta, agregue 200 microlitros de eluyente iTLC en el fondo de un tubo de ensayo de 10 mililitros. Guarde el tubo en un recipiente de plomo. Agregue la tira de iTLC manchada al tubo y deje que se desarrolle hasta que el eluyente alcance aproximadamente un centímetro de la parte superior de la tira. A continuación, con unas pinzas, retire la tira revelada y sosténgala verticalmente. Corte la tira en tercios sobre tubos de plástico de cinco mililitros compatibles con el contador gamma. Inserte tapas de presión en los tubos. Mida la tira que contiene los tubos y un tubo de control vacío utilizando un contador gamma para detectar la actividad del cobre 64. Registre los recuentos por minuto y reste la actividad del tubo de control de las otras lecturas para corregir la radiación de fondo. A continuación, calcule la pureza radioquímica en función de los recuentos corregidos por minuto. A continuación, destape el vial de suspensión de lípidos marcado con radio y agregue 8,89 microlitros de un hidróxido de sodio normal a la suspensión. Después de tapar y girar el vial, golpee suavemente el vial para eliminar la suspensión atrapada en el espacio de la tapa y llene el espacio de la cabeza con gas PFP. Coloque el vial en un agitador mecánico y actívelo durante 45 segundos a 4,530 RPM para generar una suspensión de microburbujas lechosas. Tras el enfriamiento pasivo a temperatura ambiente, invierta suavemente el vial para volver a suspender la suspensión de microburbujas. Coloque el vial sobre una superficie plana y espere dos minutos. Mientras tanto, equipe una jeringa de plástico de un mililitro con una aguja de calibre 18 y ventile la jeringa aspirando y sumergiendo aire hacia adentro y hacia afuera. Después de dos minutos, destape el vial rápidamente y extraiga de 400 a 550 microlitros de la suspensión del fondo del vial. Limpie con cuidado los bordes de la aguja y transfiera la suspensión de microburbujas a un tubo de microcentrífuga. Después de tapar el tubo, mida la actividad del producto final de microburbujas en un calibrador de dosis y anote el tiempo. Divida el valor de actividad por el volumen decantado para obtener la actividad en megabecquerelios por mililitro. Para comenzar, agregue de 10 a 200 microlitros de la suspensión de microburbujas a una unidad de filtro de centrífuga de corte de 0.5 mililitros y 30,000 pesos moleculares en un tubo de microcentrífuga compatible. Centrifugar la suspensión a 12.000 G durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, use tijeras para cortar la conexión entre el tubo de microcentrífuga y su tapa. Coloque la tapa en un vial de centelleo de 20 mililitros etiquetado como CAPS. Transfiera la unidad de filtro a un nuevo tubo de microcentrífuga etiquetado como TUBE 2. Coloque el primer tubo de microcentrífuga que contiene infranadante en un vial de centelleo de 20 mililitros etiquetado como TUBO 1. Agregue 200 microlitros de agua doble destilada a la unidad de filtro en TUBE 2. Centrifugar de nuevo la unidad de filtrado a 12.000 G durante 10 minutos. Después de la última transferencia de la unidad de filtro, agregue 200 microlitros de agua destilada a la unidad de filtro en TUBE 3 y centrifuge. Después de la centrifugación, corte la tapa del tubo, agréguela al vial de centelleo de la tapa y transfiera la unidad de filtro a un nuevo vial de centelleo de 20 mililitros etiquetado como UNIDAD. Coloque el TUBO 3 en un nuevo vial de centelleo de vidrio de 20 mililitros. Tape los cinco viales de centelleo y prepare un vial de centelleo vacío y tapado como control en blanco. Mida los seis viales de centelleo en un contador gamma para detectar la actividad del cobre 64. Reste el control en blanco de las otras mediciones del vial. Calcule la eficiencia de radioetiquetado o quelación.