Name: Fabricación y etiquetado de microburbujas con trazadores fluorescentes y radiactivos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Aprende a fabricar microburbujas lipídicas con marcado radiactivo y fluorescente mediante un método de un solo paso que alcanza >95% de eficiencia sin purificación, ideal para aplicaciones de imagen y terapia del cáncer.

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Las microburbujas son agentes teranósticos supramoleculares del tamaño de una micra con un núcleo de gas estabilizado por una proteína, un polímero o, en la mayoría de los casos, una capa lipídica (Figura 1A). Cuando se inyectan en el torrente sanguíneo, las microburbujas mantienen interfaces gas/líquido que son detectables por ultrasonido durante períodos de tiempo de minutos antes de la disolución de sus núcleos de gas 1,2. En consecuencia, el primer uso clínico de las microburbujas fue como agentes de contraste para imágenes de ultrasonido en tiempo real3. La invención del ultrasonido focalizado terapéutico (FUS) amplió las utilidades clínicas de las microburbujas. Cuando son estimuladas por FUS de baja frecuencia, las microburbujas oscilan y generan fuerzas mecánicas específicas y sintonizables que van desde la permeabilización vascular transitoria hasta la ablación focal del tejido 4,5. Como resultado, en los últimos 20 años, se han explorado las microburbujas-FUS para la apertura de la barrera hematoencefálica (BBB), la administración de fármacos y sondas de imagen tumorales (por ejemplo, cáncer metastásico de páncreas, cerebro e hígado), la terapia de enfermedades neurodegenerativas y la ablación del cáncer 6,7,8,9,10,11.
El arsenal teranóstico de microburbujas continúa avanzando en nuevas y emocionantes direcciones. Las aplicaciones convencionales de administración de microburbujas-FUS se basan en la administración conjunta de carga terapéutica o de imagen junto con microburbujas comerciales. Existe un creciente interés en mejorar las capacidades de administración de microburbujas-FUS mediante la comprensión de las interacciones biológicas/carcasa de microburbujas, la exploración de formulaciones de microburbujas no comerciales hechas a medida y la generación de microburbujas teranósticas todo en uno con carga cargada directamente en la carcasa de microburbujas 12,13,14. De hecho, aproximadamente el 40% de los estudios de administración de fármacos con microburbujas lipídicas utilizan este tipo de microburbujas cargadas con cáscara15. Más allá de la obtención de imágenes y la administración de fármacos, la microburbuja-FUS también se ha mostrado prometedora en la mejora de la radioterapia contra el cáncer16 y en la activación de los efectos antineoplásicos de agentes cargados de cáscara que de otro modo serían benignos a través de la terapia sonodinámica17,18.
Estas direcciones convencionales y ampliadas en las aplicaciones de cáncer con microburbujas se pueden avanzar de manera más estratégica mediante el etiquetado de las cáscaras de microburbujas con trazadores radiactivos. En el ámbito de las microburbujas cargadas de carga todo en uno, este radiomarcaje 1) facilita la evaluación cuantitativa de referencia de la biodistribución dentro y fuera del objetivo de estas cubiertas de microburbujas cargadas, 2) deriva relaciones farmacocinéticas estructura-actividad que informan la selección óptima de las composiciones de microburbujas para maximizar la entrega en el objetivo, y 3) guía la aplicación estratégica y apropiada guiada por imágenes y la planificación del tratamiento (por ejemplo, tipos de dianas tisulares, dosimetría, selección de fármacos para mitigar los problemas de seguridad fuera del objetivo, utilidad en comparación con los paradigmas convencionales de cotratamiento) de los sistemas de carga todo en uno15,19. En una etapa preclínica, esta comprensión del destino de la cáscara de las microburbujas también puede iluminar los mecanismos de acción más amplios de las microburbujas-FUS. Por ejemplo, se ha demostrado que la transferencia de lípidos de las microburbujas a las células diana influye en la sonoporación habilitada para FUS12,20. Por lo tanto, la comprensión y optimización de dicha transferencia puede informar las terapias preclínicas y clínicas con microburbujas-FUS en las que está implicada la sonoporación (transfección in vitro, administración de fármacos, ablación tumoral, sensibilización a la radiación y terapia sonodinámica 20,21,22,23,24,25). Las instalaciones duales de ultrasonido y radioimagen también permitirían la apertura de vasos FUS y el seguimiento del tratamiento (por ejemplo, cinética de apertura de BBB) a partir de un solo agente en lugar de los diseños convencionales de doble agente26. En la misma línea, el radiomarcaje de microburbujas lipídicas podría servir como una alternativa todo en uno de microburbujas-FUS/radioterapia a las plataformas de administración conjunta de microburbujas-FUS + radiofármacos27.
La fragilidad de las microburbujas es un desafío nada trivial para este tipo de etiquetado. Todas las estrategias de radiomarcaje existentes están limitadas por metodologías de purificación que se sabe que perturban la estabilidad y el tamaño de las microburbujas, mientras que algunas también presentan un radiomarcaje ineficaz e inestable 28,29,30,31,32. Los requisitos de purificación también conducen a protocolos más largos. En combinación con el uso de radioisótopos de vida corta (por ejemplo, 18F t1/2 1,8 h,28,29 99mTc t1/2 6 h,3268Ga t1/2 1 h31), esto crea ineficiencias relacionadas con la desintegración de los radioisótopos y limita los plazos de planificación de las imágenes radioeléctricas y el tratamiento. En conjunto, estas limitaciones corren el riesgo de adquirir imágenes radiográficas acortadas y no representativas, datos farmacocinéticos inexactos y una administración ineficiente de radioisótopos tumorales.  
En este informe, estas limitaciones se superan aprovechando las capacidades de quelación de metales fuertes y estables de la porfirina. Las porfirinas son macromoléculas orgánicas heterocíclicas con un anillo plano altamente conjugado y un sitio de coordinación central que puede acomodar una variedad de metales. Esto incluye radioisótopos de vida más larga como el cobre-64 (t1/2 12,7 h), un radiofármaco con tomografía por emisión de positrones (PET) y factibilidad de conteo de γ33. Cuando se conjugan con una columna vertebral lipídica, las porfirinas pueden incorporarse fácilmente a estructuras supramoleculares y posteriormente marcarse con cobre-64 con velocidad, alta eficiencia de quelación y estabilidad sérica, mientras se mantienen las propiedades de las partículas principales no marcadas33,34. Además, las porfirinas son fluorescentemente activas con autoenfriamiento modular en nano y micropartículas que se restaura tras la ruptura de partículas; una lectura complementaria a la PET y al recuento de γ que facilita el análisis del destino de las conchas tanto a granel como microscópicas (Figura 1A)15.
Mediante el uso de lípidos de porfirina como quelante, estas propiedades se explotaron para generar una nueva metodología de radiomarcaje de microburbujas sin purificación de un solo recipiente (Figura 1B, C) que supera las limitaciones asociadas con los métodos de radiomarcado de microburbujas existentes. Este protocolo logra una eficiencia de quelación de cobre-64 del &gt;95%, no requiere purificación posterior al etiquetado y conserva las propiedades fisicoquímicas de las microburbujas. Puede integrarse fácilmente en la fabricación "desde cero" de microburbujas lipídicas antes de su activación (Figura 1B). Es versátil y se puede aplicar con éxito en formulaciones de microburbujas personalizadas y comerciales con diferentes longitudes de cadena lipídica de acilo (C16 a C22), carga (neutra y aniónica) y composiciones de porfirina-lípidos (1 mol, 10 mol, 30 mol), generando microburbujas con actividad de radio y fluorescencia. Su adaptabilidad también puede extenderse más allá de la porfirina. El protocolo de un solo recipiente se puede modificar para utilizar quelantes alternativos disponibles comercialmente (p. ej., pentaacetato de dietilentriamina (DTPA)-lípidos) y fluoróforos (p. ej., DiI). También se puede modificar para etiquetar formulaciones de microburbujas prefabricadas a través de un enfoque de "spiking". En consecuencia, este método permite la producción de microburbujas personalizadas y trazables (radio, fluorescentes o radio/fluorescentes activos duales) útiles para avanzar en aplicaciones mecánicas, de imagen y terapéuticas de microburbujas-FUS. El protocolo a continuación describe la fabricación de microburbujas lipídicas, la aplicación del protocolo de radiomarcaje de un solo recipiente, el radiomarcaje requerido y la caracterización de propiedades fisicoquímicas, y las posibles modificaciones.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67431/67431fig01v4.jpg"> 
Figura 1: Protocolo de fabricación y radiomarcaje de microburbujas. (A) El lípido de porfirina, en forma de pirofeforbida-a-lípido, sirve como quelante multimodal dentro de este protocolo. Como monómero quelado a cobre-64 (i), tiene capacidades de PET e imágenes. Su fluorescencia se apaga en forma de partículas (microburbujas (ii) y su nanoprogenie posterior a la disolución (iii)) y se apaga con la disrupción de partículas (iv). (B) Protocolo de hidratación/activación de la película lipídica descrito en este informe para generar microburbujas lipídicas desde cero y (C) integración del radiomarcaje de un solo recipiente entre la formación de la suspensión lipídica y la activación de la microburbuja. Esta figura fue adaptada con permiso de Rajora et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67431/67431fig1v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>64CuCl2</td><td>Facultad de Medicina de la Universidad de Washington, Instituto de Radiología Mallinckrodt</td><td>N/A</td><td>Ordene en pequeño volumen (< 10 &micro; L) disuelto en ácido acético 0,1 N HCl</td></tr><tr><td></td><td>Cualquier empresa</td><td></td><td>&ge; 95% de pureza</td></tr><tr><td>Papel de aluminio</td><td>Cualquier empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetato de amonio</td><td>Cualquier empresa</td><td></td><td>Pureza: &ge; 98%</td></tr><tr><td>Equilibrio - analítico</td><td>Cualquier empresa</td><td></td><td>Capaz de medir hasta 0,1 mg</td></tr><tr><td>Sonicate de baño</td><td>Cualquier empresa</td><td></td><td>Se puede calentar a 69 oC</td></tr><tr><td>Apertura CC - 30 micras</td><td>Beckman Coulter</td><td>A36391</td><td>Rango de diámetro de partículas: 0,6-18 mmm</td></tr><tr><td>Electrolito CC</td><td>Diluyente Beckman Coulter</td><td>8546719</td><td>Isoton II</td></tr><tr><td>Software CC Beckman</td><td>Coulter</td><td>Multisizer 4e</td><td></td></tr><tr><td>Unidades de filtro de centrífuga (0,5 mL 30.000 MWCO) con tubos de microcentrífuga compatibles</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC503096</td><td>Amicon Ultra - 0,5 mL</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga - 15 mL con tapones</td><td>Cualquier empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Cualquier empresa</td><td></td><td>Pureza: &ge; 99,8%&nbsp;</td></tr><tr><td>Contador de rejas</td><td>Beckman Coulter</td><td>B43905</td><td>Multisizer 4e Cubierta de contador de rejas</td></tr><tr><td>Resbalones VWR</td><td></td><td>48393081</td><td>Cubierta de micro cubierta de vidrio VWR</td></tr><tr><td>CuCl2</td><td>Cualquier empresa</td><td></td> Asegúrese de que <td>no se oxide</td></tr><tr><td>CuCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cubetas, 1 cm de longitud</td><td>de recorrido Cualquier empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cubetas - 10 ml de plástico para mediciones CC</td><td>Beckman Coulter</td><td>A35471</td><td>Coulter Counter Accuvette ST</td></tr><tr><td>ddH2O</td><td>Cualquier empresa</td><td></td><td>Se puede obtener a través de un sistema de purificación de agua ultrapura</td></tr><tr><td>DiI (1,1'-dioctadecilo-3,3,3',3'-tetrametilindocarbocianina Perclorato)</td><td>Cualquier empresa</td><td></td><td>Forma de polvo</td></tr><tr><td>Calibrador de dosis</td><td>Cualquier empresa</td><td></td><td>Capaz de leer cobre-64</td></tr><tr><td>DPPA (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfato (sal de sodio))</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>830855P</td><td>Polvo DPPC</td></tr><tr><td>(1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850355P</td><td>Polvo</td></tr><tr><td>DPPE-MPEG (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-5000] (sal de amonio))</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880200P</td><td>Polvo</td></tr><tr><td>DTPA-lípido (ácido 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-dietilentriaminapentaacético (sal de amonio))</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>790106P</td><td>Forma de polvo</td></tr><tr><td>EDTA (ácido etilendiaminotetraacético)</td><td>Cualquier empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Contador de rayos gamma</td><td>Cualquier empresa</td><td></td><td>Capaz de leer cobre-64</td></tr><tr><td>Tapas de empuje de tubo de conteo gamma</td><td>Globe Scientific</td><td>22-171-665</td><td>Bridado tapones para tubos de 12 mm</td></tr><tr><td>Tubos de conteo gamma</td><td>Sarstedt</td><td>55.1579</td><td>5 mL, 75 x 12 mm, PS</td></tr><tr><td>Vaso de precipitados de vidrio - 250 mL</td><td>Cualquier empresa</td><td></td><td>Capaz de soportar temperaturas de hasta 100 oC</td></tr><tr><td>Horno de secado de vidrio</td><td>Cualquier empresa</td><td></td><td>Se puede calentar a 80 oC</td></tr><tr><td>Jeringas de microlitros de vidrio - 25, 50, 100, 1000 &micro; L</td><td>Cualquier empresa</td><td></td><td>Compatible con disolventes orgánicos Viales</td></tr><tr><td>de vidrio de centelleo - 20 mL</td><td>VWR</td><td>66022-081</td><td>VWR&reg; Frascos de centelleo, vidrio de borosilicato, con tapones de rosca, con revestimiento de lámina de pulpa</td></tr><tr><td>Viales de vidrio - 0,5 dram</td><td>VWR</td><td>66011-020</td><td>Vial VWR 1/2 dram, con tapón de rosca fenólico negro y revestimiento de pulpa con revestimiento de polivinilo</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7757-1L</td><td>Pureza:&nbsp; &ge; 99,0%&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipeta/pistola graduada</td><td>Cualquier empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa</td><td></td><td></td> caliente/agitadora <td>Equipada con sonda de temperatura para el control automático de la temperatura</td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico - 0,1 N</td><td>Cualquier empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas iTLC</td><td>Agilent</td><td>A120B12</td><td>&nbsp; Papel de cromatografía iTLC-SA</td></tr><tr><td>Tejidos de laboratorio</td><td>Cualquier empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unidad de filtración al vacío de medios</td><td>Cualquier empresa</td><td></td><td>Tamaño de poro de 0,22 micras, membrana PES, capacidad de embudo de 500 ml</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Cualquier empresa</td><td></td><td>Pureza:&nbsp; &nbsp; &ge; 99,8%, grado de HPLC, cumple con las especificaciones ACS</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga no estériles - 1,5 mL</td><td>Cualquier empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga estériles - 1.5 mL</td><td>Cualquier compañía</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipetes - p1000, p200, p20, p10</td><td>Cualquier compañía</td><td></td><td>Asegúrese de estar calibrados</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>Superfrost Plus Portaobjetos de microscopio Agujas prelimpiadas</td></tr><tr><td>- 18 G</td><td></td><td></td><td>Parafilm estéril</td></tr><tr><td></td><td>Cualquier compañía</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td>DPBS, modificado, sin cloruro de calcio y cloruro de magnesio, líquido, filtrado estéril, apto para cultivo celular</td></tr><tr><td>PFP</td><td>FluoroMed</td><td>APF-N40HP</td><td>Pureza:&nbsp; &nbsp; &ge; 99.8%</td></tr><tr><td>PFP línea</td><td>Cualquier compañía</td><td></td><td>Manguera de plástico de 1/4 de pulgada de diámetro cortada de unos 50 cm de longitud</td></tr><tr><td>Regulador PFP</td><td>Swagelok</td><td>SS-1RF4 y SS-4HC-1-4</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de pH</td><td>Cualquier empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estándares de pH 4 y 7</td><td>Cualquier empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta para p1000, p200, p10 - no estériles</td><td>Cualquier empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta para p1000, p200, p10 - estériles</td><td>Cualquier empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de plástico - 1 ml</td><td>Cualquier empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estéril Propilenglicol</td><td>BioShop</td><td>PRO888.500</td><td>Pureza:&nbsp; &nbsp; &ge; 99.5%</td></tr><tr><td>Piro-lípido</td><td>N/A</td><td></td><td>Hecho en casa</td></tr><tr><td>Pinzas con punta de goma</td><td>Cualquier empresa</td><td></td><td>Mezcla de bordes finos y planos/cuadrados recomendada</td></tr><tr><td>Tijeras Cualquier</td><td>empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio - 1 N</td><td>Cualquier empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio - 10 N</td><td>Cualquier empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espectrofluorómetro</td><td>Cualquier empresa</td><td></td><td>Capaz de excitación de 410 nm y emisión de 600-850 nm Software de</td></tr><tr><td>espectrofluorometría</td><td>Espectrómetro Horiba</td><td>FluorEssence</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Cualquier empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jeringa - 1 ml</td><td>Cualquier empresa</td><td></td><td>Desechable, plástico, estéril</td></tr><tr><td>Filtros de jeringa - 0,2 micras Tamaño de poro</td><td>Cualquiera empresa</td><td></td><td>Material de la membrana: PES u otro compatible con acetato de amonio/ácido acético y PBS</td></tr><tr><td>Tubo de ensayo - 10 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Cualquier empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desecador/vacío al vacío</td><td>Cualquier empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vialmix</td><td>Lantheus Medical Imaging</td><td>515030-0508</td><td>Denominado en el protocolo agitador mecánico de viales</td></tr><tr><td>Pesar papel</td><td>Cualquier empresa</td><td></td><td>Para evitar perder producto, se recomienda cortar el papel de peso en cuadrados de 3x3 cm</td></tr></tbody></table>

fabricación y etiquetado de microburbujas con trazadores fluorescentes y radiactivos

Fabricating and Labeling Microbubbles with Fluorescent and Radioactive Tracers

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Fabricación y etiquetado de microburbujas con trazadores fluorescentes y radiactivos

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