Imágenes de inmunofluorescencia múltiple basadas en códigos de barras de ADN para analizar muestras de FFPE de melanoma murino reprogramado genéticamente

Presentamos un protocolo para desarrollar y validar un panel de inmunofluorescencia multiplex para estudiar tejidos FFPE de ratón y demostrar su utilidad mediante el estudio de muestras de un modelo de melanoma tratado con nanopartículas que administran ADN plasmático, codificando señales inmunológicas para reprogramar el microambiente tumoral. El campo carecía de protocolos de inmunofluorescencia multiplex rigurosamente desarrollados y validados compatibles con tejidos FFPE fijados en formol e incluidos en parafina de ratón.

La inclusión de parafina fijada en formol preserva la morfología del tejido a largo plazo, es fácil de manejar y almacenar, y permite la creación de micromatrices de tejido para ver múltiples muestras en un solo portaobjetos.

Las imágenes de proteómica espacial mejorarán la visualización y el análisis de un microambiente tumoral complejo, lo que en última instancia ayudará a predecir las respuestas inmunitarias, lo que puede contribuir al desarrollo de mejores terapias.

Usaremos este protocolo para permitir un mejor perfil espacial de modelos de tumores de ratón en muchos más tipos de tumores y diferentes órganos inmunológicos.

[Narrador] Para comenzar, hornee los portaobjetos de papel FFPE a 60 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, enfríe los portaobjetos a temperatura ambiente durante 10 minutos antes de comenzar la desparafinación y la rehidratación. A continuación, incube los portaobjetos en una solución de xileno dos veces durante cinco minutos cada uno para eliminar la parafina, luego rehidrate el tejido moviendo los portaobjetos a través de etanol al 100% dos veces durante cinco minutos cada uno. Coloque el portaobjetos secuencialmente en soluciones de etanol al 90%, 70%, 50% y 30% durante cinco minutos cada una. Lave los portaobjetos dos veces con agua destilada durante cinco minutos cada uno. Realice la recuperación de antígenos, luego use una solución blanqueadora nueva para blanquear el tejido dos veces durante intervalos de 45 minutos antes de realizar la tinción de anticuerpos. A continuación, realice la tinción de anticuerpos durante la noche a cuatro grados centígrados utilizando una cámara de plástico. Después de la tinción, retire la cámara de plástico y recoja el cóctel de anticuerpos aplicado anteriormente. Lave los portaobjetos dos veces en tampón de tinción durante dos minutos cada uno. Incube los portaobjetos en un frasco de tinción que contenga 40 mililitros de solución de fijación posterior a la tinción durante 10 minutos, luego enjuáguelos con PBS tres veces durante dos minutos cada uno. Ahora transfiera los portaobjetos a metanol helado durante cinco minutos, antes de enjuagar con PBS. Aplique 200 microlitros de solución fijadora final a cada portaobjetos debajo de una cámara de humedad. Después de una incubación de 20 minutos a temperatura ambiente, vuelva a lavar los portaobjetos en PBS durante tres ciclos de dos minutos cada uno. Si obtiene imágenes de inmediato, limpie el portaobjetos alrededor del pañuelo con un pañuelo sin pelusa. Presione la celda de flujo durante 30 segundos utilizando el equipo de ensamblaje de la celda de flujo. Si se obtiene una imagen más tarde, almacene el portaobjetos sin aplicar la celda de flujo en el tampón de almacenamiento a cuatro grados centígrados. Cuando esté listo para obtener imágenes, transfiera los portaobjetos del búfer de almacenamiento a PBS durante 10 minutos antes de aplicar la celda de flujo. A continuación, prepare los búferes DMSO de rodaje en función de los ciclos de imágenes deseados. Prepare la solución madre reportera necesaria para el número total de ciclos de imagen. Pipetee 250 microlitros de solución madre reportera y cinco microlitros de cada reportero en tubos de microcentrífuga de un mililitro etiquetados como negros o ámbar. Transfiera la solución a una placa negra de 96 pocillos y séllela con papel de aluminio adhesivo. Ahora inicie el dispositivo de imágenes y use el administrador de instrumentos para configurar los parámetros y los tiempos de exposición. Coloque la placa indicadora en el dispositivo y luego coloque el portaobjetos en el soporte del microscopio para comenzar a obtener imágenes. Adquirir imágenes de tejidos teñidos. Instale la última versión del software de análisis de patología digital. Haga clic en Crear proyecto y seleccione una carpeta de destino para el espacio del proyecto. A continuación, haga clic en Agregar imágenes, seguido de Elegir archivos. A continuación, navegue hasta el archivo QuP TIFF producido a partir de imágenes de inmunofluorescencia multiplex. Establezca el tipo de imagen en fluorescencia, mantenga la configuración predeterminada y haga clic en Importar. Si utiliza QuPath, haga doble clic en la nueva imagen para abrir un espacio de trabajo y, a continuación, pulse Archivo y Guardar periódicamente para realizar un seguimiento de los cambios del proyecto. Alterne la configuración de visibilidad y visualización del marcador con la herramienta de brillo y contraste de la barra de herramientas. Utilice la herramienta Pincel o varita para dibujar una anotación alrededor de toda la sección de tejido. Defina esta anotación como tejido completo y excluya la piel suprayacente o las regiones que no deben analizarse. Mantenga presionada la tecla ALT para crear anotaciones negativas o reducir los límites. Ahora elija la anotación haciendo clic en la pestaña Anotaciones y presionando Objetos seguido de Anotaciones, luego haga clic en Duplicar anotaciones seleccionadas. Encienda el canal SOX 10, luego reduzca la anotación duplicada para definir la región del tumor usando ALT + herramienta de pincel / varita. Ahora seleccione la anotación de tejido completa. Luego vaya a Objetos seguido de Anotaciones y Expandir Anotaciones. Establezca el radio de expansión en un micrómetro y haga clic en Ejecutar. Cambie el nombre de esta nueva anotación a Expansión de tejido completo. Seleccione la anotación del tumor, haga clic con el botón derecho y seleccione Insertar en jerarquía. Vuelva a seleccionar la anotación del tumor, luego vaya a Objetos, Anotaciones y ahora haga clic en Hacer inversa. Defina esta nueva anotación como Estroma y repita para todas las secciones de tejido. Para ejecutar la segmentación de celdas, haga clic en la pestaña Imagen para encontrar el ancho de píxeles y la altura de la imagen. Descargue la extensión StarDist desde GitHub. Importe el archivo de StarDist.jar de extensión QuPath en QuPath. También descargue los archivos de script y el archivo de modelo de StarDist de GitHub. Para cada sección de tejido, seleccione las anotaciones del tumor y del estroma. En la barra de configuración, haga clic en Automatizar seguido de Editor de scripts para abrir la interfaz de scripts. Abra el script de segmentación de celdas StarDist apropiado correspondiente al tamaño de píxel de la imagen. Cuando se le solicite, seleccione StarDistcellsegmodel.pb para la segmentación de celdas. Después de la segmentación de celdas, guarde la imagen, luego haga clic secuencialmente en Medir, Exportar medidas, seleccione las imágenes correspondientes y establezca el tipo de exportación como celdas y el separador como .csv. Elija una ubicación de archivo de salida y, a continuación, haga clic en Rellenar para incluir métricas relevantes. Para cada marcador de linaje que se utilizará en la agrupación o el fenotipado, seleccione un valor medio para exportar. Para la normalización de los datos proteómicos, abra el archivo CSV exportado y trunque los encabezados de columna para conservar solo el nombre del marcador. Después de instalar la última versión de R & R Studio, descargue el script .r de normalización de marcadores de GitHub y ejecútelo para filtrar las celdas según el tamaño nuclear. Realice una normalización mínima / máxima para cada marcador. Una vez completado, guarde el nuevo archivo CSV con los datos normalizados. La conjugación del código de barras del ADN del anticuerpo se confirmó mediante electroforesis en gel de proteínas, mostrando bandas adicionales en la región de la cadena pesada. Las imágenes de inmunofluorescencia multiplex de tumores de flanco B16-F10 tratados con nanopartículas 4-1BBL/IL-12 y anti-PD1 sistémico mostraron una expresión distinta de marcadores inmunitarios en todas las secciones tumorales. La agrupación de FlowSOM identificó un rango más amplio de intensidades de expresión de marcadores en comparación con el fenotipado de Seurat, con una diferencia de intensidad máxima de aproximadamente 0,7 frente a 0,5. El fenotipado de FlowSOM también clasificó un mayor número de macrófagos en los subtipos M1 y M2. La cuantificación de las densidades de macrófagos mostró que FlowSOM detectó densidades más altas de macrófagos M1 y M2 en comparación con Seurat, mientras que Seurat clasificó más macrófagos como Otros. El análisis espacial reveló que los macrófagos M2 y las células asesinas naturales tenían las distancias mínimas promedio más altas después del tratamiento y los macrófagos M1 eran más frecuentes alrededor de las células T CD8.