Name: Análisis de la Expresión y Ensamblaje de Complejos de las Proteínas de la Cadena Respiratoria Mitocondrial en la Levadura de Fisión Schizosaccharomyces pombe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Aprende a analizar la expresión y ensamblaje de complejos de la cadena respiratoria mitocondrial en Schizosaccharomyces pombe. Este protocolo utiliza SDS-PAGE y BN-PAGE para estudiar el gen shy1 y su función en la biología celular.

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<ol><li>Schatz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+mitochondria+to+center+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Comm%22%5BJournal%5D)">Getting mitochondria to center stage.</a> Biochem Biophys Res Comm. 434 (3), 407-410 (2013).</li>
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<li>Vercellino, I., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assembly%2C+regulation+and+function+of+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 141-161 (2022).</li>
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<li>Wittig, I., Braun, H. P., Schägger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li>
<li>Lemaire, C., Dujardin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+respiratory+chain+complexes+from+Saccharomyces+cerevisiae+wild-type+and+mutant+mitochondria+activity+measurement+and+subunit+composition+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of respiratory chain complexes from Saccharomyces cerevisiae wild-type and mutant mitochondria activity measurement and subunit composition analysis.</a> Meth Mol Biol. 432, 65-81 (2008).</li>
<li>Konovalova, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Mitochondrial+Respiratory+Chain+Complexes+in+Cultured+Human+Cells+using+Blue+Native+Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis+and+Immunoblotting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Complexes in Cultured Human Cells using Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Immunoblotting.</a> J Vis Exp. (144), e59269(2019).</li>
<li>Fiala, G. J., Schamel, W. W. A., Blumenthal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+Native+Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis+%28BN-PAGE%29+for+Analysis+of+Multiprotein+Complexes+from+Cellular+Lysates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates.</a> J Vis Exp. (48), e2164(2011).</li>
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<li>Sellem, C. H., Lemaire, C., Lorin, S., Dujardin, G., Sainsard-Chanet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+Between+the+oxa1+and+rmp1+Genes+Modulates+Respiratory+Complex+Assembly+and+Life+Span+in+Podospora+anserina%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Interaction Between the oxa1 and rmp1 Genes Modulates Respiratory Complex Assembly and Life Span in Podospora anserina.</a> Genetics. 169 (3), 1379-1389 (2005).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Ácido 6-aminocaproice</td><td>Sangon</td><td>A430196</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida/Bis (37.5:1) 40%&nbsp;</td><td>Biolab</td><td>GS1374</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amonio</td><td>Sangon</td><td>A100486</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-Atp6</td><td>Bioworld</td><td>IB interno</td><td>: 1:200</td></tr><tr><td>Anticuerpo Anti-Cob1</td><td>Bioworld</td><td>IB interno</td><td>: 1:1000</td></tr><tr><td>Anticuerpo Anti-Cox1</td><td>Bioworld</td> IB <td>interno</td><td>: 1:2000</td></tr><tr><td>Anticuerpo Anti-Cox2</td><td>Bioworld</td><td>IB interno</td><td>: 1:1000</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-Cox3</td><td>Bioworld</td><td>in-house</td><td>IB: 1:200</td></tr><tr><td>Anticuerpo Anti-Hsp60</td><td>Bioworld</td><td>in-house</td><td>IB: 1:3000</td></tr><tr><td>BCA Protein Quantification Kit</td><td>LEAGENE</td><td>PT0001</td><td></td></tr><tr><td>Bis-Tris</td><td>YEASEN</td><td>60105ES25</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue G-250</td><td>SERVA</td><td>17524.01</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Azul brillante R-250</td><td>Sangon</td><td>A100472</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Sangon</td><td>A100691</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Solarbio</td><td>E8030</td><td></td></tr><tr><td>Mezclador de gradiente</td><td>Millet scientific</td><td>MGM-50</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Solarbio</td><td>H8090</td><td></td></tr><tr><td>Marcador de proteína de alto peso molecular para PÁGINA nativa Tiempos</td><td>reales</td><td>RTD6142</td><td></td></tr><tr><td>IgG-Alexa Fluor Plus 800 (anticuerpo secundario anti-conejo)</td><td>Thermo Fisher</td><td>A32735</td><td>IB: 1:10000</td></tr><tr><td>Immobilon-FL 0.45 &mu; m Membrana de PVDF</td><td>Millipore</td><td>IPFL00005</td><td></td></tr><tr><td>Kimble Kontes Dounce grinder de tejidos</td><td>Thermo Fisher</td><td>K8853000015</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sangon</td><td>A610441</td><td></td></tr><tr><td>Lallzyme MMX</td><td>Lallemand</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Enzima lisante</td><td>Sigma</td><td>L3768</td><td></td></tr><tr><td>Lyticase</td><td>Sigma</td><td>L4025</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sangon</td><td>A601336</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sangon</td><td>A421333</td><td></td></tr><tr><td>Geles nativos de Bis-Tris (prefabricados)</td><td>Solarbio</td><td>PG41510-N</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sangon</td><td>A610425</td><td></td></tr><tr><td>Gel prefabricado Running tampón para Native-PAGE</td><td>Solarbio</td><td>PG00020-N</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel inhibidor de la proteasa para extractos de levadura</td><td>Beyotime</td><td>P1020</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sangon</td><td>A610498&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Solarbio</td><td>T8220</td><td></td></tr><tr><td>Vinotaste</td><td>Novozymes</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase</td><td>MP Biomedicals</td><td>320921</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis de la expresión y ensamblaje de complejos de las proteínas de la cadena respiratoria mitocondrial en la levadura de fisión schizosaccharomyces pombe

Analysis of the Expression and Complexes Assembly of the Mitochondrial Respiratory Chain Proteins in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

Anteriormente utilizamos este protocolo para investigar los efectos de la deleción de shy1, el homólogo de S. pombe de SURF1 humano, en la expresión de proteínas de la cadena respiratoria codificadas por ADNmt y el ensamblaje de complejos de la cadena respiratoria mitocondrial. Encontramos que los niveles de estado estacionario de Cob1, Cox1, Cox2, Cox3 y Atp6 se redujeron significativamente en la cepa Δshy1 (Figura 3), lo que indica que Shy1 es necesaria ...

Análisis de la Expresión y Ensamblaje de Complejos de las Proteínas de la Cadena Respiratoria Mitocondrial en la Levadura de Fisión Schizosaccharomyces pombe

The mitochondrial respiratory chain is crucial for cellular energy metabolism, serving as the core of oxidative phosphorylation. The mitochondrial ...

analysis-expression-complexes-assembly-mitochondrial-respiratory

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Se presenta un protocolo de cómo recoger y electrones proceso de crio-tomografías de toda la mitocondria. La técnica ofrece una detallada comprensión de la estructura, función y organización de grandes complejos de proteínas de membrana en membranas biológicas nativas.

La visualización de la ATP sintasa dímeros en mitocondrias por Electron Cryo-tomografía

Este protocolo describe la separación de complejos funcionales de cadenas de transporte de electrones mitocondriales (Cx) IV y sus supercomplejos utilizando electroforesis nativa para revelar información sobre su ensamblaje y estructura. El gel nativo puede someterse a inmunotransferencia, ensayos en gel y purificación por electroelución para caracterizar adicionalmente los complejos individuales.

Análisis de supercomplexes de la cadena de transporte de electrones mitocondriales con electroforesis nativa, ensayos en gel y electroelución

Este protocolo muestra el análisis de los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial por electroforesis en gel de poliacrilamida nativo azul. Aquí se describe el método aplicado a las células humanas cultivadas.

Análisis de complejos de cadena respiratoria mitocondrial en células humanas cultivadas usando electroforesis en Gel de poliacrilamida nativo azul e Immunoblotting

Aquí presentamos un protocolo para extraer, resolver e identificar los supercomplejos mitocondriales que minimizan la exposición a los detergentes y al azul de Coomassie. Este protocolo ofrece un equilibrio óptimo entre la resolución y la preservación de las actividades enzimáticas, al tiempo que minimiza el riesgo de pérdida de interacciones entre proteínas y proteínas del lábil.

Híbrido claro/azul electroforesis nativa para la separación y análisis de Supercomplejos de cadenas respiratorias mitocondriales

El genoma mitocondrial de levadura de Baker codifica ocho polipéptidos. El objetivo del protocolo actual es etiquetarlos todos ellos y posteriormente visualizarlos como bandas separadas.

Etiquetado y visualización de productos de expresión del genoma mitocondrial en la levadura de Panadero Saccharomyces cerevisiae

A pesar de los avances recientes, muchas proteínas mitocondriales de levadura aún permanecen con sus funciones completamente desconocidas. Este protocolo proporciona un método sencillo y fiable para determinar la localización submitocondrial de proteínas, que ha sido fundamental para la elucidación de sus funciones moleculares.

Evaluación de la localización de proteínas submitochondriales en levaduras en ciernes Saccharomyces cerevisiae

Este protocolo describe un ensayo comparativo, utilizando actividades complejas mitocondriales CI+CIII y CII+CIII en presencia o ausencia de Na+, para estudiar la existencia de grupos funcionales de CoQ parcialmente segmentados.

La sensibilidad de la membrana mitocondrial interna al Na+ revela grupos de CoQ funcionales parcialmente segmentados

Este protocolo describe una técnica para el análisis de supercomplejos respiratorios cuando solo se dispone de pequeñas cantidades de muestras.

Aislamiento de mitocondrias para el análisis de supercomplejos mitocondriales a partir de muestras de pequeños tejidos y cultivos celulares 

Este trabajo explica cómo transformar las mitocondrias de la levadura utilizando un método biolístico. También mostramos cómo seleccionar y purificar los transformantes y cómo introducir la mutación deseada en la posición objetivo dentro del genoma mitocondrial.

Transformación mitocondrial en Baker

La respiración mitocondrial en células enteras de levadura es un indicador valioso de la bioenergética celular. En este trabajo se presenta un protocolo para cuantificar este fenotipo aplicable a diferentes especies de levaduras.

Cuantificación de la respiración mitocondrial en células enteras de levadura

Aprende a analizar la expresión y ensamblaje de complejos de la cadena respiratoria mitocondrial en Schizosaccharomyces pombe. Este protocolo utiliza SDS-PAGE y BN-PAGE para estudiar el gen shy1 y su función en la biología celular.

Análisis de la Expresión y Ensamblaje de Complejos de las Proteínas de la Cadena Respiratoria Mitocondrial en la Levadura de Fisión Schizosaccharomyces pombe (Video) | JoVE Journal

Análisis de la Expresión y Ensamblaje de Complejos de las Proteínas de la Cadena Respiratoria Mitocondrial en la Levadura de Fisión Schizosaccharomyces pombe

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