Análisis de la Expresión y Ensamblaje de Complejos de las Proteínas de la Cadena Respiratoria Mitocondrial en la Levadura de Fisión Schizosaccharomyces pombe

El alcance de nuestra investigación es la traducción de proteínas mitocondriales, y tratamos de dilucidar los mecanismos que afectan la traducción y el ensamblaje del complejo de la cadena respiratoria mitocondrial. Nuestra investigación encontró que shy1 juega un papel en la sostenibilidad de la función regular de las mitocondrias al participar en el ensamblaje de infusiones complejas de cuatro. Nuestro laboratorio investigará el mecanismo de la infusión de M=metotrexato.

[Narrador] Para comenzar, mida el peso húmedo de un gránulo celular de Schizosaccharomyces pombe. Vuelva a suspender las células en ocho mililitros de tampón S. Agregue ditiotreitol a una concentración final de 10 milimolares y fluoruro de fenilmetilsulfonilo a un milimolar, asegurándose de que ambos reactivos estén recién preparados. Agregue enzimas líticas a la suspensión celular para digerir la pared celular de Schizosaccharomyces pombe. Gire el tubo en un agitador a 30 grados centígrados durante el tiempo recomendado para la enzima lítica específica. Use un microscopio para observar la formación de esferoplastos. A continuación, centrifugar la muestra durante 10 minutos a 1.000 G, a 4 grados centígrados para granular los esferoplastos. Vuelva a suspender el gránulo en ocho mililitros de tampón S helado. Después de dos lavados, vuelva a suspender los esferoplastos en ocho mililitros de tampón de homogeneización helado que contenga inhibidores de la proteasa. Transfiera la mezcla a un homogeneizador de vidrio preenfriado que contenga un mortero y un tubo de ensayo. Homogeneice las células mecánicamente realizando aproximadamente 15 golpes hacia arriba y hacia abajo con el mortero ajustado. Luego, examine los esferoplastos bajo un microscopio para verificar si hay roturas de membrana. Ahora transfiera la suspensión homogeneizada a los tubos de centrífuga. Centrifugar durante cinco minutos a 1.000 G a 4 grados centígrados para granular las células intactas y los residuos. Centrifugar el sobrenadante resultante durante cinco minutos a 3.000 G a 4 grados Celsius para granular los núcleos. Luego transfiera el sobrenadante a tubos de centrífuga nuevos. Centrifugar a 12.000 G durante 15 minutos a 4 grados centígrados para granular las mitocondrias y otros orgánulos, Volver a suspender el gránulo en un mililitro de tampón de fregona EDTA de sorbitol helado después de decantar el sobrenadante. Luego centrifugar nuevamente durante 15 minutos a 12,000 G a 4 grados Celsius para lavar las mitocondrias. Vuelva a suspender el gránulo final en un mililitro de tampón de fregonas EDTA de sorbitol helado. Luego, alícuota las mitocondrias purificadas en tubos de almacenamiento para futuros experimentos. En la página SDS, el tampón de carga en 40 microlitros de proteína total mitocondrial. Desnaturalizar las proteínas incubando la mezcla durante el tiempo indicado a la temperatura adecuada. Cargue aproximadamente 20 microgramos o cuatro microlitros de proteínas mitocondriales en un gel de página SDS al 12% antes de inmunotransferencia. Para preparar la muestra para la página BN, primero se granular la mitocondria de las alícuotas anteriores por centrifugación. Vuelva a suspender las mitocondrias en 200 microlitros de tampón de gel de página XBN. A continuación, pipetee dos microlitros de fluoruro de fenilmetilsulfonilo 100 X y un microlitro de cloruro de magnesio molar. Centrifugar nuevamente durante 15 minutos a 12,000 G a 4 grados centígrados. Vuelva a suspender el gránulo de mitocondrias en 160 microlitros de 5% en peso por volumen digitorum. Incube en hielo durante 30 minutos, mezclando suavemente cada 10 minutos. Centrifugar la suspensión durante cinco minutos a 20.000 G a 4 grados centígrados. Luego transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo. Agregue 80 microlitros de tampón de muestra de tres páginas XBN a la muestra tratada digitorum. O 32 microlitros a la muestra tratada con DDM. Ahora ensamble los geles nativos de Bis-Tris prefabricados con un gradiente del 3 al 12%. Cargue las muestras de proteínas tratadas junto con marcadores de proteínas de alto peso molecular para la electroforesis en gel de poliacrilamida nativa. Haga funcionar el gel a un voltaje constante de 80 voltios y una corriente de seis miliamperios durante 30 minutos utilizando un tampón catódico que contiene 0,02% Kumasi G250. Reemplace el tampón con tampón catódico sin Kumasi y continúe funcionando a 10 miliamperios durante tres horas hasta que el frente de tinte llegue al fondo del gel. Corta el carril de gel que contiene el marcador de proteína. Tiñe el marcador con el tampón Kumasi R250 durante 15 minutos. Luego destiñe hasta que las bandas se vuelvan visibles. Sumerja la parte restante del gel en un tampón de transferencia de páginas BN durante 30 minutos para equilibrar. Enjuague la membrana de transferencia de PVDF de 0,45 micrómetros con metanol y equilibre en tampón de transferencia durante 10 minutos. Transfiera proteínas del gel a la membrana de PVDF utilizando una corriente constante de 300 miliamperios durante dos horas. Enjuague la membrana de PVDF con metanol para eliminar el tinte Kumasi. Luego incube la membrana en tampón de bloqueo TBS que contenga leche descremada al 5% durante una hora a 25 grados Celsius. Incubar la membrana de PVDF con los anticuerpos primarios especificados contra los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial de Schizosaccharomyces pombe. Después de una incubación nocturna a cuatro grados centígrados, lave la membrana con tampón TBST. Luego incube la membrana en el anticuerpo secundario a una dilución de uno a 10,000 durante una hora a 25 grados Celsius. Después de lavar la membrana con tampón TBST, exponga y escanee la membrana de PVDF para visualizar los resultados de inmunotransferencia. La deleción del gen shy1 condujo a una marcada reducción en los niveles de estado estacionario de las proteínas de la cadena respiratoria codificadas por ADN mitocondrial, Cob1, Cox1, Cox2, Cox3 y Atp6. El análisis de la página nativa azul mostró que la abundancia de los supercomplejos de la cadena respiratoria 3242 y 324 solubilizados por DG se redujo en las células Delta shy1. Mientras que los niveles de los supercomplejos 32.= y 55N no se vieron afectados. El nivel del complejo diametral solubilizado 3 de DDM no cambió en la cepa Delta shy1.