Summary
Un protocollo per l'incannulazione della ghiandola salivare sottomandibolare del mouse tramite il dotto di Wharton è descritto. Per questo esperimento, la soluzione trypan blu è usato come un tintore per dimostrare quanto questa tecnica offre efficacemente infusi nella ghiandola mirati, e di suggerire l'affidabilità di questo nuovo approccio clinico come un potenziale farmaco / terapia cellulare per la rigenerazione delle ghiandole salivari.
Abstract
Grave ipofunzione della ghiandola salivare si trova frequentemente nei pazienti con sindrome di Sjögren e quelli che ricevono l'irradiazione terapeutica nella loro testa e del collo per il trattamento del cancro. Entrambi i gruppi di sintomi esperienza pazienti come xerostomia (secchezza delle fauci), disfagia (compromissione della masticazione e della deglutizione), gravi carie dentale, alterazione del gusto, oro-faringeo infezioni (candidosi), mucosite, dolore e disagio.
Un approccio innovativo della medicina rigenerativa per il trattamento delle ghiandole salivari ipo-funzione è speculato in RS Redman, E Mezey et al 2009:. Cellule staminali possono essere depositati direttamente dal incannulazione nella ghiandola come metodo potente nel far rivivere le funzioni della compromissione organo. Presumibilmente, le cellule staminali migrati stranieri differenziarsi in cellule ghiandolari a funzionare come parte della ghiandola salivare ospite. Inoltre, questa tecnica di incannulazione è un metodo di consegna conveniente ed efficace per l'applicazione clinica di trasferimento genico.
Qui si illustrano i passaggi necessari per eseguire la procedura incannulazione sulla ghiandola salivare sottomandibolare del mouse tramite il dotto di Wharton (Fig. 1). C3H topi (Charles River, Montreal, QC, Canada) vengono utilizzati per questo esperimento, che sono stati tenuti in condizioni di pulizia convenzionali alla risorsa McGill University centro animale. Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato di Animal Care Università ed erano in linea con gli orientamenti del Consiglio canadese di prodotti per animali.
Per questo esperimento, una soluzione trypan blu è infusa nella ghiandola attraverso l'apertura del canale della Wharton usando una siringa per insulina con una 29-gauge racchiuso all'interno di un tubo in polietilene. Successivamente, il mouse è sezionato per mostrare che le infusioni migrati nella ghiandola con successo.
Protocol
1. Descrizione procedurali
- Iniettare per via sottocutanea 1 ml / g di peso corporeo di 0,5 mg / ml monoidrato atropina solfato (Cat # 11330, Fluka, USA) in ogni mouse per evitare che le secrezioni salivari di compromettere il movimento delle infusioni.
- Anestetizzare ogni mouse con 1 peso corporeo microlitri / g di un mg / 100 ml di ketamina e 20 mg / ml xylazina (Phoenix scientifico, AR, USA) soluzione iniettata intraperitoneale (IP)
- Posizionare il mouse su una misura piattaforma in plastica in posizione ventrale: incisivi superiori sono bloccati su un filo metallico, e gli incisivi mandibolari sono agganciati su una corda elastica per tenere la bocca aperta.
- Utilizzare una siringa per insulina con una 29-gauge (Cat # 600145, Tyco Healthcare, MA, USA) posto all'interno di un tubo in polietilene 0,58 mm di diametro (Cat # 427410, Becton Dickinson, MD, USA; Fig. 2). Il tubo in polietilene è inserita 5mm rispetto alla punta di una 29-gauge. L'ago viene utilizzato come una guida rigida per spostare il tubo in polietilene nel condotto della Wharton. Il tubo in polietilene è inserita 3-5 mm all'interno del condotto. Da notare che solo il tubo in polietilene entra nel condotto della ghiandola salivare mentre l'ago rimane al di fuori del condotto. Iniettare 50ul del filtrata 0,4% soluzione trypan blu macchia (Cat # 15250, Gibco, USA) nella ghiandola sottomandibolare tramite il dotto di Wharton, che si trova proprio sotto la lingua. L'infusion viene consegnato costantemente con pressione positiva sul pistone siringa; il dito rimane sul pistone anche dopo tutti l'infusione è stata consegnata alla ghiandola, al fine di evitare un riflusso di infusione intra-orale. La soluzione trypan blu è usato nel video come colorante per dimostrare la tecnica.
- opo l'iniezione della soluzione trypan blu, il mouse è stato l'eutanasia prima dissezione. La ghiandola salivare è esposto chirurgicamente al fine di determinare la quantità delle infusioni hanno effettivamente rimaste nella ghiandola.
2. Rappresentante dei risultati:
Dopo le infusioni sono state iniettate, il mouse è stato sezionato per mostrare chirurgicamente post-cannulata ghiandole salivari. Come mostrato su Immagine-2, la colorazione scura del condotto della Wharton fornisce la prova che la soluzione trypan blu è stato infuso con successo.
Figura 1. Incannulamento della ghiandola sottomandibolare del mouse.
Figura 2. Polietilene tubo è racchiuso attorno alla punta di una 29-gauge. L'ago della siringa è usata come una guida rigida per spostare il tubo in polietilene nel condotto della Wharton. Il tubo in polietilene è inserita (cannulata) 3-5 mm all'interno del condotto. Da notare che solo il tubo in polietilene entra nel condotto della ghiandola salivare mentre l'ago rimane al di fuori del condotto.
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Discussion
Una difficoltà con questo metodo incannulazione è quello di impedire il riflusso della soluzione iniettata. Anche se la soluzione trypan blu ha temporaneamente migrato nella ghiandola salivare con successo, la secrezione della saliva potrebbe interferire con le infusioni e causare riflusso della soluzione trypan blu fuori della ghiandola. Come precauzione, oltre a utilizzare atropina per inibire la secrezione di saliva, la cannula di polietilene dovrebbero rimanere nel canale della Wharton e il pistone della siringa detenuti per 60 secondi dopo le infusioni sono stati depositati. Questo permetterà la maggior parte della soluzione infusa per rimanere all'interno della ghiandola.
Convenzionalmente, l'applicazione sistematica, ovvero l'iniezione per via endovenosa (IV) di farmaci / cellule, è stato usato come un approccio clinico per la rigenerazione delle ghiandole salivari. Infusioni per via endovenosa iniettato viaggerà attraverso il sistema circolatorio, consentendo solo alcuni dei farmaci / cellule di migrare nelle ghiandole bersaglio. Rispetto a questo metodo tradizionale, l'applicazione locale, cioè l'iniezione di droghe / cellule tramite la procedura di incannulazione, può essere percepito come un modo più diretto ed efficace nel far rivivere le funzioni della ghiandola parotide, sottomandibolare e salivare sottolinguale. Quindi, questa tecnica incannulazione può essere usato come un modello affidabile per la medicina rigenerativa delle ghiandole salivari del mouse, e come prospettiva futura, questa procedura può essere un metodo utile per l'applicazione clinica.
Sarebbe un grande piacere per questo visivo-articolo per essere utilizzato come un efficace strumento per studenti e ricercatori che sono interessati a ulteriori studi in medicina rigenerativa delle ghiandole salivari.
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Disclosures
Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato di Animal Care Università ed erano in linea con gli orientamenti del Consiglio canadese di prodotti per animali.
Acknowledgments
Gli autori sono grati al Dott. Ana Cotrim per la consulenza tecnica e al Dott. Monzur Murshed per le attrezzature. Questo lavoro è stato in parte finanziato dal Canadian Institutes per la ricerca medica.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Atropine | Drug | Fluka | 11330 | To inhibit saliva secretion |
| Ketamine | Drug | Phoenix Scientific | Sedation | |
| Xylazine | Drug | Phoenix Scientific | ||
| Polyethylene tubing (0.58 mm diameter) | Tube | Intramedic | 427410 | To insert over tip of needle to avoid tissue injury during insertion into Wharton’s duct. |
| Ultra Comfort Insulin syringe (with a 29G needle) | Syringe | Tyco Healthcare, Covidien | 600145 | |
| 4% trypan blue | Stain | GIBCO, by Life Technologies | 15250 |
References
- Fox, P. C. Acquired salivary dysfunction. Drugs and radiation. Ann N Y Acad Sci. 842, 132-137 (1998).
- Bhide, S. A., Miah, A. B., Harrington, K. J., Newbold, K. L., Nutting, C. M. Radiation-induced xerostomia: pathophysiology, prevention and treatment. Clin Oncol (R Coll Radiol). 21, 737-744 (2009).
- Redman, R. S., Ball, W. D., Mezey, E., Key, S. Dispersed donor salivary gland cells are widely distributed in the recipient gland when infused up the ductal tree. Biotech Histochem. 84, 253-260 (2009).
