Performing Benutzerdefinierte MicroRNA Microarray-Experimenten

Summary

Ein einfaches Verfahren zur Durchführung benutzerdefinierte microRNA Microarray-Experimenten beschrieben. Die Schritte umfassen Isolierung von RNA, die Kennzeichnung RNA und DNA-, Hybridisierung der Proben auf Microarrays, Scannen der Microarrays, Quantifizierung und Analyse Hybridisierungssignale.

Abstract

microRNAs (miRNAs) sind eine große Familie von ~ 22 Nukleotiden (nt) lange RNA-Moleküle, die weit in Eukaryoten ¹ sind ausgedrückt. Komplexer Genome kodieren mindestens Hunderte von miRNAs, die in erster Linie hemmt die Expression einer Vielzahl von Zielgenen posttranskriptional ^{2, 3.} miRNAs Steuerung einer breiten Palette von biologischen Prozessen ^1. Darüber hinaus hat sich verändert miRNA-Expression mit menschlichen Krankheiten wie Krebs in Verbindung gebracht worden, und miRNAs können als Biomarker für Krankheiten und die Prognose ^{4, 5} dienen. Es ist daher wichtig, um die Expression und Funktion von miRNAs unter vielen verschiedenen Bedingungen zu verstehen.

Real-time PCR, Microarray und deep sequencing: Drei große Ansätze zum Profil miRNA-Expression eingesetzt. Die Technik der miRNA-Microarray hat den Vorteil, dass High-Throughput, in der Regel weniger teuer, und die meisten der experimentellen und Analyseschritte können carr werdenin einem molekularbiologischen Labor an den meisten Universitäten, medizinischen Fakultäten und die damit verbundenen Krankenhäusern IED. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Durchführung benutzerdefinierte miRNA Microarray-Experimenten. Ein miRNA-Sonde gesetzt werden auf Glasträger gedruckt werden, um miRNA-Mikroarrays herzustellen. RNA isoliert mit einer Methode oder Reagenz, dass kleine RNA-Spezies konserviert und anschließend mit einem Fluoreszenz-Farbstoff markiert. Als Kontrolle werden Referenz-DNA-Oligonukleotide entsprechend einer Untergruppe von miRNAs auch mit einer anderen Fluoreszenz-Farbstoff markiert. Die Referenz-DNA wird dazu dienen, die Qualität der Folie und Hybridisierung zu demonstrieren und auch für Daten Normalisierung verwendet werden. Die RNA und DNA werden gemischt und hybridisierte mit einer Microarray-Folie mit Sonden für die meisten der miRNAs in der Datenbank. Nach dem Waschen wird die Folie gescannt, um Bilder zu erhalten, und Intensitäten der einzelnen Spots quantifiziert. Diese Roh-Signale werden weiter verarbeitet und analysiert werden, wie der Ausdruck von Daten der entsprechenden miRNAs. MicroArray Folien können entfernt und regeneriert werden, um die Kosten von Microarrays zu reduzieren und die Konsistenz der Microarray-Experimente zu verbessern. Die gleichen Grundsätze und Verfahren sind für andere Arten von benutzerdefinierten Microarray-Experimenten.

Protocol

1. Drucken von benutzerdefinierten miRNA-Mikroarrays

1. Drucken Sie die Microarray-Slides mit Hilfe der Microarray-core facility services an einer Universität oder eines Unternehmens. Die Qualität der Microarray-Herstellung ist einer der wichtigsten Faktoren für den Erfolg eines Mikroarray-Experiment. Probieren Sie ein paar Dienste, wenn möglich. Idealerweise würde man 50-100 Dias zu einem Zeitpunkt, zu drucken und alle Folien werden identisch aussehen, mit gut voneinander getrennt, die einzelnen Spots.
2. Für Microarray-Unterstützung, verwenden wir die GAPS II beschichtete Objektträger.
3. Für miRNA Sonden, verwenden wir die NCode Multi-Species miRNA Microarray Probe Set V2.
4. Lösen Sie alle Oligonukleotide in 3 x SSC bei 10 uM und vierfach drucken sie auf den Folien. Befestigen Sie die Folien durch UV-Bestrahlung nach den Anweisungen für die GAAPS II rutscht. Beschriften Sie die Folie mit einem Diamant-Stift, um die Gegend und die Seite der gedruckten Sonden zu markieren. Lagerung bei 22 ° C.

2. Probenvorbereitung

1. Jede Methodeoder Reagenz kann verwendet werden, um RNA zu isolieren, solange es kleine RNAs bewahrt. Wir verwenden in der Regel Trizol (Invitrogen) zur Gesamt-RNA-Extrakt, mit befriedigender Qualität und Quantität der RNA-Präparationen, wie von A _260nm und _280nm A gemessene.
2. Für die RNA-Kennzeichnung, Mix ~ 25 ug Gesamt-RNA mit 0,5 ug 5'-PCU-DY547-3 ^'6 in 1 x Puffer (50 mM HEPES, pH 7,8, 20 mM MgCl _2, 10 pg / ml BSA, 10% DMSO) mit ~ 20 Einheiten T4-RNA-Ligase 1, mit ~ 10 mM DTT und ~ 0,02-0,03 Endvolumen des 10 x T4-RNA-Ligase 1 Puffer für ATP ergänzt.
3. Lassen Sie die Kennzeichnung auf Eis im Kühlschrank für 2-24 Stunden ablaufen. Niederschlag RNA mit 0,3 M Natriumacetat und 3 Volumen Ethanol. Für eine effiziente Ligation und Niederschlag, löst Gesamt-RNA von über 2 mg / ml, und halten Sie die gesamte Ligation Volumen bei ~ 20 pl.
   1. Wenn weniger RNA ist verfügbar, die Menge der Eingangs-RNA und 5'-PCU-DY547-3 'kann verkleinert werden. </ Li>
   2. Wenn die RNA sehr verdünnt ist, fügen Träger, wie Hefe-tRNA an der Niederschläge zu unterstützen.
4. Kombinieren und Etikett in insgesamt 1 pg von DNA-Oligonukleotiden entspricht einer Teilmenge von Säugetieren miRNAs mit dem Ulysis Alexa Fluor 647 Nucleic Acid Labeling Kit ⁶ als Kontrolle für die Hybridisierung Prozess. Purify der markierten DNA mit einem Centrisep Spalte und speichern in Dunkeln bei -20 ° C.

3. Microarray-Hybridisierung

1. So verwenden Sie die Folien zum ersten Mal, vor hybridisieren die Folien in einer gefilterten Lösung von 3 x SSC, 0,1% SDS, 0,2% BSA für 30-60 min bei 37 ° C. Tauchen sie in Wasser ein paar Mal, dann in Isopropanol. Trocknen Sie die Folien mit einer Zentrifuge mit einem Dia-Adapter bei 100 g für 5 min bei 22 ° C.

Hinweis: Wir verwenden Corning Microarray-Hybridisierung Kammern und Erie Scientific M-Serie von LifterSlips auf Microarray-Hybridisierung durchzuführen.

2. Spülen Sie den lifterslips in Wasser, dann in Ethanol, vor dem Trocknen an der Luft. Setzen Sie ein Bild in einem Microarray-Hybridisierung Kammer Basis und eine lifterslip am oberen Rand der Folie. Die lifterslip deckt die Sonde Bereich, mit seinen weißen Streifen Kontaktierung der Folie.
3. In den dunklen, Spin-down der ausgefallene, markierte RNA. Waschen Sie es einmal mit 70% Ethanol, und an der Luft trocknen des Pellets. Das Pellet sollte rötlich.
4. Bereiten Sie eine Hybridisierungslösung mit 400 mM Na ₂ HPO _4, pH 7,0, 0,8% BSA, 5% SDS, 12% Formamid ⁶ mit 1/15-1/100 ul des gereinigten, markierten Referenz-DNA (2,4) pro RNA-Probe. Die Menge der zugesetzten Referenz-DNA hängt von vielen verschiedenen Oligonukleotiden gekennzeichnet sind (2,4). Wenn es mehr als 100 sind, dann weniger Verdünnung erforderlich.
5. Lösen Sie das RNA-Pellet gut mit ~ 60 ul der Hybridisierungslösung.
6. Fügen Sie 20 ul Wasser zu jedem der Befeuchtung Brunnen in der Corning Microarray-Hybridisierung Kammer Basis.
7. Add ter Mischung aus markierter RNA und DNA-auf die Folie. Verwenden Sie einen dünnen Pipettenspitze, sanft berühren den Rand des lifterslip und lassen Sie die Lösung, um den Raum zwischen den lifterslip und schieben durch Saugen geben.
8. Legen Sie die Hybridisierung Kammer über die Basis abdecken und versiegeln Sie die Kammer mit Metallklammern.
9. Legen Sie die ganze Kammer in der Tüte, die mit der Kammer Kassette aus Corning kommt.
10. Legen Sie die Kassette Kammer (n) in einen Behälter mit benetzten Papiertuch; Abdeckung der Behälter mit Plastikfolie und legen Sie sie in einem 37 ° C feucht, Zellkulturbrutschrank für ~ 24 Stunden. Diese Vorsichtsmaßnahmen (3,6, 3,9, 3,10) sicherzustellen, dass die Hybridisierungslösung nicht austrocknet während der Inkubation.

4. Post-Hybridisierung Verarbeitung

1. Demontieren der Kammer Kassetten eins nach dem anderen. Tauchen Sie ein Dia und seine lifterslip in 2 x SSC bei 22 ° C. Die lifterslip natürlich fallen die Folie. Legen Sie es in 0,8 x SSC. Waschendie Folien in 0,8 x SSC zweimal, dann dreimal in 0,4 x SSC, 1-2 min insgesamt. Trocknen Sie die Folien mit einer Zentrifuge mit einem Dia-Adapter. Waschen Sie die LifterSlips mit Wasser und sparen für die Wiederverwendung später.
2. Scannen Sie die Folien mit einem geeigneten Scanner, z. B. der Perkin Elmer ScanArray 5000 oder Molecular Devices Axon GenePix 4000B Mikroarray-Scanner. Scan bei Wellenlängen nahe 547 nm und 647 nm zu den entsprechenden Bild-Dateien zu erhalten.
3. Verwenden Sie Programme wie BlueFuse zu Pixelintensitäten in der Eingabe-, Bild-Dateien von 4,2) zu quantifizieren. Überprüfen Sie die einzelnen Spots mit dem Programm auf ungewöhnliche Flecken auf der Microarrays von der weiteren Betrachtung ausschließen. Diese abnormen Stellen entstehen in der Regel aus armen slide Druck oder Dia-Handling nach der Hybridisierung.
4. Verwenden Sie Programme wie GeneSpring und Excel für die Datenanalyse und-präsentation. Allgemeine Überlegungen für Microarray-Daten Normalisierung gelten, die über den Rahmen dieses Papiers.
5. Nach zufriedenstellenden Signale af erhaltenter 4,3), Streifen der Microarray-Slides zur Wiederverwendung ^7. Spülen Sie die Folien in Wasser, dann tauchen in vorgewärmten, 1 mM NaOH und 0,1 x SSC in einer Färbung Schale bei 62 ° C für 10-20 Minuten. Wiederholen Sie die Inkubationszeit einmal. Waschen Sie die Slides ein paar Mal im Wasser für bis zu 60 Minuten unter leichtem Schütteln bei 22 ° C. Trocknen Sie die Folien mit einer Zentrifuge, und speichern Sie bei 22 ° C.
6. Zur Verwendung des regenerierten gleitet, ist es nicht notwendig, vor hybridisieren sie wieder. Einfach waschen Sie sie in Wasser durch Isopropanol folgte, und trocknen Sie die Dias rechts vor der Hybridisierung.

5. Repräsentative Ergebnisse:

Wir haben vor allem die beschriebenen Verfahren gefolgt, um globale miRNA-Expression in Tausenden von Proben-Profil, dh RNAs vom Zebrafisch auf den menschlichen Proben isoliert unter vielen verschiedenen Bedingungen. Abbildung 1 zeigt das gescannte Bild eines Mikroarrays, sehr präzise und starke Hybridisierungssignale auf den Beweis gleiten. Die Pearson correlatiauf Koeffizienten zwischen technischen Replikate von Microarray-Hybridisierung sind ~ 0,99 ⁷ zeigt eine hervorragende Reproduzierbarkeit.

Abbildung 1 Composite Bild einer gescannten miRNA Microarray-Rutsche nach der Hybridisierung. Rote Flecken resultierte aus Hybridisierungen von der Referenz-DNA, grünen Flecken aus dem DY547-markierte RNA-Probe, während die gelben Flecken wurden von Hybridisierungen sowohl von der DNA und RNA, die gleichen Sonden.

Discussion

Trotz der jüngsten Fortschritte in der Deep-Sequencing-Technologien, bleibt Microarray eine gute Wahl für High-Throughput-Analyse von DNA und RNA. Im Vergleich zum tiefen Sequenzierung sind Microarray-Experimenten billiger, und ein typischer Molekularbiologie-Labor können die meisten der Experimente und Datenanalyse in-Haus, das für Flexibilität erlaubt und spart Zeit durchzuführen. In der Zukunft, Microarrays wahrscheinlich gut geeignet, um intensiv zu befragen Gruppen von Genen, z. B. sind, können alle oder eine Teilmenge der Transkriptionsfaktoren in einem Genom oder miRNAs und den gleichen Grundsätzen und Verfahren präsentiert hier in benutzerdefinierte Microarray-Experimenten verwendet werden, um studieren Genfamilien neben miRNAs. Natürlich ist ein großer Nachteil zu Microarrays, die Sequenz-Informationen müssen vorhanden sein a priori. Dies ist kein Problem für die meisten Protein-Gen Familien in Modell-Organismen, obwohl, wie viele miRNA Gene bleiben unklar. Die Sonde haben wir verwendet haben wurde auf der Grundlage miRBase ⁸ ausgebildet 9, 10, ist es offensichtlich, dass das häufigste und am meisten biologisch relevanten Säugetier-miRNAs bereits von dieser Sonde gesetzt abgedeckt.

Es gibt keine großen technischen Herausforderungen, um benutzerdefinierte Microarray-Experimente durchzuführen. Basierend auf unserer Erfahrung sind die Schlüssel zum Erfolg eines Mikroarray-Experiment: 1) gut gedruckt Dias, 2) zu erhalten, um RNA von guter Qualität vorzubereiten und in ausreichender Menge, und 3) richtig waschen die Folien nach der Hybridisierung. Trizolreagenz typischerweise Erträge ausreichende Mengen an intakter RNA für spätere Studien. Dennoch variiert miRNA-Expression zwischen den verschiedenen Geweben und Zelllinien. Unter den meisten Bedingungen sollte 20-25 g Gesamt-RNA geben ausreichend starke Microarray-Signale, wenn durch die Ligation Methode bezeichnet. Weniger RNA ist für miRNA-reichen Proben wie Hirnregionen und Neuronen benötigt. Wenn nur 1-5 ug Gesamt-RNA oder weniger vorhanden ist, andere Kennzeichnung Methodes kann verwendet werden, zB RNA Labeling Kits von Invitrogen, und sie sind kompatibel mit den benutzerdefinierten Microarray-Plattform beschrieben. Für die besten Vergleiche sollte man immer Etikett mindestens ein Replikat aller Steuer-und experimentellen Proben gleichzeitig und hybridisieren sie den gleichen Druck Charge von Objektträgern in einem einzigen Experiment. Dieses Vorgehen minimiert den Beitrag zur Differential-Microarray-Signale entsprechend den Veränderungen in der Stichprobe Kennzeichnung und Verarbeitung und in Dia-Qualität. Die Referenz-DNA (in roter Kanal) dient als Kontrolle für die Qualität der Folie, Hybridisierung und Waschen. Eine erfolgreiche Hybridisierung gibt saubere und starke Signale in rot. Wenn DNA-Signale sind gut, aber RNA-Signale werden nicht, dann sollte man problemlos schießen die Schritte der RNA-Isolierung und Kennzeichnung. Zum Beispiel ist die RNA haben das Verhältnis A _260nm / A _280nm zwischen 1,9 und 2,1? Ist das Pellet rötlich in 3.3?

Die meisten Investitionenfür Microarrays kann für Dia-Drucken und Scannen werden. Ein Mikroarray-Drucker und ein Scanner sind oft von der Core Facility an vielen Universitäten und medizinische Schulen ausgestattet. Printing-Microarrays in der Masse und die Wiederverwendung von Dias und LifterSlips wird deutlich verringern die Kosten. Die Wiederverwendung von Folien hat den zusätzlichen Vorteil der Verbesserung der Konsistenz des Microarray-Versuche ^7. Wir haben wieder rutscht mehr als sechs Mal und fand die Qualität der Daten immer noch zufriedenstellend. Um eine optimale Empfindlichkeit für die kostbarsten Proben oder Proben mit minimalem Input RNAs, jedoch ist es immer noch ratsam, mit frischen Schlitten ^7.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NCode Multi-Species miRNA Microarray Probe Set V2	Invitrogen	MIRMPS201	Designed based on the miRBase Release 9.0 (October 2006). It contains ˜ 1,140 unmodified, 34-44 nt long oligonucleotides as probes for worm, fly, zebrafish, mouse, rat, and human miRNAs, and a number of internal control probes such as snoRNAs. The miRNA probes are doublets of the sequences complementary to mature miRNAs, hence the size of ˜ 44 nt. For analysis one can focus on miRNAs from a particular genome(s) of interest.
Trizol	Invitrogen	15596018	We have also used enriched, small RNA fraction for labeling, although total RNA samples are faster and easier to prepare and to quantify and suitable for downstream applications such as mRNA analysis.
T4 RNA Ligase 1	New England Biolabs	M0204L
Ulysis Alexa Fluor 647 Nucleic Acid Labeling Kit	Invitrogen	U21660	This kit or similar products can be used to label experimental RNA samples or a control RNA (instead of control DNA) as well.
5’-pCU-DY547-3’	Dharmacon	Custom made	Small RNA fraction can be similarly labeled by ligation.
CentriSep columns	Princeton Separations	CS-901
GAPSII coated slide	Corning	40004	Other types of slides may be also used.
Microarray hybridization chambers	Corning	2551 or 40080	Other kinds of hybridization chambers and coverslips should also work. Using commercially available hybridization machines can reduce hybridization time significantly, e.g., to ˜ 2 hours.
Lifterslips	Thermo Fisher Scientific, Inc.	25X60I-M5439-001-LS
BlueFuse	BlueGenome
GeneSpring	Agilent Technologies