A realização de experimentos de Microarray personalizado MicroRNA

Summary

Um procedimento simples de realizar experimentos de microarray personalizado microRNA é descrito. As etapas incluem isolar RNA, rotulagem RNA e DNA de referência, hibridação as amostras para microarrays, a digitalização da microarrays, quantificar e analisar os sinais de hibridização.

Abstract

microRNAs (miRNAs) são uma grande família de ~ 22 nucleotídeos (nt) longas moléculas de RNA, que são amplamente expressos em eucariotos ^1. Genomas complexos codificam pelo menos centenas de miRNAs, que principalmente inibir a expressão de um vasto número de genes-alvo pós-transcricionalmente ^{2, 3.} miRNAs controlam uma ampla gama de processos biológicos ^1. Além disso, a expressão de miRNA alterados tem sido associado com doenças humanas como câncer e miRNAs podem servir como biomarcadores para doenças e prognóstico ^{4, 5.} É importante, portanto, entender a expressão de miRNAs e funções sob diversas condições.

Três abordagens principais têm sido empregadas para expressão perfil de miRNA: real-time PCR, microarranjos, seqüenciamento e profunda. A técnica de microarray miRNA tem a vantagem de ser de alto rendimento, geralmente menos caro, ea maioria das etapas experimentais e análise pode ser carried em um laboratório de biologia molecular na maioria das universidades, as escolas médicas e hospitais associados. Aqui, nós descrevemos um método para a realização de experimentos de microarray miRNA personalizado. Um conjunto de sonda de miRNA serão impressas em lâminas de vidro para produzir microarrays miRNA. RNA é isolado usando um método ou reagente que preserva espécies de pequenos RNA, e então marcadas com um corante fluorescente. Como controle, oligonucleotídeos referência DNA correspondente a um subconjunto de miRNAs também estão marcadas com um corante fluorescente diferente. O DNA de referência servirá para demonstrar a qualidade do slide e hibridação e também será utilizado para a normalização de dados. O RNA e DNA são misturados e hibridizado com uma lâmina de microarray contendo sondas para a maioria dos miRNAs na base de dados. Após a lavagem, o slide é digitalizada para obter imagens e intensidades dos pontos individuais quantificadas. Esses sinais-prima será processada e analisada como os dados da expressão do miRNAs correspondente. Microaslides rray pode ser descascado e regenerado para reduzir o custo de microarrays e para reforçar a coerência das experiências microarray. Os mesmos princípios e procedimentos são aplicáveis ​​a outros tipos de experimentos de microarray personalizado.

Protocol

1. Impressão de microarrays miRNA personalizado

1. Imprimir o microarray slides usando o microarray serviços instalação do núcleo de uma universidade ou uma empresa. A qualidade de microarray de fabricação é um dos fatores mais críticos para o sucesso de um experimento de microarray. Tente alguns serviços, se possível. Idealmente, seria imprimir 5-10 slides de cada vez, e todos os slides parecem idênticos, com bem separados, os pontos individuais.
2. Para suporte microarray, usamos as lâminas GAPS II revestido.
3. Para sondas de miRNA, usamos o nCode Multi-Species miRNA Microarray Probe Set V2.
4. Dissolver todos os oligonucleotídeos em 3 x SSC, 10 mM e quadruply imprimi-los nos slides. Corrigir os slides por irradiação ultravioleta acordo com as instruções para os slides GAAP II. Deslize o rótulo com uma caneta de diamante para marcar a área e laterais com as pontas de prova impressa. Loja em 22 ° C.

2. Preparação de amostras

1. Qualquer métodoou reagente pode ser usado para isolar RNA, enquanto preserva pequenos RNAs. Geralmente usamos Trizol (Invitrogen) para extrair RNA total, com quantidade satisfatória e qualidade das preparações de RNA, medido por A _260nm e A _280nm leituras.
2. RNA para rotulagem, mix ~ 25 mg de RNA total com 0,5 mg de 5'-PCU-DY547-3 ^'6 em 1 x tampão (50 mM HEPES, pH 7.8, 20 mM MgCl _2, 10 mg / ml BSA, 10% DMSO), contendo ~ 20 unidades T4 RNA Ligase 1, suplementado com 10 mM DTT ~ e volume ~ 0,02-0,03 final do T4 10 x RNA Ligase um buffer para ATP.
3. Permitir a rotulagem para prosseguir no gelo dentro de uma geladeira por 2-24 horas. RNA precipitado com acetato de sódio 0,3 M e 3 volumes de etanol. Para ligação eficiente e precipitação, dissolver RNA total em mais de 2 mg / ml, e manter o volume total de ligadura em ~ 20 mL.
   1. Se RNA menos está disponível, a quantidade de entrada de RNA e 5'-PCU-DY547-3 'pode ser reduzida. </ Li>
   2. Se o RNA é muito diluída, adicione portador tal como o tRNA de levedura para ajudar na precipitação.
4. Combinar e rótulo em mg um total de oligonucleotídeos de referência DNA correspondente a um subconjunto de miRNAs em mamíferos usando o Ulysis Alexa Fluor 647 Kit Rotulagem de Ácido Nucleico ⁶ como um controle para o processo de hibridização. Purificar o DNA rotulados com uma coluna CentriSep e salvar no escuro a -20 ° C.

3. Hibridação de microarrays

1. Para utilizar os slides, pela primeira vez, pré-hibridizar os slides em uma solução filtrada de 3 x SSC, 0,1% SDS, BSA 0,2% por 30-60 min a 37 ° C. Submergir em água algumas vezes, então, em isopropanol. Secar as lâminas usando uma centrífuga com um adaptador de slide de 100 g por 5 min a 22 ° C.

Nota: Nós usamos câmaras Corning hibridização microarray e mSeries Erie Científico de Lifterslips para realizar a hibridação microarray.

2. Lavar o lifterslips em água, em seguida, em etanol, antes da secagem ao ar. Coloque um slide dentro de uma base da câmara de hibridização de microarrays, e um lifterslip em cima do slide. O lifterslip vai cobrir a área da sonda, com o seu contato com a tiras brancas slide.
3. No escuro, girar o precipitado, RNA marcados. Lavá-lo uma vez com etanol 70%, eo ar seco do sedimento. O pellet deve ser avermelhada.
4. Prepare uma solução de hibridização contendo 400 mM Na ₂ HPO ₄ pH 7,0, 0,8% BSA, 5% SDS, 12% formamida ⁶ com 1/15-1/100 mL do purificado, rotulados de referência DNA (2,4) por amostra de RNA. A quantidade de DNA de referência adicionada depende de quantos diferentes oligonucleotídeos são rotulados (2.4). Se houver mais de 100, em seguida, menos de diluição é necessária.
5. Dissolver o sedimento RNA bem com ~ 60 mL da solução de hibridização.
6. Adicionar 20 l de água para cada um dos poços de umidificação na base da câmara Corning microarray de hibridização.
7. Adicionar tele mistura de RNA e DNA rotulados de referência para o slide. Use a ponta da pipeta fina, suave toque na borda da lifterslip, e permitir que a solução para entrar no espaço entre o lifterslip e deslize através de sucção.
8. Coloque a câmara de hibridação tampa sobre a base, em seguida, selar a câmara com clipes de metal.
9. Coloque toda a câmara dentro do saco plástico que vem com a cassete da câmara de Corning.
10. Coloque a cassete da câmara (s) dentro de um recipiente com papel toalha molhada; cobrir o recipiente com filme plástico e coloque-o dentro de um 37 ° C úmido, cultura de células incubadora para ~ 24 horas. Estas precauções (3.6, 3.9, 3.10) garantir que a solução de hibridização não seca durante a incubação.

4. Pós-processamento de hibridização

1. Desmonte a câmara de cassetes, um por um. Slides submergir e na sua lifterslip em 2 x SSC a 22 ° C. O lifterslip caberá naturalmente fora do slide. Coloque-o em 0,8 x SSC. Lavaros slides em 0,8 x SSC duas, três vezes em 0,4 x SSC, 1-2 min no total. Secar as lâminas usando uma centrífuga com um adaptador de slide. Lave o lifterslips com água e guarde para reutilização posterior.
2. Digitalizar os slides com qualquer scanner apropriado, por exemplo, a Perkin Elmer 5000 ou ScanArray Molecular Devices Axon GenePix 4000B scanner microarray. Varredura em comprimentos de onda próximo a 547 nm e 647 nm para obter os arquivos de imagem correspondente.
3. Use programas como o BlueFuse para quantificar intensidade dos pixels na entrada, arquivos de imagem de 4.2). Inspecionar os pontos individuais com o programa para excluir manchas anormais na microarrays de análise mais aprofundada. Essas manchas anormais geralmente surgem a partir de impressão de slides pobres ou deslize após a manipulação de hibridização.
4. Utilizar programas como Excel e GeneSpring para análise de dados e apresentação. Considerações gerais para normalização de dados microarray aplicar, o que está além do escopo deste artigo.
5. Uma vez que os sinais satisfatórios são obtidos after 4.3), tira as lâminas de microarrays para reutilização ^7. Enxágüe as lâminas em água, em seguida, mergulhar na pré-aquecido, 1 mM NaOH e 0,1 x SSC em um prato de coloração a 62 ° C por 10-20 minutos. Repita a incubação uma vez. Lave o C. slides algumas vezes em água por até 60 minutos com agitação suave a 22 ° Secar as lâminas usando uma centrífuga, e armazenar a 22 ° C.
6. Para utilizar os slides regenerados, não é necessário pré-hibridizar-los novamente. Basta lavá-los em água seguido de isopropanol, seco e as lâminas direita antes de hibridização.

5. Resultados representativos:

Temos em grande parte seguido os procedimentos descritos para perfil de expressão de miRNA mundial em milhares de amostras, ou seja, RNAs isolados de zebrafish a espécime humana sob diversas condições. A Figura 1 mostra uma imagem digitalizada de um microarray de demonstrar sinais de hibridação muito precisa e forte na slide. O Relacionados Pearsonsobre os coeficientes técnicos entre réplicas de hibridização de microarrays são ~ 0.99 ^7, indicando excelente reprodutibilidade.

Figura 1 Imagem composta de uma lâmina de microarray miRNA digitalizados após hibridização. Manchas vermelhas resultou de hibridizações pelo DNA de referência, pontos verdes a partir da amostra de RNA DY547-rotulados, enquanto as manchas amarelas eram de hibridizações por ambos DNA e RNA para as mesmas sondas.

Discussion

Apesar dos avanços recentes nas tecnologias de seqüenciamento de profundidade, microarray continua a ser uma opção viável para high-throughput análise de DNA e RNA. Comparado ao seqüenciamento de profundidade, as experiências microarray são mais baratos, e um laboratório de biologia molecular típico pode executar a maioria dos experimentos e análise de dados in-house, o que permite flexibilidade e economiza tempo. No futuro, é provável microarrays adequado para interrogar intensamente conjuntos de genes, por exemplo, todos ou um subconjunto dos fatores de transcrição em um genoma ou miRNAs, e os mesmos princípios e procedimentos aqui apresentados podem ser usados ​​em experimentos de microarray personalizado para estudo famílias de genes além miRNAs. É claro, uma grande desvantagem sobre microarrays é que a informação deve estar disponível seqüência a priori. Este não é um problema para a maioria das famílias de proteínas gene em organismos-modelo, embora o número de genes miRNA há permanecem obscuros. O conjunto de sonda que temos vindo a utilizar foi projetado com base em miRBase ⁸ 9, 10, é evidente que o miRNAs mais abundante e mais biologicamente relevantes mamíferos estão abrangidos por este conjunto de sonda.

Não há grandes desafios técnicos para realizar experimentos de microarray personalizado. Com base em nossa experiência, as chaves para o sucesso de um experimento de microarray são: 1) para obter bem-impresso slides, 2) para preparar RNA de boa qualidade e em quantidade suficiente, e 3) adequadamente lavar os slides após a hibridização. Reagente Trizol normalmente produz quantidades suficientes de RNA intacto para estudos posteriores. No entanto, a expressão de miRNA varia entre os diferentes tecidos e linhas celulares. Na maioria das condições, 20-25 mg de RNA total deve dar sinais de microarray suficientemente forte quando rotulados pelo método de ligadura. Menos RNA é necessário para amostras de miRNA-ricos, como regiões do cérebro e neurônios. Se apenas 1-5 mg de RNA total ou menos disponível, o método de rotulagem outross pode ser usado, por exemplo, kits de RNA a partir de rotulagem Invitrogen, e eles são compatíveis com a plataforma de microarray personalizados descritos aqui. Para obter os melhores comparações, deve-se sempre pelo menos um rótulo de replicar todo o controle e experimental amostras simultaneamente e hibridizar-los para o lote mesma impressão de slides em um único experimento. Este projeto de pesquisa irá minimizar a contribuição para sinais diferenciais microarray resultantes das variações na rotulagem de amostras e processamento e na qualidade de slides. O DNA de referência (em vermelho canal) serve como um controle para a qualidade de slide, hibridação e lavagem. A hibridação bem sucedida dará sinais limpos e fortes em vermelho. Se os sinais de DNA são bons, mas não são sinais de RNA, então deve-se problemas para disparar os passos de RNA isolamento e rotulagem. Por exemplo, o RNA tem a relação de A _260nm / A _280nm entre 1,9 e 2,1? Avermelhada é o pellet em 3,3?

Maior parte dos investimentosde microarrays pode ser para a impressão e digitalização de slides. Uma impressora e um scanner microarray são freqüentemente equipados pela instalação do núcleo em muitas universidades e escolas médicas. Microarrays de impressão em slides granel e reutilização e lifterslips irá reduzir significativamente o custo. Slides reutilização tem a vantagem adicional de melhorar a consistência das experiências microarray ^7. Temos reutilizado slides mais de seis vezes e encontrou a qualidade dos dados ainda satisfatório. Para garantir a melhor sensibilidade para as amostras mais precioso ou amostras com RNAs de entrada mínima, no entanto, ainda é prudente utilizar slides fresco ^7.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NCode Multi-Species miRNA Microarray Probe Set V2	Invitrogen	MIRMPS201	Designed based on the miRBase Release 9.0 (October 2006). It contains ˜ 1,140 unmodified, 34-44 nt long oligonucleotides as probes for worm, fly, zebrafish, mouse, rat, and human miRNAs, and a number of internal control probes such as snoRNAs. The miRNA probes are doublets of the sequences complementary to mature miRNAs, hence the size of ˜ 44 nt. For analysis one can focus on miRNAs from a particular genome(s) of interest.
Trizol	Invitrogen	15596018	We have also used enriched, small RNA fraction for labeling, although total RNA samples are faster and easier to prepare and to quantify and suitable for downstream applications such as mRNA analysis.
T4 RNA Ligase 1	New England Biolabs	M0204L
Ulysis Alexa Fluor 647 Nucleic Acid Labeling Kit	Invitrogen	U21660	This kit or similar products can be used to label experimental RNA samples or a control RNA (instead of control DNA) as well.
5’-pCU-DY547-3’	Dharmacon	Custom made	Small RNA fraction can be similarly labeled by ligation.
CentriSep columns	Princeton Separations	CS-901
GAPSII coated slide	Corning	40004	Other types of slides may be also used.
Microarray hybridization chambers	Corning	2551 or 40080	Other kinds of hybridization chambers and coverslips should also work. Using commercially available hybridization machines can reduce hybridization time significantly, e.g., to ˜ 2 hours.
Lifterslips	Thermo Fisher Scientific, Inc.	25X60I-M5439-001-LS
BlueFuse	BlueGenome
GeneSpring	Agilent Technologies