Выполнение пользовательских Эксперименты Microarray микроРНК

Summary

Простая процедура выполнения пользовательских экспериментов микрочипов микроРНК описывается. Шаги включают в себя выделения РНК, РНК и маркировки ссылкой ДНК гибридизации образцы микрочипов, сканирования микрочипов, количественной оценки и анализа гибридизации сигналов.

Abstract

микроРНК (миРНК) являются большой семье ~ 22 нуклеотидов (нт) длинные молекулы РНК, которые широко выражено у эукариот ^1. Комплекс генома кодируют по меньшей мере сотни микроРНК, которые в первую очередь ингибирует экспрессию большого числа генов-мишеней после транскрипционно ^{2, 3.} микроРНК контроль широкий спектр биологических процессов ^1. Кроме того, изменения выражения микроРНК была связана с человеческими болезнями, такими как рак, и микро-РНК могут служить в качестве биомаркеров заболеваний и прогноз ^{4, 5.} Важно, таким образом, чтобы понять выражения и функции микроРНК под различными условиями.

Три основные подходы были использованы в профиль микроРНК выражение: ПЦР в реальном времени, микрочипов, и глубокие секвенирования. Техника микроРНК микрочипов имеет преимущество в том, высокую пропускную способность, как правило, менее дорогие, и большинство экспериментальных и анализ шаги могут быть Каррсамодельное взрывное устройство в лаборатории молекулярной биологии в большинстве университетов, медицинских школ и связанные с ними больницы. Здесь мы опишем метод для выполнения пользовательских экспериментов микрочипов микроРНК. Набор микроРНК зонд будет напечатан на предметные стекла для производства микрочипов микроРНК. РНК выделяли с использованием метода или реагент, который сохраняет мелкие виды РНК, а затем помечены флуоресцентным красителем. В качестве контроля ссылкой ДНК олигонуклеотидов соответствующее подмножество микроРНК также помечены различными флуоресценции красителя. Ссылка ДНК будет служить, чтобы продемонстрировать качество слайдов и гибридизации, а также будут использованы для нормализации данных. РНК и ДНК смешивают и гибридизации с микрочипов слайд, содержащий зонды для большинства из микроРНК в базе данных. После мытья слайд сканируется для получения изображения, и интенсивности отдельных пятен количественно. Эти сигналы сырья будут дополнительно обработаны и проанализированы как выражение данные соответствующего микроРНК. МкАrray слайды могут быть удалены и регенерируется снизить стоимость микрочипов и повысить согласованность микрочипов экспериментов. Те же самые принципы и процедуры применимы к другим типам пользовательских экспериментов микрочипов.

Protocol

1. Печать пользовательских микрочипов микроРНК

1. Печать микрочипов слайды использованием микрочипов основные услуги объекте в университете или компании. Качество изготовления микрочипов является одним из важнейших факторов для успеха эксперимента микрочипов. Попробуйте несколько услуг, если это возможно. В идеале следовало бы напечатать 50-100 слайдов за раз, и все слайды будут выглядеть одинаково, с хорошо разделены, отдельные пятна.
2. Для поддержки микрочипов, мы используем ПРОБЕЛЫ II покрытием слайды.
3. Для микроРНК зондов, мы используем NCode нескольких видов микроРНК Microarray Зонд Установить V2.
4. Растворите все олигонуклеотидов в 3 х SSC при 10 мкМ и четырежды распечатать их на слайдах. Fix слайды ультрафиолетового облучения в соответствии с инструкциями для GAAPS слайды II. Этикетка слайд с пером алмаз, чтобы отметить области, и на стороне печатной зондов. Хранить при температуре 22 ° C.

2. Пробоподготовка

1. Любой методили реагент может быть использован для выделения РНК тех пор, пока она сохраняет малых РНК. Мы обычно используем Trizol (Invitrogen) для извлечения полной РНК, с удовлетворительными количество и качество препаратов РНК, если судить по _260nm и _{280 нм} чтениях.
2. Для РНК маркировки, смешайте ~ 25 мкг общей РНК с 0,5 мкг 5'-PCU-DY547-3 ^"6 в 1 х буфера (50 мМ HEPES, рН 7,8, 20 мМ MgCl _2, 10 мкг / мл BSA, 10% ДМСО), содержащий ~ 20 единиц Т4 РНК-лигазы 1, дополненные ~ 10 мМ DTT и ~ 0,02-0,03 конечного объема 10 х Т4 РНК-лигазы 1 буфер для АТФ.
3. Разрешить маркировки действовать на лед в холодильнике в течение 2-24 часов. Осадок РНК с 0,3 М ацетата натрия и 3 объема этанола. Для эффективного лигирования и осадков, растворяются в общей РНК более 2 мг / мл, и сохранить общий объем лигирования при ~ 20 мкл.
   1. Если меньше РНК имеется, количество входных РНК и 5'-PCU-DY547-3 "может быть сокращена. </ LI>
   2. Если РНК очень разбавленных, добавить носитель, такой как дрожжевой тРНК, чтобы помочь в осадках.
4. Комбинат и этикетки в общей сложности 1 мкг ДНК ссылкой олигонуклеотидов соответствующие подмножества млекопитающих микроРНК использованием Ulysis Alexa Fluor 647 нуклеиновых кислот Kit Маркировка ^6, как управление для гибридизации процесса. Purify меченых ДНК с использованием CentriSep колонки и сохранить в темноте при температуре -20 ° С.

3. Microarray гибридизации

1. Чтобы использовать слайды в первый раз, предварительно гибридизации слайды в отфильтрованный раствор 3 х SSC, 0,1% SDS, 0,2% BSA в течение 30-60 минут при температуре 37 ° C. Погрузите их в воду несколько раз, то в изопропанола. Сухой слайды использованием центрифуги с слайд адаптера на 100 г в течение 5 мин при 22 ° C.

Примечание: Мы используем Corning микрочипов гибридизации камер и mSeries Эри Научно о Lifterslips выполнять микрочипов гибридизации.

2. Промыть лиfterslips в воде, затем в этаноле, перед сушкой на воздухе. Место слайд внутри камеры базы гибридизация микрочипов, и lifterslip в верхней части слайда. Lifterslip покроет площадь зонда, с белыми полосами связавшись слайда.
3. В темные, спина вниз осаждаются, меченой РНК. Вымойте это когда-то с 70% этанола, и воздух сухой осадок. Гранулы должны быть красноватые.
4. Подготовка гибридизации раствора, содержащего 400 мМ Na ₂ HPO ₄ рН 7,0, 0,8% BSA, 5% SDS, 12% формамида ⁶ с 1/15-1/100 мкл очищенной, обозначенные ссылкой ДНК (2,4) на пробу РНК. Количество добавленного ссылкой ДНК зависит от того, сколько различных олигонуклеотидов помечены (2,4). Если Есть более чем 100, то меньше разбавления не требуется.
5. Растворите гранулы РНК хорошо с ~ 60 мкл гибридизации решение.
6. Добавьте 20 мкл воды к каждому из увлажнение скважин в гибридизации Corning база камеры микрочипов.
7. Добавить тОн смесь меченых РНК и ДНК ссылкой на слайд. Использование тонкого кончика пипетки, аккуратно прикоснуться к краю lifterslip, и позволяют решение войти в пространство между lifterslip и слайд через всасывания.
8. Место гибридизации камеры крышку над базой, то уплотнение камеры с металлическими зажимами.
9. Положите все камеры внутри пластиковый пакет, который поставляется с камерой кассету из Corning.
10. Место камеры кассету (ы) внутри контейнера с смачивается бумажным полотенцем; крышка контейнера с полиэтиленовой пленкой и поместите его в 37 ° C влажной, культура клеток инкубаторе в течение ~ 24 часов. Эти меры предосторожности (3.6, 3.9, 3.10) обеспечить, чтобы гибридизация решение не высыхает во время инкубации.

4. После гибридизации обработки

1. Разберите камеру кассет по одному. Погрузите слайд и его lifterslip в 2-х SSC при 22 ° C. Lifterslip естественно падать слайда. Поместите его в 0,8 х SSC. Мытьслайды в 0,8 х SSC два раза, затем три раза в 0,4 х SSC, 1-2 мин в общей сложности. Сухой слайды использованием центрифуги с слайд адаптером. Вымойте lifterslips с водой и сохранить для повторного использования в последующем.
2. Сканирование слайдов с любым подходящим сканером, например, Perkin Elmer ScanArray 5000 или Molecular Devices Axon GenePix 4000B микрочипов сканера. Проверка при длинах волн, близких к 547 нм и 647 нм для получения соответствующих файлов изображений.
3. Использование таких программ, как BlueFuse количественно интенсивности пикселов на входе, файлы изображений из 4.2). Осмотрите отдельных пятен с программой, чтобы исключить ненормальных пятен на микрочипы из дальнейшего рассмотрения. Эти аномальные пятна обычно возникают из бедных печать слайдов или слайд-обработки после гибридизации.
4. Использование таких программ, как GeneSpring и Excel для анализа данных и представления данных. Общие соображения для нормализации микрочипов данные относятся, которая выходит за рамки данной статьи.
5. После удовлетворительного сигналы получаются афтер 4,3), стрип-микрочипов слайды для повторного использования ^7. Промыть слайды в воде, затем погрузите в подогретого, 1 мМ NaOH и 0,1 х SSC в сосуд для окрашивания на 62 ° С в течение 10-20 минут. Повторите инкубации один раз. Вымойте слайды несколько раз в воде в течение до 60 минут с осторожном встряхивании при 22 ° C. Сухой слайды использованием центрифуг, и храните при температуре 22 ° C.
6. Для использования регенерированного слайды, не стоит предварительно скрещивать их снова. Просто промыть их в воде следует изопропанол, и сухие слайды прямо перед гибридизации.

5. Представитель Результаты:

У нас в основном соответствует описанной процедуры в профиль глобальной выражение микроРНК в тысячах образцов, т. е. РНК изолирован от данио рерио, чтобы человеческий образец под различными условиями. На рисунке 1 показано отсканированное изображение микрочипов, чтобы продемонстрировать очень точные и сильные сигналы гибридизации на слайда. Пирсон correlatiо коэффициентах между техническими повторов микрочипов гибридизации ~ 0,99 ^7, что указывает на отличную воспроизводимость.

Рисунок 1 композитный образ отсканированного слайда микрочипов микроРНК после гибридизации. Красные пятна в результате гибридизации ссылкой ДНК, зеленые пятна от DY547 меченных образцов РНК, в то время как желтые пятна были от гибридизации как ДНК и РНК, к тому же зондов.

Discussion

Несмотря на последние достижения в области технологий глубокой последовательности, микрочипов остается жизнеспособным выбором для высокопроизводительного анализа ДНК и РНК. По сравнению с глубоким последовательности, микрочипов эксперименты дешевле, а типичные лаборатории молекулярной биологии могут выполнять большинство экспериментов и анализа данных в доме, который обеспечивает гибкость и экономит время. В будущем, микрочипы, вероятно, хорошо подходит для интенсивно допрашивать набора генов, например, все или часть факторов транскрипции в геном или микроРНК, и те же принципы и процедуры, представленные здесь, могут быть использованы в пользовательских экспериментов микрочипов для изучения семейств генов помимо микроРНК. Конечно, главный недостаток микрочипов о том, что последовательность информация должна быть доступна априори. Это не проблема для большинства белков семейств генов в модельных организмах, хотя, сколько генов микроРНК Есть остаются неясными. Зонд набор мы используем был разработан на основе miRBase ⁸ 9, 10, очевидно, что наиболее распространенным и наиболее биологически значимых млекопитающих микроРНК уже охвачены этим зондом множество.

Есть никаких серьезных технических проблем, чтобы выполнить собственную экспериментов микрочипов. Основываясь на нашем опыте, ключи к успеху эксперимента микрочипов являются: 1) для получения хорошо печатных слайды, 2) для подготовки РНК хорошего качества и в достаточном количестве, и 3) правильно мыть слайдов после гибридизации. Trizol реагент обычно дает достаточное количество нетронутой РНК для последующих исследований. Тем не менее, выражение микроРНК варьирует среди различных тканях и клеточных линиях. В большинстве случаев, 20-25 мкг общей РНК должна дать достаточно сильные сигналы микрочипов, когда помечены перевязки метод. Менее РНК, необходимых для микроРНК богатых образцов, таких как участки мозга и нейронов. Если бы только 1-5 мкг общей РНК или менее доступна, другой метод маркировкиы могут быть использованы, например, РНК маркировки комплектов Invitrogen, и они совместимы с пользовательской платформы микрочипов описано здесь. Для лучшего сравнения, нужно всегда этикетке по крайней мере одну репликацию всех контрольных и экспериментальных образцов одновременно и скрещивать их к той же партии печать слайдов в одном эксперименте. Это исследование дизайна позволит свести к минимуму вклад в дифференциальное микрочипов сигналы в результате изменения маркировки образцов и обработку и в слайд-качество. Ссылка ДНК (в красном канале) служит для управления качеством слайд, гибридизация и стирки. Успешная гибридизация даст чистые и сильные сигналы в красный цвет. Если ДНК сигналы хорошие, но РНК сигналов нет, то следует беда-снимай шаги РНК изоляции и маркировки. Например, имеет ли РНК соотношение _260nm / _{280 нм} между 1,9 и 2,1? Есть красноватые гранулы в 3,3?

Большинство инвестицийдля микрочипов может быть для печати и сканирования слайдов. Принтер микрочипов и сканеров часто оснащены основной объект во многих университетах и ​​медицинских школах. Печать микрочипов в натуральном и повторного использования слайдов и lifterslips позволит значительно снизить стоимость. Повторное использование слайдов имеет дополнительное преимущество, повышения согласованности экспериментов микрочипов ^7. Мы повторно использовали слайды более чем в шесть раз и нашел качество данных до сих пор удовлетворительно. Для обеспечения лучшей чувствительности для самых ценных образцов или образцов с минимальным РНК входе, тем не менее, он по-прежнему разумно использовать свежие слайды ^7.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NCode Multi-Species miRNA Microarray Probe Set V2	Invitrogen	MIRMPS201	Designed based on the miRBase Release 9.0 (October 2006). It contains ˜ 1,140 unmodified, 34-44 nt long oligonucleotides as probes for worm, fly, zebrafish, mouse, rat, and human miRNAs, and a number of internal control probes such as snoRNAs. The miRNA probes are doublets of the sequences complementary to mature miRNAs, hence the size of ˜ 44 nt. For analysis one can focus on miRNAs from a particular genome(s) of interest.
Trizol	Invitrogen	15596018	We have also used enriched, small RNA fraction for labeling, although total RNA samples are faster and easier to prepare and to quantify and suitable for downstream applications such as mRNA analysis.
T4 RNA Ligase 1	New England Biolabs	M0204L
Ulysis Alexa Fluor 647 Nucleic Acid Labeling Kit	Invitrogen	U21660	This kit or similar products can be used to label experimental RNA samples or a control RNA (instead of control DNA) as well.
5’-pCU-DY547-3’	Dharmacon	Custom made	Small RNA fraction can be similarly labeled by ligation.
CentriSep columns	Princeton Separations	CS-901
GAPSII coated slide	Corning	40004	Other types of slides may be also used.
Microarray hybridization chambers	Corning	2551 or 40080	Other kinds of hybridization chambers and coverslips should also work. Using commercially available hybridization machines can reduce hybridization time significantly, e.g., to ˜ 2 hours.
Lifterslips	Thermo Fisher Scientific, Inc.	25X60I-M5439-001-LS
BlueFuse	BlueGenome
GeneSpring	Agilent Technologies