Summary
कस्टम microRNA माइक्रोएरे प्रयोगों प्रदर्शन करने का एक सरल प्रक्रिया में वर्णित है. चरणों में शामिल अलग शाही सेना, लेबलिंग शाही सेना और संदर्भ डीएनए, प्रोटीन के लिए नमूने hybridizing, प्रोटीन स्कैनिंग, बढ़ाता और संकरण संकेतों का विश्लेषण.
Protocol
1. कस्टम miRNA प्रोटीन का मुद्रण
- प्रिंट माइक्रोएरे एक विश्वविद्यालय या एक कंपनी में माइक्रोएरे कोर सुविधा सेवाओं का उपयोग कर स्लाइड. माइक्रोएरे निर्माण की गुणवत्ता एक माइक्रोएरे प्रयोग की सफलता के लिए सबसे महत्वपूर्ण कारकों में से एक है. यदि संभव हो तो कुछ सेवाओं की कोशिश करो. आदर्श रूप में, एक समय में एक 50-100 स्लाइड्स मुद्रित, और सभी स्लाइड्स के समान दिखेगा अच्छी तरह से अलग है, व्यक्तिगत स्थानों के साथ.
- माइक्रोएरे समर्थन के लिए, हम अंतराल द्वितीय लेपित स्लाइड्स का उपयोग करें.
- MiRNA जांच के लिए, हम का उपयोग NCode - मल्टी प्रजाति miRNA माइक्रोएरे जांच V2 सेट.
- 10 सुक्ष्ममापी पर 3 एक्स एसएससी में सभी oligonucleotides भंग और चौगुना उन्हें स्लाइड्स पर मुद्रित. पराबैंगनी विकिरण द्वारा स्लाइड्स GAAPS द्वितीय स्लाइड्स के लिए निर्देशों के अनुसार ठीक है. एक हीरे और मुद्रित जांच के साथ क्षेत्र की ओर मार्क पेन लेबल के साथ स्लाइड. पर में 22 स्टोर डिग्री सेल्सियस
2. नमूना तैयार
- कोई भी तरीकाया अभिकर्मक शाही सेना को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में लंबे समय के रूप में यह छोटे RNAs को बरकरार रखता है. हम आम तौर पर कुल शाही सेना संतोषजनक मात्रा और शाही सेना की तैयारी की गुणवत्ता, के रूप में एक 260nm और 280nm रीडिंग द्वारा मापा के साथ निकालने Trizol (Invitrogen ) का उपयोग.
- शाही सेना लेबलिंग, 5'-PCU-DY547 3 'x 1 बफर (50 मिमी HEPES, 7.8 पीएच, 20 मिमी 2 MgCl, 10 μg / मिलीलीटर BSA, 10% में 6 0.5 μg के साथ मिश्रण ~ कुल शाही सेना के 25 μg DMSO) युक्त ~ 20 इकाइयों टी -4 शाही सेना एक ligase, ~ 10 मिमी और डीटीटी ~ 0.02-0.03 x 10 टी -4 एटीपी के लिए शाही सेना ligase एक बफर के अंतिम मात्रा के साथ पूरक.
- 2-24 घंटे के लिए रेफ्रिजरेटर के अंदर बर्फ पर आगे बढ़ने की लेबलिंग की अनुमति दें. 0.3 एम सोडियम एसीटेट और इथेनॉल के 3 संस्करणों के साथ शाही सेना वेग. कुशल ligation और वर्षा के लिए, अधिक मिलीग्राम / एमएल 2 कुल शाही सेना को भंग करने, और ~ 20 μl पर कुल ligation मात्रा रखना.
- अगर कम आरएनए उपलब्ध है, <इनपुट शाही सेना और 5'-PCU-DY547 3 'नीचे पहुंचा जा सकता है की राशि./ Li>
- यदि शाही सेना बहुत कमजोर है, खमीर को tRNA वर्षण में सहायता के रूप में इस तरह के वाहक जोड़ें.
- मिश्रण है और स्तनधारी Ulysis Alexa Fluor 647 संकरण प्रक्रिया के लिए एक नियंत्रण के रूप में न्यूक्लिक एसिड लेबल 6 किट का उपयोग miRNAs की एक सबसेट के लिए इसी संदर्भ डीएनए oligonucleotides के कुल 1 μg में लेबल. लेबल डीएनए एक CentriSep स्तंभ का उपयोग कर शुद्ध और -20 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में बचा
3. माइक्रोएरे संकरण
- पहली बार के लिए स्लाइड्स का उपयोग करने के लिए, 3 एक्स एसएससी, 0.1% एसडीएस, 30-60 मिनट के लिए 0.2% BSA फ़िल्टर समाधान में 37 स्लाइड्स पूर्व संकरण डिग्री सेल्सियस उन्हें कुछ समय के पानी में, तो isopropanol में डूब. 5 मिनट के लिए 100 ग्राम पर एक स्लाइड 22 ° एडाप्टर सी. के साथ एक अपकेंद्रित्र का उपयोग स्लाइड्स ड्राई
नोट: हम Corning माइक्रोएरे संकरण कक्षों और Lifterslips के Erie वैज्ञानिक mSeries उपयोग माइक्रोएरे संकरण करने के लिए.
- ली कुल्लापानी में हवा में सुखाने से पहले तो इथेनॉल में, fterslips. एक माइक्रोएरे संकरण चैम्बर आधार अंदर एक स्लाइड है, और स्लाइड के शीर्ष पर एक lifterslip रखें. lifterslip अपनी सफेद स्लाइड संपर्क स्ट्रिप्स के साथ जांच के क्षेत्र को कवर किया जाएगा.
- अंधेरे में उपजी नीचे स्पिन, लेबल शाही सेना. यह 70% इथेनॉल के साथ एक बार, धो और हवा गोली सूखी. गोली लाल होना चाहिए.
- एक संकरण 400 मिमी ना दो HPO 4 पीएच 7.0, 0.8% BSA, 5% एसडीएस, शुद्ध के 1/15-1/100 μl साथ 12% 6 formamide, शाही सेना के प्रति नमूना लेबल संदर्भ डीएनए (2.4) युक्त समाधान तैयार है. जोड़ा संदर्भ डीएनए की राशि कितने अलग oligonucleotides (2.4) में चिह्नित कर रहे हैं पर निर्भर करता है. अगर वहाँ 100 से अधिक कर रहे हैं, तो कम कमजोर पड़ने की जरूरत है.
- शाही सेना गोली ~ संकरण समाधान के 60 μl के साथ अच्छी तरह से भंग है.
- Corning माइक्रोएरे संकरण चैम्बर आधार में humidifying कुओं में से प्रत्येक के लिए पानी की 20 μl जोड़ें.
- टी जोड़ेंवह लेबल शाही सेना स्लाइड और संदर्भ डीएनए के मिश्रण. एक पतली pipet टिप का उपयोग करें, धीरे lifterslip के किनारे का स्पर्श, और समाधान lifterslip और चूषण के माध्यम से स्लाइड के बीच अंतरिक्ष में प्रवेश करने की अनुमति है.
- संकरण कक्ष निकालें आधार पर कवर, तो धातु क्लिप के साथ चैम्बर सील.
- प्लास्टिक बैग के अंदर पूरे चैम्बर कि Corning से चैम्बर कैसेट के साथ आता है रखो.
- गीला कागज तौलिया के साथ एक कंटेनर के अंदर कक्ष कैसेट (ओं) प्लेस, कंटेनर प्लास्टिक की चादर के साथ कवर और 37 एक के अंदर जगह ° सी नम, सेल संस्कृति इन्क्यूबेटर ~ 24 घंटे के लिए. इन सावधानियों (3.6, 3.9, 3.10) सुनिश्चित करें कि संकरण समाधान ऊष्मायन के दौरान बाहर सूखा नहीं है.
4. डाक - संकरण प्रसंस्करण
- कक्ष एक के बाद एक कैसेट जुदा. डूब एक और स्लाइड 2 एक्स एसएससी में अपने lifterslip 22 डिग्री सेल्सियस lifterslip स्वाभाविक रूप से बंद स्लाइड गिर जाएगी. यह 0.8 एक्स एसएससी में रखें. धोना0.8 x एसएससी में दो बार तब, स्लाइड 0.4 x एसएससी, कुल में 1-2 मिनट में तीन बार. एक स्लाइड अनुकूलक के साथ एक अपकेंद्रित्र का उपयोग कर स्लाइड्स सूखी. पानी के साथ lifterslips धोने और पुनः उपयोग के लिए बचाने के बाद.
- किसी भी उपयुक्त स्कैनर, उदाहरण के लिए, Perkin एल्मर ScanArray 5000 या आण्विक उपकरणों Axon GenePix 4000B माइक्रोएरे स्कैनर के साथ स्लाइड्स स्कैन करें. करीब 547 एनएम के तरंग दैर्ध्य 647 एनएम पर स्कैन करने के लिए इसी छवि फ़ाइलों को प्राप्त करने के.
- इनपुट, 4.2 से छवि फ़ाइलें) में पिक्सेल तीव्रता यों BlueFuse के रूप में इस तरह के कार्यक्रमों का उपयोग करें. कार्यक्रम के साथ अलग - अलग स्थानों के लिए आगे विचार से प्रोटीन पर असामान्य स्थानों को बाहर का निरीक्षण किया. इन असामान्य स्पॉट आमतौर पर गरीब स्लाइड मुद्रण या स्लाइड के संकरण के बाद से निपटने से उत्पन्न होती हैं.
- डेटा विश्लेषण और प्रस्तुति के लिए GeneSpring और एक्सेल जैसे कार्यक्रमों का उपयोग करें. माइक्रोएरे डेटा सामान्यीकरण के लिए सामान्य विचार को लागू करने के लिए, जो इस पत्र के दायरे से परे है.
- एक बार संतोषजनक संकेतों वायुसेना प्राप्त कर रहे हैं4.3 आतंकवाद), 7 पुनः प्रयोग के लिए माइक्रोएरे स्लाइड पट्टी. पानी में स्लाइड्स कुल्ला, तो 10-20 मिनट के लिए पूर्व गर्म, 1 मिमी NaOH और 0.1 x एसएससी एक धुंधला डिश में 62 ° C में विसर्जित. ऊष्मायन एक बार दोहराएँ. कोमल झटकों के साथ 60 मिनट के लिए पानी में कुछ समय 22 ° स्लाइड सी. धो एक अपकेंद्रित्र का उपयोग स्लाइड, और 22 पर दुकान डिग्री सेल्सियस ड्राई
- पुनर्जीवित स्लाइड्स का उपयोग करने के लिए, यह आवश्यक नहीं है उन्हें फिर से पूर्व संकरण. बस उन्हें isopropanol द्वारा पीछा पानी में धो लें, और संकरण से पहले सही स्लाइड्स सूखी.
5. प्रतिनिधि परिणाम:
हम मोटे तौर पर वर्णित प्रक्रियाओं का पालन किया है नमूनों की हजारों की संख्या में वैश्विक miRNA अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल, यानी, मानव नमूना zebrafish से कई अलग अलग परिस्थितियों में अलग RNAs. चित्रा 1 एक माइक्रोएरे की स्कैन की गई छवि पर बहुत ही सटीक और मजबूत संकरण संकेतों का प्रदर्शन दिखाता है स्लाइड. Pearson के correlatiतकनीकी के बीच गुणांक पर माइक्रोएरे संकरण के replicates 0.99 ~ 7, उत्कृष्ट reproducibility का संकेत कर रहे हैं.
चित्रा 1 संकरण के बाद एक स्कैन miRNA माइक्रोएरे स्लाइड के समग्र छवि. लाल धब्बे संदर्भ डीएनए, DY547 लेबल आरएनए नमूना से हरी धब्बे, hybridizations से हुई जबकि hybridizations से दोनों डीएनए और आरएनए के द्वारा एक ही जांच करने के लिए पीले धब्बे थे.
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Discussion
गहरी अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों में हाल के अग्रिमों के बावजूद, माइक्रोएरे डीएनए और आरएनए के उच्च throughput विश्लेषण के लिए एक व्यवहार्य विकल्प रहता है. गहरी अनुक्रमण की तुलना में, माइक्रोएरे प्रयोगों सस्ता कर रहे हैं, और एक विशिष्ट आणविक जीव विज्ञान प्रयोगशाला प्रयोगों और डेटा विश्लेषण घर में, जो लचीलेपन के लिए अनुमति देता है और समय बचाता है की सबसे प्रदर्शन कर सकते हैं. भविष्य में, प्रोटीन की संभावना अच्छी तरह से अनुकूल अधिकता जीन, उदाहरण के सेट पूछताछ कर रहे हैं, सभी या एक जीनोम या miRNAs में प्रतिलेखन कारकों की एक सबसेट है, और एक ही सिद्धांतों और प्रक्रियाओं यहाँ प्रस्तुत कस्टम माइक्रोएरे प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है अध्ययन करने के लिए miRNAs अलावा जीन परिवारों. बेशक, प्रोटीन के बारे में एक बड़ी खामी है कि अनुक्रम जानकारी प्राथमिकताओं उपलब्ध होना चाहिए . यह मॉडल जीवों में सबसे अधिक प्रोटीन जीन परिवारों के लिए एक समस्या नहीं है, हालांकि कितने miRNA जीन अस्पष्ट रहते हैं. हम का उपयोग किया गया है जांच सेट 8 miRBase के आधार पर डिजाइन किया गया था 9 अध्ययन, 10 से, यह स्पष्ट है कि सबसे प्रचुर मात्रा में है और सबसे biologically प्रासंगिक स्तनधारी miRNAs पहले से ही इस जांच सेट द्वारा कवर कर रहे हैं.
कस्टम माइक्रोएरे प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए कोई बड़ी तकनीकी चुनौतियों का सामना कर रहे हैं. हमारे अनुभव के आधार पर, एक माइक्रोएरे प्रयोग की सफलता के लिए कुंजी हैं: 1) अच्छी तरह से मुद्रित स्लाइड्स, 2) प्राप्त करने के लिए अच्छी गुणवत्ता की शाही सेना और पर्याप्त मात्रा में तैयार करने के लिए, और 3) ठीक से संकरण के बाद स्लाइड्स धोने. Trizol अभिकर्मक आमतौर पर बाद में अध्ययन के लिए बरकरार शाही सेना के लिए पर्याप्त मात्रा में पैदावार. बहरहाल, miRNA अभिव्यक्ति विभिन्न ऊतकों और सेल लाइनों के बीच बदलता है. सबसे शर्तों के तहत, कुल शाही सेना के 20-25 μg पर्याप्त मजबूत माइक्रोएरे संकेत दे जब ligation विधि द्वारा लेबल किया जाना चाहिए. कम शाही सेना miRNA - अमीर मस्तिष्क क्षेत्रों और न्यूरॉन्स के रूप में इस तरह के नमूने के लिए आवश्यक है. यदि कुल शाही सेना या उससे कम के केवल 1-5 μg उपलब्ध है, अन्य लेबलिंग विधि हैएस, इस्तेमाल किया जा सकता है उदाहरण के लिए, शाही सेना Invitrogen से लेबलिंग किट, और वे कस्टम माइक्रोएरे मंच यहाँ वर्णित के साथ संगत कर रहे हैं. तुलना के लिए सबसे अच्छा है, हमेशा कम से कम एक को दोहराने के सभी नियंत्रण और प्रयोगात्मक नमूने के साथ - साथ लेबल करना चाहिए और उन्हें एक ही प्रयोग में स्लाइड्स की एक ही प्रिंट बैच संकरण. यह अनुसंधान, डिजाइन अंतर माइक्रोएरे नमूना लेबलिंग और प्रोसेसिंग में और स्लाइड गुणवत्ता में बदलाव से परिणामस्वरूप संकेतों के योगदान को कम कर देंगे. संदर्भ डीएनए (लाल चैनल में) स्लाइड, संकरण और कपड़े धोने की गुणवत्ता के लिए एक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है. लाल रंग में एक सफल संकरण स्वच्छ और मजबूत संकेत दे देंगे. यदि डीएनए संकेतों अच्छा कर रहे हैं, लेकिन शाही सेना संकेतों नहीं हैं, तो एक शाही सेना अलगाव और लेबलिंग के इस कदम मुसीबत शूट करना चाहिए. उदाहरण के लिए, शाही सेना ए / 1.9 और 2.1 के बीच एक 280nm 260nm के अनुपात है? गोली लाल 3.3 में है?
निवेश का अधिकांशस्लाइड मुद्रण और स्कैनिंग के लिए प्रोटीन के लिए किया जा सकता है. एक माइक्रोएरे प्रिंटर और एक स्कैनर अक्सर कई विश्वविद्यालयों और मेडिकल स्कूलों में कोर सुविधा से लैस कर रहे हैं. थोक और reusing स्लाइड्स और lifterslips में मुद्रण प्रोटीन काफी लागत कम हो जाएगा. पुनर्प्रयोग स्लाइड्स माइक्रोएरे 7 प्रयोगों की स्थिरता में सुधार के अतिरिक्त लाभ है . हम स्लाइड्स अधिक से अधिक छह बार reused किया है और डेटा की गुणवत्ता अभी भी संतोषजनक पाया. न्यूनतम इनपुट RNAs के साथ सबसे कीमती नमूने या नमूने के लिए सबसे अच्छा संवेदनशीलता को सुनिश्चित करने के लिए, तथापि, यह अभी भी है समझदारी ताजा स्लाइड्स 7 का उपयोग करें.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
काम के हिस्से में नशीली दवाओं के सेवन केंद्र के राष्ट्रीय संस्थान (P50 011806 डीए) और संयुक्त राज्य अमेरिका सेना के रक्षा विभाग (W81XWH-07-1-0183) द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NCode Multi-Species miRNA Microarray Probe Set V2 | Invitrogen | MIRMPS201 | Designed based on the miRBase Release 9.0 (October 2006). It contains ˜ 1,140 unmodified, 34-44 nt long oligonucleotides as probes for worm, fly, zebrafish, mouse, rat, and human miRNAs, and a number of internal control probes such as snoRNAs. The miRNA probes are doublets of the sequences complementary to mature miRNAs, hence the size of ˜ 44 nt. For analysis one can focus on miRNAs from a particular genome(s) of interest. |
| Trizol | Invitrogen | 15596018 | We have also used enriched, small RNA fraction for labeling, although total RNA samples are faster and easier to prepare and to quantify and suitable for downstream applications such as mRNA analysis. |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs | M0204L | |
| Ulysis Alexa Fluor 647 Nucleic Acid Labeling Kit | Invitrogen | U21660 | This kit or similar products can be used to label experimental RNA samples or a control RNA (instead of control DNA) as well. |
| 5’-pCU-DY547-3’ | Dharmacon | Custom made | Small RNA fraction can be similarly labeled by ligation. |
| CentriSep columns | Princeton Separations | CS-901 | |
| GAPSII coated slide | Corning | 40004 | Other types of slides may be also used. |
| Microarray hybridization chambers | Corning | 2551 or 40080 | Other kinds of hybridization chambers and coverslips should also work. Using commercially available hybridization machines can reduce hybridization time significantly, e.g., to ˜ 2 hours. |
| Lifterslips | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 25X60I-M5439-001-LS | |
| BlueFuse | BlueGenome | ||
| GeneSpring | Agilent Technologies |
References
- Ambros, V.
- Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19, 92-105 (2009).
- Chekulaeva, M., Filipowicz, W. Mechanisms of miRNA-mediated post-transcriptional regulation in animal cells. Curr. Opin. Cell Biol. 21, 452-460 (2009).
- Farazi, T. A., Spitzer, J. I., Morozov, P., Tuschl, T.
- Small, E. M., Olson, E. N. Pervasive roles of microRNAs in cardiovascular biology. Nature. 469, 336-342 (2011).
- Thomson, J. M., Parker, J., Perou, C. M., Hammond, S. M. A custom microarray platform for analysis of microRNA gene expression. Nat. Methods. 1, 47-53 (2004).
- Zhang, X., Xu, W., Tan, J., Zeng, Y. Stripping custom microRNA microarrays and the lessons learned about probe:slide interactions. Anal. Biochem. 386, 222-227 (2009).
- Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucl. Acids. Res. 36, D154-D158 (2008).
- Landgraf, P. A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing. Cell. 129, 1401-1414 (2007).
- Chiang, H. R. Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes. Genes. Dev. 24, 992-1009 (2010).
