Summary
사용자 정의 microRNA의 microarray 실험을 수행 간단한 절차 설명합니다. 단계, RNA, RNA 라벨링 및 참조 DNA를 분리 microarrays에 샘플을 hybridizing, microarrays를 검색, quantifying 및 하이브리드화 신호를 분석 등이 있습니다.
Abstract
microRNAs는 (miRNAs) 널리 eukaryotes 1 표현됩니다 ~ 22 세포핵 (NT) 긴 RNA 분자의 큰 가족입니다. 복잡한 genomes는 주로 사후 transcriptionally 대상 유전자 2, 3의 방대한 숫자의 표현을 억제 miRNAs 중 적어도 수백, 인코딩. miRNAs는 생물 학적 과정 1 광범위한 제어합니다. 또한, 변경 miRNA 발현이 같은 암 등 인간의 질병와 관련된되었으며, miRNAs는 질병 및 예후 (豫后) 4, 5에 대한 생체 역할을 수 있습니다. 그것은 표현과 여러 가지 조건에서 miRNAs의 기능을 이해하기 위해, 따라서, 중요합니다.
실시간 PCR, microarray, 깊이 시퀀싱 : 세 가지 주요 방법은 프로필 miRNA 발현에 고용되었습니다. miRNA의 microarray의 기술은 일반적으로 저렴 높은 처리량되는 장점을 가지고 있으며, 실험 및 분석 단계의 대부분은 카 수 있습니다대부분의 대학, 의과 대학 및 관련 병원에서 분자 생물학 연구실에서 지휘를 맡는. 여기, 우리는 사용자 정의 miRNA의 microarray 실험을 수행하는 방법을 설명합니다. miRNA 프로브 세트는 miRNA의 microarrays를 만들어 유리 슬라이드에 인쇄됩니다. RNA는 작은 RNA 수종을 보존하는 방법이나 시약을 사용하여 절연하고 형광 염료와 함께 표시됩니다. 컨트롤로서, miRNAs의 하위 집합에 해당 참조의 DNA oligonucleotides는 다른 형광 염료로 분류됩니다. 참조 DNA는 슬라이드와 하이브 리다이 제이션의 품질을 증명하기 위해 제공되며, 또한 데이터 정규화에 사용됩니다. RNA와 DNA가 혼합하여 데이터베이스에있는 miRNAs 대부분의 프로브를 포함하는 microarray 슬라이드에 hybridized입니다. 세탁 후, 슬라이드 이미지를 얻기 위해 스캔하고, 개별 명소의 농도는 계량입니다. 이러한 원시 신호는 추가로 처리하고 해당 miRNAs의 표현 데이터로 분석됩니다. Microarray 슬라이드는 옷을 벗긴 채 microarrays의 비용을 절감하고 microarray 실험의 일관성을 향상시키기 위해 생성하실 수 있습니다. 동일한 원칙과 절차를 정의 microarray 실험의 다른 유형에 적용됩니다.
Protocol
1. 사용자 정의 miRNA의 microarrays의 인쇄
- microarray는 대학이나 회사에서 microarray 핵심 시설 서비스를 이용 슬라이드 인쇄합니다. microarray 제조의 품질은 microarray 실험의 성공을 위해 가장 중요한 요소 중 하나입니다. 가능하면 몇 가지 서비스를보십시오. 이상적으로, 하나는 한 번에 50-100 슬라이드를 인쇄 것이며, 모든 슬라이드가 잘 구분하여, 각각의 장소와 동일 보입니다.
- microarray 지원, 우리는 격차 II 코팅 슬라이드를 사용합니다.
- miRNA 프로브 위해, 우리는 NCode 멀티 종 (species)이 Microarray 프로브가 V2 세트 miRNA 사용합니다.
- 10 μm의 3 X SSC에있는 모든 oligonucleotides를 해산하고 quadruply 슬라이드 그들을 인쇄할 수 있습니다. GAAPS II 슬라이드에 대한 지침에 따라 자외선 조사에 의해 슬라이드를 수정. 인쇄 프로브와 함께 지역과 측면을 표시하는 다이아몬드 펜으로 슬라이드 레이블. 22 스토어 ° C.
2. 샘플 준비
- 모든 방법또는 시약이 한 그것이 작은 RNAs를 유지로 RNA를 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 일반적으로 260nm와 280nm 판독하여 측정 RNA의 준비 만족 수량 및 품질과 함께, 총 RNA를 추출하기 위해 Trizol (Invitrogen)을 사용합니다.
- RNA 라벨, 1 X 버퍼 (50 MM의 HEPES, pH를 7.8, 20 MM MgCl 2, 10 μg / ML BSA, 10 % 5' - pCU - DY547 - 3 '6 0.5 μg과 함께 총 RNA의 믹스 ~ 25 μg을 위해 DMSO) 포함 ~ 20 대 T4 RNA ~ 10 밀리미터 DTT와 ATP에 대한 10 X T4 RNA Ligase 한 버퍼의 ~ 0.02-0.03 최종 볼륨 보충 Ligase 1.
- 2-24시간의 냉장고 안에 얼음 진행 라벨 수 있습니다. 0.3 M의 아세트산 나트륨과 에탄올 3 권와 RNA를 침전. 효율적인 결합과 강수량 들어, 이상이 MG / ML에서 총 RNA를 해산하고, ~ 20 μl의 총 내고 볼륨을 유지.
- 적은 RNA를 사용할 경우, 입력 RNA 및 5'가 - pCU - DY547 - 3 '는 크기를 줄일 수 있습니다의 금액입니다. </ 리>
- RNA가 매우 묽은 경우, 강수량을 도울 효모 tRNA 등 통신 사업자를 추가합니다.
- Ulysis 알렉사 형석 하이브 리다이 제이션 프로세스 제어로 647 핵산 라벨링 키트 6을 사용 포유 동물 miRNAs의 하위 집합에 해당 참조의 DNA oligonucleotides 총 1 μg의 결합 및 레이블. CentriSep 칼럼을 사용하여 표시된 DNA를 정화하고 -20 ° C.에 어두운에 저장
3. Microarray의 하이브 리다이 제이션
- 처음으로 슬라이드를 사용하려면, 37 3 X SSC, 0.1 % SDS, 30-60 분 0.2 % BSA의 필터링 솔루션에 슬라이드를 미리 잡종 ° C. 잠수함 물이 몇 번에서 다음 이소프로판올에. 22 5 분 100g에서 슬라이드 어댑터 ° C.있는 원심 분리기를 사용하여 슬라이드를 건조
참고 : 우리는 microarray의 하이브 리다이 제이션을 수행하기 위해 코닝 microarray의 하이브 리다이 제이션 챔버와 Lifterslips의 에리 과학의 mSeries을 사용합니다.
- 리 씻어공기 건조하기 전에 물에 fterslips 다음 에탄올로. microarray의 하이브 리다이 제이션 챔버 기지 내부에 슬라이드와 슬라이드의 위에 lifterslip 놓으십시오. lifterslip은 슬라이드 연락은 흰색 스트립과 탐사 영역을 커버합니다.
- 어둠 속에서, 레이블 RNA를 시켰던을 돌린다. 70 % 에탄올로 한 번 씻고, 그리고 공기는 펠렛을 건조. 펠렛은 붉은해야합니다.
- 400 MM 나 2 HPO 4 산도 7.0, 0.8 % BSA 5 % SDS, 정화의 1/15-1/100 μl와 12 % 포름 아미드 6, RNA 샘플마다 라벨 참조 DNA (2.4)이있는 하이브 리다이 제이션 솔루션을 준비합니다. 추가 참조 DNA의 양은 다른 oligonucleotides는 (2.4) 얼마나 많은 레이블 아르에 따라 달라집니다. 100 개 이상있다면 덜 희석이 필요합니다.
- 하이브 리다이 제이션 솔루션 ~ 60 μl로 잘 RNA 펠렛를 해산.
- 코닝 microarray의 하이브 리다이 제이션 챔버 자료의 가습 우물의 물을 각각 20 μl를 추가합니다.
- t 추가슬라이드에 표시 RNA 및 참고 DNA의 그 혼합물. 얇은 pipet 팁을 사용하여 부드럽게 lifterslip의 가장자리를 터치하고, 솔루션은 흡입을 통해 lifterslip 및 슬라이드 사이의 공간을 입력할 수 있습니다.
- 하이브 리다이 제이션 챔버가베이스 커버를 통해 장소, 그때 금속 클립과 챔버를 봉인.
- 코닝에서 챔버 카세트와 함께 제공되는 비닐 봉투 안에 전체 챔버 놔.
- 침수 종이 타월로 용기 내부 챔버 카세트 (들)을 장소, 플라스틱 포장과 용기를 커버하고 37 안에 자리 ° ~ 24 시간 동안 C 습기, 휴대 문화 인큐베이터. 이러한주의 사항 (3.6, 3.9, 3.10)은 하이브 리다이 제이션 솔루션이 부화하는 동안 밖으로 건조하지 않도록.
4. 포스트 하이브 리다이 제이션 처리
- 챔버 카세트를 하나씩 분해. 22 2 X SSC에 잠수함 슬라이드와 lifterslip ° C. lifterslip 자연 슬라이드 떨어질 것입니다. 0.8 X SSC에 놓으십시오. 빨래두 번, 그리고 0.8 X SSC에있는 슬라이드 0.4 X SSC, 총 1-2 분 안에 세 번. 슬라이드 어댑터와 원심 분리기를 사용하여 슬라이드를 건조시킵니다. 물로 lifterslips을 씻고 나중에 다시 사용하기 위해 저장할 수 있습니다.
- 모든 적합한 스캐너, 예를 들어, Perkin 엘머 ScanArray 5000 또는 분자 장치 축삭 GenePix 4000B microarray 스캐너와 슬라이드를 검사합니다. 해당 이미지 파일을 얻기 위해 파장 547 nm의 가까이에와 647 nm의에서 스캔.
- 입력, 4.2에서 이미지 파일)에서 픽셀 농도를 정할 같은 BlueFuse 같은 프로그램을 사용합니다. 추가 고려 대상에서 microarrays에 대한 비정상적인 명소를 제외하는 프로그램을 각각의 장소를 검사합니다. 이러한 비정상적인 명소는 일반적으로 가난한 슬라이드 인쇄하거나 슬라이드 하이브 리다이 제이션 후 처리에서 발생.
- 데이터 분석 및 프레 젠 테이션 등 GeneSpring 및 Excel과 같은 프로그램을 사용합니다. microarray 데이터 정상화를위한 일반적인 고려 사항은이 문서의 범위를 넘어있는, 적용됩니다.
- 일단 만족스러운 신호는 AF를 얻을 수 있습니다ter 4.3), 재사용 7 microarray 슬라이드를 스트립. 10~20분를위한 62의 얼룩 접시에 미리 예열, 1 ㎜ NaOH 및 0.1 X SSC ° C에서 다음 젖어, 물속에 슬라이드를 씻어. 일단 부화를 반복합니다. 22까지 부드럽게 흔들어 60 분 동안 물에 몇 번 슬라이드 ° C. 씻으십시오 원심 분리기를 사용하여 슬라이드, 22에서 저장 ° C. 건조
- 재생 슬라이드를 사용하려면, 다시 그들을 미리 잡종 필요가 없습니다. 간단히 이소프로판올 다음 물 속에 그들을 씻고, 바로 하이브 리다이 제이션 전에 슬라이드를 건조.
5. 대표 결과 :
우리는 대부분 샘플 수천 글로벌 miRNA 발현을 프로필에 설명된 절차를 따라했습니다 즉, 여러 조건 하에서 인간의 표본으로 zebrafish에서 격리 RNAs가. 그림 1은 매우 정확하고 강력한 하이브 리다이 제이션 신호를 증명하기 위해 microarray의 스캔 이미지를 보여줍니다 슬라이드. 피어슨 correlati기술 사이의 계수에 대한 microarray의 하이브 리다이 제이션의 복제 우수한 재현성을 나타내는 ~ 0.99 7, 수 있습니다.
하이브 리다이 제이션 후 스캔 miRNA의 microarray 슬라이드 1 복합 이미지를 그림. 노란색 반점이 동일한 프로브에 DNA와 RNA 모두에 의해 hybridizations에서 동안 레드 명소 참조 DNA, DY547 - 라벨 RNA 샘플에서 녹색 관광 명소로 hybridizations에서 결과.
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Discussion
깊은 시퀀싱 기술의 최근 발전에도 불구하고, microarray는 DNA와 RNA의 높은 처리량 분석을위한 가능한 선택 남아있다. 깊은 시퀀싱에 비해 microarray 실험은 저렴하고 있으며, 전형적인 분자 생물학 연구소의 실험과 유연성을 허용하고 시간을 절약할 수 데이터 분석 사내의 대부분을 수행할 수 있습니다. 앞으로, microarrays 가능성이 적합 집중적으로 유전자, 예를 들어 세트를 심문하러 있으며, 전부 또는 게놈 또는 miRNAs의 전사 요소의 일부와 같은 원칙과 여기에 제시 절차는 공부를 지정 microarray 실험에서 사용할 수 있습니다 miRNAs 이외에도 유전자 가족. 물론, microarrays에 대한 주요 단점은 시퀀스 정보는 사전을 사용할 수 있어야합니다 수 있습니다. 얼마나 많은 miRNA 유전자가 불분명하다 있지만 이것은 모델 생물에서 대부분의 단백질 유전자 가족 문제가되지 않습니다. 우리가 사용하고있는 프로브 세트 miRBase 8을 기반으로 설계되었습니다 9, 10에서, 그것은 가장 풍부한 가장 생물학적으로 관련성이 높은 포유 동물 miRNAs가 이미이 프로브 세트에 의해 적용되는 분명합니다.
사용자 정의 microarray 실험을 수행하기 위해 더 큰 기술적 도전이 없습니다. 충분한 수량의 좋은 품질의 RNA를 준비하고 잘 인쇄 슬라이드, 2) 취득) 1, 3) 제대로 하이브 리다이 제이션 후 슬라이드를 세척하려면 다음과 같이 우리의 경험을 바탕으로, microarray 실험의 성공의 열쇠입니다. Trizol 시약은 일반적으로 후속 연구 그대로 RNA의 충분한 양을 산출. 그럼에도 불구하고, miRNA의 표현이 다른 조직 및 세포 라인 사이에 다릅니다. 결합 방법에 의해 분류하면 대부분의 조건에서 총 RNA의 20-25 μg 충분히 강력한 microarray 신호를 줘야한다. 덜 RNA는 뇌 영역과 신경 등 miRNA 풍부한 샘플이 필요합니다. 총 RNA 이하만이 1-5 μg 사용 가능한 다른 방법 상표 경우들 예를 들어, Invitrogen에서 RNA 라벨 키트, 사용, 그리고 그들은 정의 microarray 플랫폼 여기에 설명된와 호환 수 있습니다. 가장 비교 들어, 하나는 항상 동시에 모든 제어 및 실험 샘플 중 하나 이상의 레이블을 복제해야하며 하나의 실험에 슬라이드 같은 인쇄 배치로 잡종. 이 연구 디자인은 샘플 라벨과 처리 및 슬라이드 품질의 변화로 인한 차동 microarray 신호에 기여를 최소화합니다. 참조 유전자 (빨간색 채널) 슬라이드, 하이브 리다이 제이션, 그리고 세척의 품질를 제어하는 역할을합니다. 성공 하이브 리다이 제이션은 빨간색으로 깨끗하고 강력한 신호를 제공합니다. DNA 신호 좋다지만 RNA 신호가없는 경우, 하나는 RNA 분리 및 라벨의 단계를 문제 - 촬영해야합니다. 예를 들어, RNA는 비율에게 1.9 및 2.1 사이에 260nm / 280nm이 있나요? 펠렛의 붉은 3.3에 있습니까?
투자의 대부분은microarrays에 대한 슬라이드 인쇄 및 스캔하실 수 있습니다. microarray 프린터와 스캐너는 여러 대학과 의과 대학의 핵심 시설로 갖추고 있습니다. 벌크 및 재사용 슬라이드와 lifterslips에서 인쇄 microarrays는 크게 비용을 줄일 수 있습니다. 재사용 슬라이드 microarray 실험 7의 일관성을 향상의 추가 장점이 있습니다. 우리는 슬라이드를 더보다 여섯 배나를 재사용하고 데이터 품질이 여전히 만족 나타났습니다. 최소한의 입력 RNAs있는 가장 소중한 샘플이나 샘플을위한 최상의 감도를 보장하기 위해, 그러나, 그것은 신선한 슬라이드에게 7을 사용하기 위해 여전히 신중한 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
작품은 약물 남용 센터 국립 연구소 (P50 DA 011806)와 국방의 미국 육군과 (W81XWH - 07 - 1-0183)에 의해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NCode Multi-Species miRNA Microarray Probe Set V2 | Invitrogen | MIRMPS201 | Designed based on the miRBase Release 9.0 (October 2006). It contains ˜ 1,140 unmodified, 34-44 nt long oligonucleotides as probes for worm, fly, zebrafish, mouse, rat, and human miRNAs, and a number of internal control probes such as snoRNAs. The miRNA probes are doublets of the sequences complementary to mature miRNAs, hence the size of ˜ 44 nt. For analysis one can focus on miRNAs from a particular genome(s) of interest. |
| Trizol | Invitrogen | 15596018 | We have also used enriched, small RNA fraction for labeling, although total RNA samples are faster and easier to prepare and to quantify and suitable for downstream applications such as mRNA analysis. |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs | M0204L | |
| Ulysis Alexa Fluor 647 Nucleic Acid Labeling Kit | Invitrogen | U21660 | This kit or similar products can be used to label experimental RNA samples or a control RNA (instead of control DNA) as well. |
| 5’-pCU-DY547-3’ | Dharmacon | Custom made | Small RNA fraction can be similarly labeled by ligation. |
| CentriSep columns | Princeton Separations | CS-901 | |
| GAPSII coated slide | Corning | 40004 | Other types of slides may be also used. |
| Microarray hybridization chambers | Corning | 2551 or 40080 | Other kinds of hybridization chambers and coverslips should also work. Using commercially available hybridization machines can reduce hybridization time significantly, e.g., to ˜ 2 hours. |
| Lifterslips | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 25X60I-M5439-001-LS | |
| BlueFuse | BlueGenome | ||
| GeneSpring | Agilent Technologies |
References
- Ambros, V.
- Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19, 92-105 (2009).
- Chekulaeva, M., Filipowicz, W. Mechanisms of miRNA-mediated post-transcriptional regulation in animal cells. Curr. Opin. Cell Biol. 21, 452-460 (2009).
- Farazi, T. A., Spitzer, J. I., Morozov, P., Tuschl, T.
- Small, E. M., Olson, E. N. Pervasive roles of microRNAs in cardiovascular biology. Nature. 469, 336-342 (2011).
- Thomson, J. M., Parker, J., Perou, C. M., Hammond, S. M. A custom microarray platform for analysis of microRNA gene expression. Nat. Methods. 1, 47-53 (2004).
- Zhang, X., Xu, W., Tan, J., Zeng, Y. Stripping custom microRNA microarrays and the lessons learned about probe:slide interactions. Anal. Biochem. 386, 222-227 (2009).
- Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucl. Acids. Res. 36, D154-D158 (2008).
- Landgraf, P. A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing. Cell. 129, 1401-1414 (2007).
- Chiang, H. R. Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes. Genes. Dev. 24, 992-1009 (2010).
