Summary
生物相容的pH响应性溶胶 - 凝胶纳米传感器可并入聚（乳酸 - 共 - 乙醇酸）（PLGA）电纺支架。所产生的自我报告的支架可用于在微环境条件原位监测，同时在所述支架中培养细胞。这是有益的，因为在三维细胞构建体可以在实时而不干扰试验来监测。
Abstract
培养细胞在三维上合适的支架材料被认为是更好的模拟体内微环境和提高细胞间的相互作用。所得到的三维蜂窝结构往往可以更相关的研究的分子事件和细胞间的相互作用比研究中的2D类似的实验。在整个支架创建具有高细胞活性的有效三维培养的培养条件，如氧和pH值必须仔细控制在分析物的浓度梯度可以在整个三维结构存在。这里我们描述了制备生物相容的pH响应性溶胶 - 凝胶纳米传感器和它们掺入到聚（乳酸 - 共 - 乙醇酸）（PLGA）电纺支架以及它们的用于哺乳动物细胞的培养以后的制剂的方法。将pH响应性支架材料可以用作工具，以一个三维蜂窝结构内确定微环境的pH值。此外，我们详细的pH响应nanose交付nsors哺乳动物细胞，其增长主要由电纺PLGA支架支撑的细胞内环境。对pH值敏感的纳米传感器的细胞质位置可以利用正在进行的实验过程中监测细胞内pH（PHI）。
Introduction
在组织工程中的一个关键的策略是使用生物相容性的材料来制作支架，其形态类似于组织，它要替代，也能够支持细胞生长和功能1,2。脚手架允许细胞附着和增殖但允许在整个三维细胞结构的空隙细胞迁移提供机械支撑。该支架还必须考虑到的细胞营养物质传输，而不是抑制代谢废物清除3。
静电纺丝已经成为一种很有前途的方法，能够支持细胞生长4-6聚合物支架的制造。生产的非织造电纺纤维是适合于细胞生长，因为它们往往是多孔的，并允许在整个三维细胞构建体7的间隙中的细胞-细胞相互作用，以及细胞迁移。它吨期间监测细胞存活力是重要他培养期间，确保细胞活力保持在整个三维构建体。例如，培养条件，如氧和pH值需要小心控制，因为在分析物的浓度梯度可以在三维结构内的存在。生物反应器或灌注系统可受聘于间质流体内条件，因此增加营养转移和代谢废物清除8模仿。这种系统是否正在确保恒定的微环境条件的问题可以通过评估在实时细胞微环境加以解决。
这可以实时监测关键微环境指标包括：温度，细胞培养基的化学成分，溶解的氧和二氧化碳的浓度，pH和湿度。这些指标中，温度可最容易使用的探针原位监测。方法监测通常在余下的上市指标沃尔沃去除等分取样，因此干扰了细胞培养和增加污染的风险。连续，实时的方法正在追捧。目前的监测方法通常依赖于物理上探测细胞结构，如pH监测仪或氧探头的仪器。然而，这些侵入性的方法可以破坏细胞结构，扰乱正在进行的实验。无创监测的三维结构中的分析物浓度可以使各种环境因素，如营养枯竭9实时监控。这将使营养供给的评估，以结构内更深的区域，并确定是否代谢废物得到有效10,11去除。试图解决侵袭的问题的系统一般涉及使用已灌注腔的传递培养基同时通过培养容器和外部传感器来监控pH值，氧气和葡萄糖12。该再是在发展中国家，可以直接集成到培养容器中，不需要除去的等分试样进行采样的，因此会在原位监测传感器提供越来越大的兴趣。
为解决现场和非侵入性的监测，我们已经把分析物响应纳米传感器为静电支架，产生自我报告的支架13微环境条件等缺点。即通过监测荧光活性充当传感装置的支架已预先制备的，其中所述感测装置是要么通过电或通过使用分析物响应性染料被加入到聚合物中之前，形成支架14,15的所产生的实际的聚合骨架。然而，这些传感装置必须给由从其他分析物可能的干扰错误的光输出的潜力。使用比例传感装置的su通道的那些在所描述的方案制备持有以消除这些可能的不利影响，并提供特定于所讨论的分析物的响应的可能性。
这里介绍的静电支架乃从合成的共聚物的聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA），由于选择具有食品和药物管理局（FDA）批准的，由于其可生物降解和生物相容特性和轨道支持各种细胞类型16-18的生长和功能的记录。所制备的比例分析物响应纳米传感器的响应pH值。纳米传感器包括两个荧光染料成生物相容的溶胶 - 凝胶基质中，其中一种染料，FAM是响应于pH和其他，TAMRA作为内标，因为它是不响应的pH值。另外两个FAM和TAMRA的荧光可以单独进行分析，因为它们不显著重叠。确定所述荧光EMI的比例两种染料的特定波长裂变给出的pH响应独立于其它环境条件。自报支架可以让pH值的重复评估， 原位和实时而不破坏开发的3D模型。我们已经证明，这些支架能够支持细胞附着和增殖，并保持响应到有问题的分析。的酸性副产物的工程化构建体的动力学保持充分研究，因此使用对pH值敏感的支架可以大大促进这些研究19。此外，使用了自行申报组织工程支架的应用提供了机会，以充分了解，监控和优化的三维模型的组织结构在体外生长，无创性和实时性。
对pH值敏感的纳米传感器也已交付给成纤维细胞在静电PLGA scaffol培养的细胞内环境DS。荧光发射的从染料的比率被用来监测和pHi值相比，自我报告的支架结合的pH纳米传感器。纳米传感器的细胞在3D环境中培养的递送可以使深部以非破坏性的方式构造内的监测的分析物浓度的影响。因此，纳米传感器可能是一个可行的成像工具，非破坏性评估整个3D细胞行为的构造允许长期分析。筛选三维结构中的单个细胞的分析物浓度可以确保它们得到足够的营养物和氧的浓度。监测过程参数可有助于标准化的技术的发展为氧气和营养物质的有效质量传输。纳米传感器对细胞内环境和纳米传感器为高分子支架结合的交付可以合并，允许在3D常量评估细胞活力以及支架的性能在组织生长过程ructs。这可能会导致这些结构增加了知识和进步的生物学相关的组织替代品的制造。
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Protocol
概观
第1章描述的pH值敏感的纳米传感器和纳米传感器响应利用荧光光谱和它们的大小用扫描电镜pH值表征的准备。
第2节描述的静电聚合物支架和它们的形态和大小用扫描电镜表征的准备。部2还描述了自我报告的支架这是电纺支架与夹杂物的pH值敏感的纳米传感器的制备方法。所得到的自我报告的支架的特征在于通过SEM以评估是否在电纺纤维的任何形态学变化已经发生。从掺入纳米传感器产生的自我报告的支架的荧光共聚焦显微镜进行评估。
第3节因静电脚手架和自我报告脚手架描述细胞的培养。该支架在preparat先消毒离子为其支架进行评估，以确定消毒和细胞的培养是否会影响自我报告脚手架的荧光能力的细胞培养以下。该协议还介绍了纳米传感器交付给那些因静电支架培养的细胞。 Lysotracker染料被用来确保纳米传感器没有被考虑到的细胞的酸性区室。
1。制备及对pH值敏感的溶胶 - 凝胶纳米传感器分析
1.1制备的pH响应溶胶 - 凝胶纳米传感器
注意：该制剂应在通风橱中进行。
- 制备荧光团为通过溶解5将pH纳米传感器中使用 - （和6） - 羧基荧光素，琥珀酰亚胺酯（FAM-SE）（1.5毫克）的二甲基甲酰胺（DMF）中（1毫升）在圆底烧瓶中，6 - 羧基四甲基罗丹明，琥珀酰亚胺酯（TAMRA-SE）（1.5毫克）的DMF（1毫升）在另一个圆底烧瓶中。添加3 -氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）（1.5毫升）到每个培养瓶中，并在干燥的氮气氛下（21℃）下搅拌24小时，在黑暗中，即包裹样品中金属箔。
- 上述两种染料（250微升）添加到乙醇（6毫升）和氢氧化铵（30重量％，4毫升）包含在一个圆底烧瓶中的混合物中，并搅拌1小时（21℃）。
- 慢慢加入正硅酸四乙酯（TEOS）（0.5毫升）到混合物中，继续再搅拌2小时。该混合物会变成混浊。纳米传感器可以通过旋转蒸发来收集。纳米传感器可以在4℃以备将来使用而保存在玻璃小瓶中。
注意：应在通风橱中或在称量它们的平衡应该密封，例如在一个Weighsafe的情况下进行的纳米传感器的进一步的处理在其干燥形式。
1.2纳米传感器响应pH值
- 准备索伦森的磷酸盐缓冲溶液从pH值5.5-8.0由MIXI吴特定的磷酸二氢钠（0.2M）和磷酸氢二钠（0.2M）股票方案的比率。用pH计检查最终的pH值。使用氢氧化钠（NaOH）（4 M）或盐酸（HCl）（2 M）使任何轻微调整pH值。
- 通过首先固定装有一个涡旋混合3分钟，然后浸没在容器中的超声发生器的纳米传感器溶液的容器悬浮在pH缓冲液（5毫克/毫升）将pH纳米传感器，直到溶液变浑浊（约5分钟）。重复这些步骤，充分悬浮于溶液中的纳米传感器。
- 将第一溶液为光反应杯并使用488 nm的激发波长为5 - （和6） - 羧基荧光素（FAM）和568纳米的6 - 羧基四甲基罗丹明（TAMRA）。收集发射波长在500-530纳米的FAM和558-580 nm的使用TAMRA荧光光谱仪。
- 改变在光学比色皿的解决方案，使得pH值可以在不同的pH下观察到，并继续Çollecting的发射光谱。
- 计算在每个pH值产生的，产生的校正曲线的发射最大值之比。
1.3扫描电子显微镜的纳米传感器
- 将纳米传感器的样品到一个碳涂覆的电子显微镜存根和溅射涂层具有氩气气氛下，金为5分钟。
- 通过扫描电子显微镜（SEM）观察。在成像调节工作距离，电压和放大倍数，以减少电子的充电（ 图1）。
2。 PLGA支架的制备与分析
2.1静电纺丝PLGA支架
- 在通风橱中溶解聚在二氯甲烷与吡啶甲酸（乳酸 - 共 - 乙醇酸）（PLGA）（DCM）（20％（W / W））（PF）（1％（W / W））。将溶液到10ml注射器18G的钝针填充和牢固地贴合到注射泵。
- 距离针尖20 cm的距离20厘米x 15厘米铝制收集板。
- 附加的高电压电源的电极，以将注射器和地球到铝集电板的一角。
注意：应注意高电压用于处理任何静电纺丝设备之前， 即始终把电力供应关闭。 - 使用3.5米/小时的恒定流速在12千伏2小时递送解决方案。使用这些条件的电纺丝将给予约60微米的支架的深度。
- 离开该支架在通风橱中放置24小时，以允许溶剂残留挥发。
2.2静电对pH值敏感的PLGA支架
- 准备在2.1节，但与添加纳米传感器的聚合物溶液（5毫克/毫升）的修改说明纳入对pH值敏感的纳米传感器支架。暂停在PLGA溶液中的纳米传感器与超声波的协助下（约5分钟）前要放置到一个10毫升注射器。
2.3 SEM PLGA支架和pH值响应脚手架
- 将PLGA支架或pH响应性支架材料的样品上的碳涂覆的电子显微镜存根并进行如下描述的纳米传感器的扫描电镜（ 图1）。
2.4校准pH值响应脚手架
- 将pH值反应支架的样品放入35毫米培养板，沉浸在适当的缓冲溶液。
- 在共聚焦显微镜使用488 nm的氩激光激发FAM和568 nm的氪激光器的纳米传感器内激发TAMRA。观察pH值敏感支架的荧光发射的500-530纳米的FAM和558-580纳米的TAMRA。 （ 图2）。使用顺序扫描，以避免收集激发波长。
3。在PLGA支架和pH响应PLGA支架细胞培养
ntent“>注：以下应在细胞培养柜中进行。3.1制备PLGA支架的细胞培养
- 切PLGA或pH响应PLGA支架成2厘米2件。
- 通过用紫外（UV）光在8厘米15分钟每一侧的距离照射消毒支架。
- 传送支架到12孔培养板中，放置一个钢环上顶。加青霉素/链霉素溶液（5％V / V）在磷酸盐缓冲盐水（PBS）的内侧和钢环以外，孵育过夜（37℃，5％CO 2）。注意钢圈于英国诺丁汉大学制造，并具有以下尺寸：3 cm外直径1厘米内直径1厘米深。
- 除去消毒液和洗涤用PBS。
- 加细胞培养基到内侧（500微升）和外侧（500微升）的钢环，地点在培养箱中（37℃，5％CO 2的
- 制备细胞悬浮液，并用台盼蓝排除法进行细胞计数。
- 建立细胞悬浮液以达到1×10 6个细胞/ ml的细胞数。
- 从钢板环的内侧和外侧除去介质。
- 替换上的钢圈（1米）的外预热的细胞培养基。
- 加入300μL的细胞悬液到钢圈的内侧 - 岩板向前和向后轻轻散发细胞。
- 将细胞培养板放入培养箱中（37℃，5％CO2） -细胞附着应该发生在24小时内，但是继续培养，只要实验要求-刷新媒体每2-3天。
3.2纳米传感器传递到细胞在PLGA支架培养
- 如3.1节所述的种子细胞到PLGA支架。在这项研究中的空白PLGA支架（含有多种不宁纳米传感器）是成像时使用，由于荧光发射的重叠。
- 将细胞接种到支架恒温箱（37℃，5％CO 2）72小时，以使细胞在整个纳米传感器，以提供之前的支架生 长和迁移。
- 用PBS（37℃，5％CO2）1小时前，纳米传感器交付洗细胞和媒体的改变从标准培养基抗生素和无血清培养基，培养。注意：标准培养基为3T3细胞包括补充有胎牛血清（10％（V / V）），L-谷氨酰胺溶液（2毫摩尔），青霉素/链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基（1％（V / V）） 。
- 发病期间短暂超声处理的纳米传感器（5毫克）用的Optimem（50微升）来创建溶液A制备纳米传感器 - 脂质体复合物
- 通过将脂质体2000（5微升）到的Optimem（45微升）创建B溶液，在室温下孵育5分钟。
- 添加解决方案A至溶液B，在室温下孵育20分钟以形成溶液C这是纳米传感器 - 脂质体复合物。
- 加入溶液C（100微升）对细胞进行培养（37℃，5％CO 2）为3小时。
- 从培养箱中，抽吸介质除去细胞接种支架，加入PBS（1ml）中，以允许活细胞可视化通过共聚焦显微镜之前，用PBS洗两次。注意：用PBS在这个协议使得酚红指示剂存在于细胞培养基中，因为正在执行校准在不同的pH没有引起自发荧光和也。然而，可用于细胞培养的较长期分析酚红培养基中。
- 沉浸细胞接种到支架的不同pH值的缓冲液，并监控与细胞相关的纳米传感器的响应特性。
- 监视的pHi通过确定从FAM和TAMRA的荧光强度的比率通过使用共聚焦显微镜（FIGU观察荧光再3）。
哺乳动物细胞内3.3纳米传感器位置
- 培养细胞用含有仅3.2节所描述的FAM染料（这是因为TAMRA的荧光发射是在同一光谱区为LysoTracker红色）的纳米传感器。在1.1节，但与遗漏，并准备加入TAMRA的介绍准备这些纳米传感器。
- 随着纳米传感器交货周期稀释LysoTracker红原液至50nm。
- 添加稀释的溶液（2微升）到细胞后PLGA支架培养物的等分试样。
- 孵育细胞LysoTracker红1小时（37℃，5％CO2）。
- 以下潜伏期移除介质和改变介质的PBS（pH 7.4）中（2ml）中，准备使用共聚焦显微镜观察前，用PBS（pH 7.4）中洗细胞两次。注：可以用来代替PBS酚红的自由媒体。
- 加入核染色绘制直线Q5到PBS中，使最终浓度为5微米，并孵育细胞3分钟（37℃，5％CO 2）。这是没有必要以下的潜伏期与DRAQ5改变介质。
- 使用488nm的氩激光激发FAM只有纳米传感器，一个568 nm的氪激光激发LysoTracker红色和633 nm的氦/氖激光激发DRAQ5生色团，并观察荧光在500-530纳米，波长580-600，650 -750 nm处（ 图3）。使用顺序扫描，以避免收集激发波长。
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Representative Results
利用SEM，其中纳米传感器成像的人口进行测定，发现具有纳米尺寸在240-470纳米（ 图1A）的范围内制得的pH值敏感的纳米传感器的尺寸分布进行了表征。实现一个狭窄的，合理的小直径与使用施托贝尔法制备纳米粒子是一致的。已经发现，纳米粒子的合成过程中使用碱性pH环境即纳米颗粒制备使用施托贝尔方法，允许良好控制的大小的，而使用酸性条件制剂生产中颗粒大小广泛分散。的PLGA电纺纤维使用所描述的方法制备的代表性SEM显微照片示于图1B表明所生成的PLGA支架组成的非织造纤维显示最小的卷边或破损，其中该纤维具有纳米尺寸的。 图1C 图1B中的对照样品的SEM显微照片提供纳米传感器关联的证据在纤维的表面上，但他们可能也可以在支架内的纤维掺入，这些支架/纳米传感器支架的降解研究可以进行在用SEM和/或共聚焦显微镜结合使用，以确定是否这会影响纳米传感器的性能。
纳米传感器下面纳入PLGA纤维保留其光学活性的功能是通过使用激光共聚焦显微镜检查自我报告的支架核实。当掺入纤维支架保持光学和化学活性的能力保持可以使分析物浓度进行监测。从纳米传感器发出的荧光表明，纳米传感器Řetained它们的光学活性的，并与所述支架的纤维相关联。从染料FAM（绿色）荧光发射和TAMRA（红色）中的对pH值敏感的纳米传感器并入被分别示于图2A和2B。这是一个积极的结果，使得它可行的分析物浓度的原位监测。它也是第一次旋光活性成比例的纳米传感器，已纳入PLGA支架的纤维用静电纺丝过程。经证实，纳米传感器可以使用荧光显微镜下掺入PLGA纤维被可视化，纳米传感器响应的变化的分析物浓度进行了验证。浸入支架成不同pH值的缓冲导致荧光强度从FAM荧光，而由TAMRA参比染料并没有明显的改变发出的荧光的变化。两种染料的荧光强度的比值可用于刺UCE的校准曲线， 如图2C所示 。对于纳米传感器的校准曲线单独评估，并当掺入到静电纺丝PLGA支架是可比较和证明了纳米传感器保持其光学活性下列掺入自我报告的支架。自报支架的可逆到不同pH值的响应能力是由交替浸入所述支架在缓冲器为5.5和7.5的pH值进行评估。可逆性被认为是很不错的， 如图2D其中自行申报支架可以在众多的pH值周期性变化做出反应。长期研究尚未进行评估PLGA降解的纳米传感器成立时的效果;它被认为是由于纳米传感器提供一个成比例的响应存在的纳米传感器的数量不会影响结果。
分析物响应纳米传感器采用一个liposom交付人转染试剂的3T3成纤维细胞的生长是由空白PLGA支架支持细胞内环境。的3T3成纤维细胞在空白PLGA支架培养的共聚焦显微镜图像表明，纳米传感器都与成纤维细胞与荧光从分别FAM和TAMRA 如图3A所示和 B观察到相关联。从这些信道重叠的荧光显示，从两种染料的荧光共定位，表明染料仍然在纳米传感器“生物相容性基质（如所描绘由黄色荧光在图3C）内夹带。纳米传感器被认为是在3T3成纤维细胞和不含有酸性隔间内就证明了从FAM缺乏共定位荧光的细胞质内唯一的纳米传感器，并在图3D中描绘Lysotracker红色染料。的pH值敏感的纳米传感器的荧光强度提供编到3T3成纤维细胞进行了监测，而细胞进行其结果示于图3E中pH值的变化。生成的图形表明，细胞因静电PLGA支架培养一直保持着披在6.8-7.0范围内。
图1。 SEM形貌的纳米传感器，PLGA纤维和自我报告的支架 。 （A）对pH值敏感的溶胶-凝胶的纳米传感器示出球形纳米大小的粒子（B）的PLGA电纺非织造布的纤维，其中纤维形态是定期用最少的卷边和断裂（C） 的 pH值敏感的自我报告的支架，其中该纳米传感器可以观察到由凸的PLGA但纤维的形态保持与控制PLGA纤维不包含毫微秒可比ensors。 点击这里查看大图 。
图2。 pH值敏感的自我申报支架，其中荧光可以从与PLGA支架纤维相关的纳米传感器观测到共聚焦显微镜图像（A）FAM（绿色）的pH值敏感的染料和（B）TAMRA（红色）的参比染料。 （ 三）对pH值敏感的溶胶-凝胶纳米传感器和pH响应性支架校准曲线demonst率的纳米传感器的光学和化学反应并没有受到影响时，PLGA支架纤维内注册成立。 （ 四）可逆性浸在pH值5.5和pH 7.5的替代缓冲溶液的脚手架进行的自我报告脚手架。 点击这里查看大图 。
图3。细胞内化纳米传感器及pH值和Phi响应曲线。荧光共聚焦显微镜图像从内化纳米传感器（A）FAM（绿色）（B）TAMRA（红色）（C）从FAM和TAMRA共定位荧光（黄色）（ D）FAM仅纳米传感器（绿色）运送到3T3成纤维细胞培养ð在PLGA支架与原子核的DRAQ5（品红）标签和溶酶体LysoTracker红（红）标记。 FAM和Lysotracker红色的荧光不共定位，因此证明这是不可能的纳米传感器已被内化入细胞的酸性区室从输送到相对于pH校正3T3成纤维细胞在空白PLGA支架培养的纳米传感器拍摄（E）的pHi测量无细胞培养的pH值传感脚手架。这也表明，pH测量采用内化纳米传感器是不是酸性的细胞因静电PLGA支架培养一直保持着披在6.8-7.0范围内进行的。 点击这里查看大图 。
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Discussion
组织工程立志创建生物替代品，可以用来作为在体内像体外组织模型和组织替代疗法进行修复，替换，维持或提高特定组织或器官的功能。合成的替代物已经使用了很多年，以取代或组织抢修，但这些往往是由于与宿主组织和/或感染，最终导致拒绝或进一步修正手术融合不佳失败。生成植入前活组织，在实验室可以解决实现全面整合的问题，并减少需要翻修手术。然而，这个目标要实现适当的离体繁殖和操纵三维结构中的细胞应该再加上在体外组织的适当调理身体。这可以以多种方式之一是继续研究的基本生物学来实现参与，但也研究涉及到生产合成替代品的设计和制造问题。正是这后一个问题，所描述的协议，旨在促进。
预期用途所描述的PLGA支架的是提供一个临时支撑到哺乳动物细胞中，以协助其生长成生物相关的结构。公司注册响应分析纳米传感器到PLGA支架可能允许本地分析物浓度在全三维结构在组织生长过程监控。使用对pH值敏感的支架可能允许是否酸性副产物产生作为支架降解和细胞生长被有效地从一个三维构造中去掉了测定。这是朝 着解决目前缺乏过程监控和体外组织再生过程的控制步骤。支架本身是传感设备的利用率可能使原位，实时微环境评估。监测结构的微环境不破坏组织是必要的，可以让过程监控在组织生产的各个阶段。
所产生的对pH值敏感的支架来报告本地的分析物浓度的能力是通过监测荧光输出从使用共焦显微镜的纳米传感器进行评估。执行校准实验的pH值传感脚手架和证明相媲美，不纳入PLGA纤维对pH值敏感的纳米传感器。制作校准曲线的能力表明，该纳米传感器保持响应时掺入到聚合物骨架，也即该支架的灭菌过程中没有造成任何有害影响至pH纳米传感器的传感能力，pH的变化。此外，纳米传感器被传递到细胞在PLGA支架培养的细胞内环境WHER变化的pHië细胞响应可以被监控。从FAM和TAMRA的荧光强度的比值被用来监视和pHi值相比，pH值敏感的脚手架，这表明3T3成纤维细胞都保持了pHi值范围为pH值6.8-7。转染的纳米传感器与核染色DRAQ5孵化的3T3成纤维细胞显示大多数小区相关联的纳米传感器的没有位于核区。纳米传感器的位置不显示为酸性区室如内涵体或溶酶体内，通过培养转染的3T3成纤维细胞与LysoTracker红，其中共定位FAM和LysoTracker红将由黄色像素中的共焦图象进行描绘的纳米传感器来确定。进一步的研究，例如通过透射电子显微镜（TEM）和鉴定生物标志物的内在化的途径分析，可以进一步验证这一点。此外，长期的研究，如时间分辨共焦显微镜可以判断细胞在自行申报支架培养中的纳米传感器的长期命运。如果纳米传感器分别被传递到其它类型的细胞，然后它们的位置应该被认定为结果可能不相同，在这里，如图所示。
采用自我报告的支架具有无创监测组织工程结构内微环境条件的潜力。具有该能力在现场测量来执行可以使优化的三维组织结构在体外的生长和非侵入性的实时。将pH响应性纳米传感器的胞质位置可以利用持续的实验过程中监测的pHi。递送至细胞或自我报告的支架的内部环境中的纳米传感器既可以在静态或动态的组织培养系统中使用，并且可以导致确定所需的组织工程化构建体中的最佳生长的培养条件体外。进一步发展可导致一种在线系统，它作用在养分耗竭确保营养和氧气的整个构建体的稳定供应，最终给予高度再现方法用于组织构建体的培养。
所描述的协议已经制备的支架具有适于允许使用共聚焦显微镜然而，为使较大的三维成像构建体将被成像的多光子激发的尺寸可能被要求允许更深的结构内成像。使用如显微镜透镜的光学设备，应选择以确定该透镜和该构建尺寸的最佳工作距离。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
从BBSRC资金体谅（批准号BB H011293 / 1）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Fisher | 32221 | |
| Anhydrous dimethylformamide (DMF) | Sigma | 270547 | |
| Ammonium hydroxide 50% (v/v) aqueous solution | Alfa Aesar | 35574 | diluted to 30% (v/v) with pure water |
| TEOS | Sigma | 13190-3 | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma | A3648 | |
| 5-(and-6)-carboxyfluorescein, succinimidyl ester (FAM-SE) | Invitrogen | C1311 | |
| 6-carboxytetramethylrhodamine, succinimidyl ester (TAMRA-SE) | Invitrogen | C1171 | |
| Sodium phosphate monobasic (0.2 M) | Sigma Aldrich | S-9638 | |
| Sodium phosphate dibasic (0.2 M) | Sigma Aldrich | S-0876 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | S8045 | |
| Trypsin/EDTA | Sigma Aldrich | T4174 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6046 | |
| FBS | Source Bioscience | Batch-213-101992 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Optimem | Invitrogen | 11058-021 | |
| LysoTracker Red | Invitrogen | L-7528 | |
| Draq5 | Biostatus Ltd | DR50050 | |
| Nitrogen gas | BOC | ||
| DCM | Sigma Aldrich | 320269 | |
| TFA | Sigma Aldrich | T6508 | |
| Confocal microscope | Leica TCS-SP | equipped with argon and krypton lasers and a 63X 0.9NA water immersion lens | |
| UV light | UVLS28 UVP, USA | ||
| Stirrer plate | SB161-3 Jencons-PLS | ||
| pH meter | Jenway model 3510 | ||
| Rotary Evaporator | Buchi Rotary Evaporator R200 | ||
| Centrifuge (nanosensors) | Hermle Z300 | ||
| Centrifuge (cell culture) | Thermo Scientific Heraeus Biofuge Primo | ||
| Vortex | Whirlimixer Fisherbrand | ||
| Ultrasonicator | FB11021 Fisherbrand | ||
| Aluminum sheet | Nottingham University | ||
| 35mm cell culture plate | Iwaki | 3000035 | |
| 10 ml syringe | Becton Dickenson | ||
| 3T3 Fibroblast cells | European Collection of Cell Cultures | ||
| PLGA | Lakeshore Biomaterials | 7525 DLG 7E | |
| Pyridinium formate | Sigma Aldrich | P8535 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S5136 | |
| HCl | Sigma Aldrich | 320331 |
References
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