Summary
生体適合性のpH応答性ゾル - ゲルナノセンサーは、ポリ（乳酸 - コ - グリコール酸）（PLGA）エレクトロスパン足場に組み込むことができる。産自己申告足場は、足場上に細胞を培養しながら微小環境条件の現場モニタリングのために使用することができる。 3D構築物が細胞の実験を妨害することなく、リアルタイムでモニターすることができるので、これは有益である。
Abstract
適切な足場上に3Dで細胞を培養すると、より良好なin vivoでの微小環境を模倣し、細胞-細胞相互作用を増大させると考えられている。結果の3D携帯構築物は、多くの場合、2次元で研究の同様の実験よりも分子事象および細胞間相互作用を研究するより関連することができます。足場を通して高細胞生存性との効果的な3D培養物を作成するために、酸素、注意深く分析物濃度の勾配のように制御することが必要なpHなどの培養条件は、3D構築物の全体にわたって存在することができる。ここでは、ポリ哺乳動物細胞の培養のためのそれらのその後の製剤と共に（乳酸-co-グリコール酸）（PLGA）エレクトロスパン足場内に生体適合性のpH応答性ゾルゲルナノセンサおよびそれらの取り込みを調製する方法を記載している。 pH応答性スキャフォールドは、3D携帯構文内微小環境pHを測定するためのツールとして使用することができます。さらに、詳細なpH応答性nanoseの配信成長エレクトロPLGA足場によってサポートされていた哺乳動物細胞の細胞内環境にnsors。 pH応答性ナノセンサーの細胞質の位置は、進行中の実験の間、細胞内pH（PHI）を監視するために利用することができる。
Introduction
組織工学における主要な戦略は、それが交換する形態としている組織に似ており、また、細胞増殖および機能1,2をサポートすることができる足場を製造するための生体適合性材料を使用することである。足場は、細胞の接着や増殖はまだ3D携帯コンストラクトの隙間を通じて細胞移動を可能にすることによって、機械的なサポートを提供します。足場はまた、細胞の栄養素の大量輸送を可能にし、代謝廃棄物3の除去を阻害してはならない。
エレクトロスピニングは、細胞増殖4-6を支持することができるポリマー足場の製造のための有望な方法として出現した。彼らはしばしば多孔性であり、細胞の3D構築物7の隙間を通して細胞間相互作用、ならびに細胞移動を可能にするようにして製造不織布電界紡糸繊維は、細胞増殖に適している。これは、tの間に細胞生存率を監視することが重要である彼培養期間、その細胞の生存率を確保するためには、3D構築物の全体にわたって維持される。検体濃度の勾配は、3D構築物内に存在することができるように、例えば、酸素やpHなどの培養条件は、慎重な制御を必要とする。バイオリアクターまたは灌流系は、間質流のインビボ条件で模倣し、その結果、栄養素伝達および代謝廃棄物の除去8を増加させるために用いることができる。このようなシステムは一定の微小環境条件を確保しているかどうかの問題は、リアルタイムでの細胞の微小環境を評価することによって対処することができる。
リアルタイムで監視することができる主要な微小環境メトリクスとしては、温度、細胞培地の化学組成、溶存酸素及び二酸化炭素の濃度、pH、湿度。これらのメトリックのうち、温度が最も容易にその場プローブに用いてモニターすることができる。一般的に残っているリストされているメトリックを監視するための方法volveサンプリングのためのアリコートの除去、したがって、細胞培養を妨害し、汚染のリスクを増加させる。連続的なリアルタイムの方法が求められている。現在の監視方法は、通常は物理的なpHモニターや酸素プローブなどの細胞構造を探査楽器に依存している。しかし、これらの侵入方法は、細胞の構造を損傷し、継続的な実験を邪魔することができます。 3D構築物内の検体濃度の非侵襲的モニタリングは、例えば、栄養枯渇9のような種々の環境側面のリアルタイムモニタリングを可能にすることができる。これは構造内の深部への栄養供給の評価を可能にし、代謝廃棄物を効果的に10,11削除されたかどうかを決定するであろう。侵襲性の問題に対処しようとするシステムは、一般に、pHをモニターするために培養容器の両方を通って外部センサへの培養培地を渡す灌流チャンバーの使用を含む酸素およびグルコース12。ザ·直接再サンプリングのためのアリコートの除去を必要としない、そのようなものとして、その場の監視に提供するであろう培養容器に組み込むことができるセンサを開発することに関心が高まっている。
その場 、我々は自己申告足場13を生成するエレクトロ足場に、検体応答性のナノセンサーが組み込まれている微小環境条件を非侵襲的にモニタリングするためのこのような欠点に対処すること。感知装置は、エレクトロスピニングによって、または従来足場形成14,15にポリマー中に組み込まれる検体応答性染料を使用することによって作成された実際の高分子足場のいずれかであった場合に蛍光活性をモニタリングすることによってセンシングデバイスとして作用する足場は、予め調製されている。しかしながら、これらの感知装置は、他の検体からの干渉による誤光出力を与える可能性を有する。レシオメトリック感知装置SUの使用記載されたプロトコールで調製したものとchがこれらの可能な副作用を排除し、問題の分析物に特異的な応答を提供する可能性を保持している。
ここに提示エレクトロスパン足場は、合成共重合体による食品医薬品局（FDA）の承認を有する選択されたポリ（乳酸-co-グリコール酸）（PLGA）、その生分解性および生体適合性の特性のために、トラックから調製された種々の細胞型16-18の増殖および機能をサポートするレコード。準備されたレシオメトリック分析物応答性のナノセンサーは、pHに応答する。ナノセンサーはつの色素の生体適合性ゾル - ゲルマトリックス中に二つの蛍光色素を組み込んで、FAMは、pHに応答し、それがpHに応答しないように、他の、TAMRAは内部標準として作用する。それらは有意に重複しないようにさらにFAMとTAMRAの蛍光の両方を別々に分析することができる。蛍光EMIの比を決定する特定の波長での両方の色素のssionは、他の環境条件とは独立したpH応答を与える。自己申告足場が開発3Dモデルを中断することなく、 その場でリアルタイムでのpHの反復評価を可能にすることができる。我々は、これらの足場は、細胞付着および増殖を支持することが可能であり、問題の分析物に応答性を維持することを実証した。操作された構築物中の副生成物の酸性の動態は代役のままであり、そのようなpH応答性足場を使用して大幅にそのような研究19を容易にすることができる。さらに、組織工学用途のための自己報告の足場の使用は、非侵襲的かつリアルタイムで、in vitroでの 3Dモデルの組織構築物の増殖を完全に理解するための機会を提供し、監視し、最適化する。
pH応答性ナノセンサーはまた、エレクトロのPLGA scaffol上に培養した線維芽細胞の細胞内環境に配信されたDS。色素からの蛍光発光の比は、pHiはをモニターするために使用し、pHナノセンサーを組み込んだ自己申告足場と比較した。 3D環境で培養した細胞へのナノセンサーの配信が深い非破壊で構文内の分析物濃度の監視を可能にすることができます。したがってナノセンサ非破壊3Dを通して細胞の挙動を評価するための実行可能なイメージングツールは、長期的な分析を可能にする構成であってもよい。 3D構造内の個々の細胞の検体濃度をスクリーニング、彼らは十分な栄養と酸素濃度が供給されていることを確認できた。監視プロセスパラメータは、酸素と栄養分の有効質量の輸送のために標準化された技術の開発を支援することができる。細胞内環境およびポリマー足場中へのナノセンサーの取り込みに対するナノセンサーの送達は、3D定数内で細胞生存率の評価、ならびに足場性能を可能にするために組み合わせることができる組織の成長プロセスの間にructs。これはこれらの構築物の増加の知識につながり、生物学的に関連組織代替物の製造を進行することがある。
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Protocol
概要
セクション1は、SEMを用いた蛍光分析法とそのサイズを使用してpHにナノセンサー応答のpH応答性ナノセンサーおよび特性の製造を記載している。
第2節では、エレクトロポリマー足場とSEMを用いて、それらの形態や大きさの特性の製造を記載している。第2節では、また、pH応答性ナノセンサーを含めてエレクトロ足場である自己申告足場の製造が記載されている。得られた自己申告の足場は、電界紡糸繊維の任意の形態学的変化が生じたかどうかを評価するために、SEMによって特徴付けられる。組み込まれたナノセンサーから得られる自己申告足場からの蛍光を共焦点顕微鏡によって評価される。
第3節では、エレクトロ足場と自己申告足場上に細胞の培養について説明します。足場は最初preparatで滅菌された足場を滅菌し、細胞の培養は、自己報告足場の蛍光能力に影響を与えるかどうかを決定するために評価され、細胞培養のための次のイオン。プロトコルは、エレクトロ足場上に培養される細胞へのナノセンサーの送達を記載する。リソトラッカー色素は、ナノセンサーは、細胞の酸性区画内に取り込まれていないことを確認するために使用される。
1。 pH応答性ゾル - ゲルナノセンサーの調製および分析
pH応答性ゾル - ゲルナノセンサーの1.1準備
注：この製剤は、ドラフト内で実施されるべきである。
- フラスコおよび6 - カルボキシテトラメチルローダミンを丸底（および-6） - カルボキシフルオレセイン、ジメチルホルムアミド中のスクシンイミジルエステル（FAM-SE）（1.5 mg）を（DMF）（1ml）中5 - を溶解することによりpHをナノセンサー内で使用するためのフルオロフォアを調製、別のラウンドでのスクシンイミジルエステルのDMF（TAMRA-SE）（1.5 mg）の（1ミリリットル）をフラスコの底。各フラスコに3 -アミノプロピルトリエトキシシラン（APTES）（1.5）を添加し、暗所で24時間、乾燥窒素雰囲気下（21℃）の下でかき混ぜるすなわちホイルでサンプルを包む。
- 丸底フラスコ中のエタノールの混合物（6ml）および水酸化アンモニウム（30重量％、4 ml）中に上記色素（250μlの）の両方を添加し、1時間（21℃）攪拌する。
- ゆっくりと、さらに2時間撹拌し続け、混合物にテトラエチルオルトシリケート（TEOS）（0.5ミリリットル）を追加します。混合物が濁って変わります。ナノセンサーは、回転蒸発により回収することができる。ナノセンサーは、将来の使用のために4 度Cでガラスバイアル中に保存することができる。
注意：その乾燥形態でのナノセンサーの更なる処理はドラフト内で、またはバランスがWeighsafeの例では、囲まれている必要があり、それらを計量した場合に実行する必要があります。
pHは1.2ナノセンサーの対応
- ミクシィでpHを5.5から8.0に至るまでソレンセンのリン酸緩衝溶液を調製リン酸二水素ナトリウム（0.2M）とリン酸水素二ナトリウム（0.2M）の原液のNG特定の比率。 pHメーターを用いて最終pHを確認してください。水酸化ナトリウム（NaOH）（4 M）または塩酸（HCl）（2M）を用いてpHへの微調整を行います。
- まず液が白濁するまで（約5分）超音波装置で容器を水没して3分間ボルテックスにナノセンサー·ソリューションを含む容器を保持することによってpH緩衝液（5 mg / ml）をのpHナノセンサーを一時停止します。完全に溶液中でのナノセンサーを一時停止するには、次の手順を繰り返します。
- 光学キュベットに最初に溶液を置き、5について488nmの励起波長を使用して - （および-6） - カルボキシフルオレセイン（FAM）および6 - カルボキシテトラメチルローダミン（TAMRA）が568ナノメートル。 FAMとTAMRA蛍光分光計を使用するための558から580 nmのための500〜530nmでの発光波長を収集する。
- pHは、異なるpHで観察できるように、光学キュベット中の溶液を変更およびcを続行発光スペクトルをollecting。
- 較正曲線を生成するために、各pH値で生成さ発光最大値の比を計算する。
ナノセンサーの1.3 SEM
- カーボンコーティングされた電子顕微鏡スタブ上にナノセンサーのサンプルを配置し、アルゴン雰囲気下で5分間、金でコートをスパッタ。
- 走査型電子顕微鏡（SEM）により観察する。 （ 図1）帯電電子を最小限にするために、作動距離、電圧、倍率を調整する撮像中に。
2。 PLGA足場の調製および分析
2.1エレクトロスピニングPLGA足場
- ドラフト内でポリピリメートとジクロロメタン（乳酸-co-グリコール酸）（PLGA）（DCM）（20％（w / w）である）（PF）（1％（重量/重量））を溶解する。 18 G鈍フィル針とシリンジポンプにしっかりとフィットして10ミリリットルの注射器に溶液を入れます。
- 20センチメートル徒歩20から針の先端を距離センチ×15cmのアルミニウム集電板。
- シリンジの先端とアルミニウム集電板にアースに高電圧電源の電極を取り付ける。
注意：お手入れは、高電圧が使用されているように、すなわち常にエレクトロスピニングの器具を扱う前に電気の供給をオフにする注意が必要です。 - 2時間12 kVの時に3.5メートル/時の一定流量を使用してソリューションを提供します。これらの条件を用いて、電界紡糸は約60μmの足場の深さが得られます。
- 溶剤残留物を蒸発させるために24時間ドラフト内で足場を残す。
2.2エレクトロスピニングpH応答性のPLGA足場
- セクション2.1で、ポリマー溶液（5 mg / ml）でナノセンサーに改変を加えるして説明したように、足場はpH応答性ナノセンサーを組み込んで調製する。超音波の助けを借りてPLGA溶液中のナノセンサーを一時停止する（約5分）前に 10mLのシリンジ内に配置する。
2.3 PLGA足場のSEMおよびpH応答性スキャフォールド
- カーボンコーティングされた電子顕微鏡スタブにPLGA足場やpH応答性足場のサンプルを配置し、ナノセンサーのSEM（ 図1）に記載のように進みます。
pH応答性足場の2.4校正
- 35ミリメートル培養プレートにpH応答性スキャフォールドのサンプルを置き、適切な緩衝溶液に浸す。
- 共焦点顕微鏡でナノセンサーの中にTAMRAを励起し、FAMおよび568 nmのクリプトンレーザーを励起する488 nmのアルゴンレーザーを使用しています。 FAMおよびTAMRAのための558から580ナノメートルのための500から530 nmのpH応答性足場用の蛍光発光を観察します。 （ 図2）。励起波長のコレクションを回避するために、順次走査を使用しています。
3。 PLGA足場およびpH応答性のPLGA足場上に細胞培養
ntent ">注意：以下は、細胞培養のキャビネットで行ってください。細胞培養のためのPLGA足場の3.1準備
- 2cm 2の断片に、PLGAまたはpH応答性のPLGA足場を切った。
- 15分間8cmの距離で紫外線（UV）光で各側を照射して足場を滅菌する。
- 12穴培養プレートに足場を移し、その上にスチールリングを配置。 （5％v / v）の内側にリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で、スチールリングの外で、一晩インキュベートペニシリン/ストレプトマイシンの溶液を入れる（37℃、5％CO 2）。 2センチメートル外径1cmの内径1cmの深さ：スチールリングは、ノッティンガム大学で生産し、以下の寸法を有したことに注意してください。
- 殺菌溶液を除去し、PBSで洗浄する。
- （500μL）と外側（500μL）スチールリングの、インキュベーター内の場所（37℃、5％CO 2の内部に細胞培養培地を追加
- 細胞懸濁液を調製し、トリパンブルー排除アッセイを用いて細胞数を実行します。
- 1×10 6細胞/ mlの細胞数を達成するために、細胞懸濁液を作成する。
- スチールリングの内側と外側からメディアを取り出します。
- スチールリング（1メートル）の外側に予め温め細胞培養培地に交換してください。
- 細胞を配布するために静かに前後に岩板 - スチールリングの内側に細胞懸濁液を300μlを加える。
- インキュベーター内に細胞培養プレートを置きます（37℃、5％CO 2） - 2〜3日ごとにメディアをリフレッシュ-細胞の接着は、しかし限り、実験が必要と培養を継続し、24時間以内に起きている必要があります。
PLGA足場上に培養細胞に3.2ナノセンサー配信
- セクション3.1で説明したように、PLGA足場の上に種細胞。この研究では、ブランクのPLGA足場（しないcontai寧ナノセンサー）撮影する場合により蛍光発光の重なりに使用された。
- 細胞は前にナノセンサーの配信に足場を通して成長し、移行することができるように72時間インキュベーター（37℃、5％CO 2）への細胞播種足場を置きます。
- 送達をナノセンサーの前に、1時間（37℃、5％CO 2）インキュベートし、PBSで細胞を洗浄し、標準培養培地から抗生物質および無血清培地に培地を変更する。注：3T3細胞のための標準的な培養培地は、ウシ胎仔血清（10％（v / v）で）、L-グルタミン溶液（2mM）を、ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したダルベッコ変法イーグル培地、（1％（v / v）で） 。
- 潜伏期間中に溶液Aを作成するために簡単にのOptimem（50μL）でナノセンサー（5 mg）を超音波処理することによってナノセンサー - リポソーム複合体を準備
- オプティメム（45μl）のにリポフェクタミン2000（5μl）を添加することによって溶液Bを作成し、5分間室温でインキュベートする。
- ソリューションを追加溶液Bに、ナノセンサー - リポソーム複合体である溶液Cを形成するために20分間室温でインキュベートする。
- 細胞に溶液C（100μl）を添加し、3時間（37℃、5％CO 2）インキュベートする。
- インキュベーター、吸引メディアから細胞播種足場を外し、共焦点顕微鏡による生細胞の可視化を可能にするために、PBS（1ミリリットル）を加える前にPBSで2回洗浄します。注：異なるpHでのキャリブレーションが実行されたため、細胞培養培地中に存在するフェノールレッド指示薬はまた、自家蛍光の原因としないようにPBSは、このプロトコルで使用した。しかしながら、フェノールレッドを含まない培地は、細胞培養物の長期的分析のために使用することができる。
- 異なるpHのバッファーに細胞播種された足場を浸し、細胞に関連ナノセンサーの応答を監視します。
- 共焦点顕微鏡を用いて蛍光を観察することによって、FAMとTAMRAの蛍光強度の比を決定することによってのpHiを監視（ ふぃぎゅ再3）。
哺乳動物細胞内で3.3ナノセンサーの場所
- （TAMRAの蛍光発光は、リソトラッカーレッドと同じスペクトル領域であるためである）のセクション3.2で説明したように唯一のFAM色素を含んだナノセンサーで細胞を培養する。セクション1.1ではなく、準備とTAMRAの追加を省略して説明したように、これらのナノセンサーを準備します。
- ナノセンサー納期次の50nmのリソトラッカーレッド原液を希釈。
- PLGA足場上に培養した細胞に希釈した溶液（2μL）の一定量を追加します。
- 1時間リソトラッカーレッドで細胞をインキュベートする（37℃、5％CO 2）。
- インキュベーション期間の後メディアを取り出し、共焦点顕微鏡を用いて観察するための準備でPBS（pH7.4）中（2ml）中にメディアを変更する前に、PBS（pH7.4）で細胞を2回洗浄する。注：フェノールレッドを含まない培地の代わりにPBSを使用することができる。
- 核染色をDraを追加PBSへのQ5は最終的な濃度は、5程度であると3分（37℃、5％CO 2）のための細胞を用いて培養する。それはDRAQ5とのインキュベーション期間の後、メディアを変更する必要がない。
- 650、、唯一のナノセンサーDRAQ5発色団を励起し、500から530ナノメートル、580から600 nmの蛍光を観察するためにリソトラッカーレッドと633 nmのヘリウム/ネオンレーザーを励起する568 nmのクリプトンレーザーをFAMを励起する488 nmのアルゴンレーザーを使用して、それぞれ-750ナノメートル（ 図3）。励起波長のコレクションを回避するために、順次走査を使用しています。
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Representative Results
調製されたpH応答性ナノセンサーのサイズ分布は、撮像されたナノセンサーの集団を測定し、240から470ナノメートル（ 図1A）の範囲のナノメートル寸法を有することが見出されたSEMを用いて特徴付けた。狭いと合理的に小さな直径の達成は、ナノ粒子を調製するためにストーバー法を用いてと一致する。これは、酸性条件を用いて調製粒子サイズの幅広い分散を生成するのに対し、ナノ粒子はストーバー法を用いたナノ粒子の合成中に塩基性のpH環境を用いて調製すなわち 、大きさの良好な制御を可能にすることが見出された。記載された方法を使用して製造PLGAの電界紡糸繊維の代表的なSEM顕微鏡写真を作製PLGA足場は、繊維はナノメートル寸法を有する最小のビーディングや破損を表示する不織布の繊維で構成されていることを実証する図1Bに示されている。 図1C 図1Bの対照試料に匹敵する繊維は、SEM顕微鏡写真は、繊維の表面にナノセンサーの関連の証拠を提供作り出すことを実証しているが、それらはよいまた、足場の繊維内に組み込まれ、これらの足場/ナノセンサー足場の分解研究は、これがナノセンサーの性能に影響を与えるかどうかを決定するためにSEMおよび/または共焦点顕微鏡と組み合わせて行うことができた。
PLGA繊維への組み込み後にそれぞれの光学活性を保持するためのナノセンサーの能力を、共焦点顕微鏡を用いて自己申告足場を調べることによって確認した。足場の繊維に組み込まれたときに、光学的および化学的に活性なままである能力の保持が監視される検体濃度を可能にすることができる。ナノセンサーから発せられる蛍光は、ナノセンサーは、rのことを実証したそれらの光学活性をetained足場繊維に関連している。 pH応答性ナノセンサーに組み込まれた色素FAM（緑）、TAMRA（赤）から発せられた蛍光は、それぞれ、 図2Aおよび2Bに示されている。これは、実現可能な検体濃度がその場で監視することができるようになります肯定的な結果である。また、光学活性なレシオメトリックナノセンサーは、エレクトロスピニング法を使用して、PLGA足場繊維に組み込まれてきたのは初めてだ。ナノセンサーは、PLGAの繊維への取り込み後、蛍光顕微鏡を用いて可視化することができることを確認した、分析物濃度の変化に対するナノセンサー応答が確認された。 TAMRAの参照色素が発する蛍光が著しく変化しなかった一方でpH値の異なるバッファに足場を浸漬すると、FAM色素からの蛍光強度の変化をもたらした。両方の色素の蛍光強度の比は、PRODに使用することができる図2Cに示すように、検量線をUCE。ナノセンサーの検量線だけでは評価され、電界紡糸PLGA足場に組み込まれると匹敵し、ナノセンサーは、自己申告の足場への取り込み後にそれぞれの光学活性を保持していることを示している。可逆的に異なるpH値に応答する自己申告足場の能力を交互に5.5〜7.5のpH値を有する緩衝液中で足場を浸漬することによって評価した。可逆性は自己申告足場はpHの数多くの周期的な変化に対応することができ、図2（d）に示すように、非常に良いことが判明した。長期試験は、ナノセンサーの取り込みの際にPLGAの分解の効果を評価するために実施されていない、それは、ナノセンサーは、レシオメトリックな応答を提供するため、本ナノセンサーの量が結果に影響を及ぼさないであろうと考えられる。
分析対象応答ナノセンサーはliposomを使用して配信された成長のブランクPLGA足場によってサポートされていました3T3線維芽細胞の細胞内環境へのAlトランスフェクション剤。ブランクPLGA足場の際に培養した3T3線維芽細胞の共焦点顕微鏡画像は、ナノセンサーは、それぞれ図3AおよびBに示すFAMとTAMRAの蛍光観察と線維芽細胞と関連していることを示している。これらのチャネルからの蛍光を重ねると、染料は（ 図3Cに黄色の蛍光によって示されるように）ナノセンサー「生体適合性マトリックス内に捕捉され残っていることを示唆している、2の色素からの蛍光が共局在していることを示している。ナノセンサーは、FAMからの共局在化の蛍光の欠如によって証明されるように、酸性のコンパートメント内に含ま3T3線維芽細胞ではなく、細胞質内にあると考えられているだけナノセンサおよび図3Dに示されるリソトラッカーレッド色素。 pH応答性ナノセンサーの蛍光強度を実現細胞は、結果を図3Eに示すpHの変化に供しながら、3T3線維芽細胞へのオピニオンをモニターした。生産のグラフは、エレクトロPLGA足場上に培養した細胞は、6.8から7.0の範囲内のpHiを維持していることを示している。
図1。ナノセンサー、PLGA繊維と自己申告足場のSEM顕微鏡写真 。球状のナノメートルサイズの粒子（B）繊維形態はナノセンサーから突出するように観察することができ、最小限のビーズや破損（C）pH応答性自己申告足場に規則的であるのPLGAエレクトロ不織布繊維を示す（A）の pH応答性ゾル-ゲルナノセンサーPLGAまだ繊維の形態はnanos値を含まない対照PLGA繊維と同等のままensors。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図2。蛍光は、PLGA足場繊維に関連するナノセンサーから観察することができるpH応答性自己申告足場の共焦点顕微鏡像（A）、FAM（緑）pH応答性染料と、（B）、TAMRA（赤）の基準色素。 （C）pH応答性ゾル-ゲルナノセンサー及びpH応答性足場の較正グラフはdemonstPLGA足場繊維内に組み込まれた際にナノセンサーの光学的および化学的応答が影響を受けていないことを相場。 （D）は、pH 5.5およびpH 7.5の代わりの緩衝溶液中で足場を浸漬することにより行わ自己申告足場の可逆性。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図3。細胞内在化ナノセンサーとpHとのpHi応答のグラフ。蛍光の共焦点顕微鏡画像内在化ナノセンサーからの（A）、FAM（緑）、（B）、TAMRA（赤）（C）FAMとTAMRAからの蛍光の共局在（黄色）（ D）は 、FAMはナノセンサー（緑）3T3繊維芽細胞の培養液に配信核のDRAQ5（マゼンタ）標識化およびリソソームのリソトラッカーレッド（赤）を標識したPLGA足場の際にD。 FAMおよびリソトラッカーレッドのfluoresenceしたがって、それがナノセンサーは、（E）ファイ測定はpHの校正に比べて、ブランクのPLGA足場上に培養した3T3線維芽細胞に配信ナノセンサーから取った細胞の酸性コンパートメントに内在化されたことはほとんどありませんことを実証する共同ローカライズされていません細胞の培養せずにpH検知足場の。これはまた、pH測定は、エレクトロPLGA足場上に培養した細胞は、6.8から7.0の範囲内のpHiを維持しているように内在化ナノセンサーが酸性でない使用して実行することを示している。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
組織工学は、特定の組織または器官の機能を修復、交換、維持または増強するためにインビトロでの組織モデルのようなin vivoおよび組織置換療法における両方として使用することができる生物学的代替物を作り出すことを目指し。合成代替物は、組織の修復を置き換えるか援助するために長年使用されてきたが、これらは多くの場合、最終的には拒絶またはさらなる修正手術につながる宿主組織および/または感染貧統合によるフェイル。移植前に実験室で生体組織を生成する完全な統合を達成するための問題に対処し、修正手術の必要性を減らすことができる。しかし、実現するために、この目標のために、適切なin vitroで増殖し、3D構造内の細胞の操作は、in vitroでの組織の適切な物理的条件付けと連結する必要があります。これは、一つの基本的な生物学の研究を継続することである多数の方法で達成することができる関与だけでなく、合成代替の生産に関連エンジニアリングと製造の問題を研究する。それが説明されたプロトコルが貢献することを目指していることを、この後者の問題です。
記載PLGA足場の使用目的は、生物学的に関連する構造にその成長を支援するために哺乳動物細胞に一時的な支持を提供することである。 PLGA足場への検体応答ナノセンサーの組み込みは、地元の検体濃度が組織の成長プロセスの間に、3D構造体を通してモニターされる可能性があります。 pH応答性足場の使用は、副生成物の足場が分解すると、細胞として生産酸性が効果的な3D構造内から削除される増殖するかどうかの決定を可能にすることができます。これは、プロセスの監視およびインビトロ組織再生プロセスにおける制御の現在の不足に対処する第一歩である。自身がデバイスを検出している足場の使用率がで可能にすることができるその場でリアルタイム微小環境アセスメント。組織を損傷することなく、構造の微小環境を監視することは不可欠であり、組織の生産のすべての段階でのプロセス監視が可能になります。
局所分析物濃度を報告する産pH応答性足場の能力を、共焦点顕微鏡を用いて蛍光ナノセンサーからの出力を監視することによって評価した。較正実験は、pH検知のための足場を行い、PLGA繊維に組み込まれていないpH応答性ナノセンサーに匹敵する証明された。較正曲線を生成する能力は、ナノセンサーは、足場の滅菌工程が、pHナノセンサーの感知能力に有害な影響を引き起こさなかったこともまたポリマー骨格に組み込まれ、pHの変化に応答して残ることを示している。さらに、ナノセンサーは、PLGA足場上に培養した細胞の細胞内環境に配信されたWHERpHiは変化への電子の細胞応答をモニターすることができる。 FAMとTAMRAの蛍光強度の比は、pHiはをモニターするために使用し、pH応答性足場に比べ、3T3線維芽細胞は、pHが6.8から7の範囲内のpHiを維持していることを示唆した。核染色DRAQ5とナノセンサーをトランスフェクションした3T3線維芽細胞を培養すると、細胞の大半は関連するナノセンサーは、核領域に位置していなかったことが示された。ナノセンサーの場所は、FAMおよびリソトラッカーレッドの共局在を共焦点画像で黄色の画素によって描かれるであろうリソトラッカーレッド、との3T3繊維芽細胞をトランスフェクトナノセンサーをインキュベートすることにより決定されるようなエンドソームやリソソームの酸性の区画内にあることが表示されません。例えば、透過型電子顕微鏡（TEM）による分析及び内在化経路のための生物学的マーカーの同定、さらなる研究は、このさらなる確認できた。このような時間分解共焦点顕微鏡のようなまた、長期試験自己申告の足場上に培養された細胞内のナノセンサーの長期的な運命を決定することができる。ナノセンサーは、他の細胞型に送達されるならば、次いで、それらの位置は、結果として、識別されるべきであるここに示したものと同じでなくてもよい。
自己申告足場の使用は、非侵襲的に組織工学構造内微小環境条件を監視する可能性を秘めている。 その場測定で実行する機能を有する非侵襲的かつリアルタイムでin vitroで 3次元組織構築物の成長を最適化する可能性があります。 pH応答性ナノセンサーの細胞質の場所は、現在進行中の実験中のpHiを監視するために利用することができる。ナノセンサーは、細胞又は自己申告足場の内部環境に送達、静的または動的な組織培養システム内で使用することができ、 組織工学構築物の最適な成長に必要な培養条件を決定することにつながる可能性が試験管。さらなる開発は、最終的には組織構築の培養に再現性の高い方法を与え、構造物全体の栄養と酸素の安定供給を確保し、栄養枯渇作用オンラインシステムにつながることができます。
記載されたプロトコルは、構築物内のより深いイメージングを可能にするために必要とされ得るより大きな次元を可能にするために、しかしながら、共焦点顕微鏡を用いたイメージングは、多光子励起を撮像すべき構築を可能にするのに適した寸法を有する足場を準備した。このような顕微鏡レンズとして使用される光学機器は、レンズと構築次元の最適な作動距離を決定するために選択されるべきである。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
BBSRCからの資金調達が親切に認識されている（認可番号B-H011293 / 1）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Fisher | 32221 | |
| Anhydrous dimethylformamide (DMF) | Sigma | 270547 | |
| Ammonium hydroxide 50% (v/v) aqueous solution | Alfa Aesar | 35574 | diluted to 30% (v/v) with pure water |
| TEOS | Sigma | 13190-3 | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma | A3648 | |
| 5-(and-6)-carboxyfluorescein, succinimidyl ester (FAM-SE) | Invitrogen | C1311 | |
| 6-carboxytetramethylrhodamine, succinimidyl ester (TAMRA-SE) | Invitrogen | C1171 | |
| Sodium phosphate monobasic (0.2 M) | Sigma Aldrich | S-9638 | |
| Sodium phosphate dibasic (0.2 M) | Sigma Aldrich | S-0876 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | S8045 | |
| Trypsin/EDTA | Sigma Aldrich | T4174 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6046 | |
| FBS | Source Bioscience | Batch-213-101992 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Optimem | Invitrogen | 11058-021 | |
| LysoTracker Red | Invitrogen | L-7528 | |
| Draq5 | Biostatus Ltd | DR50050 | |
| Nitrogen gas | BOC | ||
| DCM | Sigma Aldrich | 320269 | |
| TFA | Sigma Aldrich | T6508 | |
| Confocal microscope | Leica TCS-SP | equipped with argon and krypton lasers and a 63X 0.9NA water immersion lens | |
| UV light | UVLS28 UVP, USA | ||
| Stirrer plate | SB161-3 Jencons-PLS | ||
| pH meter | Jenway model 3510 | ||
| Rotary Evaporator | Buchi Rotary Evaporator R200 | ||
| Centrifuge (nanosensors) | Hermle Z300 | ||
| Centrifuge (cell culture) | Thermo Scientific Heraeus Biofuge Primo | ||
| Vortex | Whirlimixer Fisherbrand | ||
| Ultrasonicator | FB11021 Fisherbrand | ||
| Aluminum sheet | Nottingham University | ||
| 35mm cell culture plate | Iwaki | 3000035 | |
| 10 ml syringe | Becton Dickenson | ||
| 3T3 Fibroblast cells | European Collection of Cell Cultures | ||
| PLGA | Lakeshore Biomaterials | 7525 DLG 7E | |
| Pyridinium formate | Sigma Aldrich | P8535 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S5136 | |
| HCl | Sigma Aldrich | 320331 |
References
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