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Bioengineering

3 आयामी सेल संस्कृति के लिए स्वयं रिपोर्टिंग Scaffolds

Published: November 7, 2013 doi: 10.3791/50608
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1School of Molecular Medical Sciences, University of Nottingham, 2Division of Drug Delivery and Tissue Engineering, University of Nottingham, 3Laboratory of Biophysics and Surface Analysis, University of Nottingham

Summary

Biocompatible पीएच उत्तरदायी जेल प nanosensors पाली (लैक्टिक सह एसिड) (PLGA) electrospun scaffolds में शामिल किया जा सकता है. उत्पादित आत्म रिपोर्टिंग scaffolds पाड़ पर संवर्धन कोशिकाओं whilst के microenvironmental शर्तों के सीटू निगरानी में के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. 3 डी सेलुलर निर्माण प्रयोग परेशान बिना वास्तविक समय में निगरानी रखी जा सकता है के रूप में यह फायदेमंद है.

Abstract

उचित scaffolds पर 3 डी में संवर्धन कोशिकाओं बेहतर vivo में microenvironment नकल और सेल सेल बातचीत को बढ़ाने के लिए सोचा है. परिणामस्वरूप 3D सेलुलर निर्माण अक्सर 2D में अध्ययन इसी तरह के प्रयोगों से आणविक घटनाओं और सेल सेल बातचीत का अध्ययन करने के लिए और अधिक प्रासंगिक हो सकता है. पाड़ भर में उच्च सेल व्यवहार्यता के साथ प्रभावी 3 डी संस्कृतियों बनाने के लिए इस तरह ऑक्सीजन और ध्यान से analyte एकाग्रता में ढ़ाल के रूप में नियंत्रित किया जा पीएच जरूरत के रूप में संस्कृति की स्थिति में 3 डी निर्माण के दौरान मौजूद कर सकते हैं. यहाँ हम पाली स्तनधारी कोशिकाओं की संस्कृति के लिए उनके बाद तैयारी के साथ (लैक्टिक सह एसिड) (PLGA) electrospun scaffolds में biocompatible पीएच उत्तरदायी जेल प nanosensors और उनके समावेश तैयारी की विधियों का वर्णन. पीएच उत्तरदायी scaffolds एक 3 डी सेलुलर निर्माण के भीतर microenvironmental पीएच का निर्धारण करने के लिए उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, विस्तार पीएच उत्तरदायी nanose की डिलिवरी हमजिसका विकास electrospun PLGA scaffolds के द्वारा समर्थित किया गया स्तनधारी कोशिकाओं के intracellular पर्यावरण के लिए nsors. पीएच उत्तरदायी nanosensors के cytoplasmic स्थान चल रहे प्रयोगों के दौरान intracellular पीएच (पीएचआई) की निगरानी के लिए उपयोग किया जा सकता है.

Introduction

ऊतक इंजीनियरिंग में एक प्रमुख रणनीति जिसका आकारिकी इसे बदलने के लिए जा रहा है कि ऊतक जैसा दिखता है और यह भी सेल के विकास और समारोह 1,2 समर्थन करने में सक्षम है scaffolds के निर्माण के लिए biocompatible सामग्री का इस्तेमाल होता है. पाड़ सेल लगाव और प्रसार अभी तक एक 3 डी सेलुलर निर्माण की interstices भर में सेल प्रवास की अनुमति देता है की अनुमति देकर यांत्रिक सहायता प्रदान करता है. पाड़ भी सेल पोषक तत्वों की बड़े पैमाने पर परिवहन के लिए अनुमति देते हैं और चयापचय बर्बाद 3 को हटाने को बाधित नहीं करना चाहिए.

Electrospinning सेलुलर वृद्धि 4-6 समर्थन करने में सक्षम polymeric scaffolds के निर्माण के लिए एक होनहार पद्धति के रूप में उभरा है. वे अक्सर असुरक्षित हैं और एक 3 डी सेलुलर निर्माण 7 की interstices भर में सेल सेल बातचीत के साथ ही सेल प्रवास की अनुमति के रूप में उत्पादन nonwoven electrospun फाइबर सेल के विकास के लिए उपयुक्त हैं. यह टी के दौरान सेल व्यवहार्यता पर नजर रखने के लिए महत्वपूर्ण हैवह संस्कृति की अवधि और उस सेल व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए 3 डी निर्माण की पूरी भर में बनाए रखा है. Analyte एकाग्रता में ढ़ाल 3 डी का निर्माण भीतर मौजूद कर सकते हैं के रूप में उदाहरण के लिए, जैसे ऑक्सीजन और पीएच के रूप में संस्कृति की स्थिति, सावधान नियंत्रण की आवश्यकता होती है. बायोरिएक्टर या छिड़काव सिस्टम बीचवाला प्रवाह के vivo परिस्थितियों में और एक परिणाम वृद्धि पोषक हस्तांतरण और चयापचय कचरे को हटाने के रूप में 8 की नकल करने के लिए नियोजित किया जा सकता है. इस तरह की व्यवस्था लगातार microenvironmental स्थितियां सुनिश्चित कर रहे हैं के सवाल का वास्तविक समय में सेलुलर microenvironment का आकलन करने से संबोधित किया जा सकता है.

वास्तविक समय में निगरानी रखी जा सकता है कि कुंजी microenvironment मेट्रिक्स में शामिल हैं: तापमान, सेल मीडिया की रासायनिक संरचना, भंग ऑक्सीजन और कार्बन डाइऑक्साइड की एकाग्रता, पीएच, और आर्द्रता. इन मेट्रिक्स के, तापमान सबसे आसानी से सीटू जांच में उपयोग पर नजर रखी जा सकती है. सामान्यतः में शेष सूचीबद्ध मेट्रिक्स की निगरानी के लिए तरीकेइसलिए Volve नमूना लेने के लिए एक विभाज्य को हटाने और सेल संस्कृति परेशान और प्रदूषण खतरे को बढ़ा. सतत, वास्तविक समय तरीकों की मांग की जा रही है. वर्तमान निगरानी तरीकों आमतौर पर शारीरिक रूप से इस तरह के एक पीएच मॉनिटर या ऑक्सीजन जांच के रूप में सेलुलर निर्माण की जांच कि उपकरणों पर भरोसा करते हैं. हालांकि, इन घुसपैठ तरीकों सेलुलर निर्माण को नुकसान और चल रहे प्रयोग को परेशान कर सकते हैं. 3 डी का निर्माण भीतर analyte सांद्रता के noninvasive निगरानी ऐसे पोषक तत्व रिक्तीकरण 9 के रूप में विभिन्न पर्यावरणीय पहलुओं की वास्तविक समय की निगरानी सक्षम हो सकता है. इस ढांचे के भीतर गहरी क्षेत्रों के लिए पोषक तत्वों की आपूर्ति के मूल्यांकन की अनुमति है और चयापचय बर्बाद प्रभावी ढंग से 10,11 हटाया जा रहा था कि क्या यह निर्धारित होगा. Invasiveness के मुद्दे का समाधान करने का प्रयास है कि सिस्टम सामान्य तौर पर पीएच, ऑक्सीजन की निगरानी और 12 ग्लूकोज संस्कृति पोत दोनों के माध्यम से और बाहरी सेंसर करने के लिए संस्कृति के माध्यम से गुजरता है कि एक छिड़काव चैम्बर के इस्तेमाल को शामिल.पुन सीधे नमूना लेने के लिए एक विभाज्य को हटाने की आवश्यकता नहीं है और इस तरह के रूप में सीटू की निगरानी में प्रदान करेगा कि संस्कृति बर्तन में एकीकृत किया जा सकता है कि सेंसर को विकसित करने में रुचि बढ़ रही है.

सीटू और हम स्वयं रिपोर्टिंग scaffolds के 13 निर्माण करने के लिए electrospun scaffolds में analyte उत्तरदायी nanosensors शामिल किया है microenvironmental शर्तों के noninvasive निगरानी में के लिए इस तरह की कमियों को संबोधित करने के लिए. संवेदन डिवाइस electrospinning द्वारा या पूर्व पाड़ गठन 14,15 बहुलक में शामिल किया है जो एक analyte संवेदनशील डाई के प्रयोग के माध्यम से बनाया वास्तविक polymeric पाड़ या तो था जहां प्रतिदीप्ति गतिविधि की निगरानी के द्वारा के रूप में संवेदी उपकरणों कि अधिनियम scaffolds, पहले से तैयार किया गया है . हालांकि, इन संवेदी उपकरणों अन्य analytes से संभावित हस्तक्षेप की वजह से गलत ऑप्टिकल outputs देने की क्षमता है. एक ratiometric संवेदन डिवाइस सु का उपयोगवर्णित प्रोटोकॉल में तैयार उन के रूप में चर्चा इन संभव प्रतिकूल प्रभाव को खत्म करने और प्रश्न में analyte के लिए विशिष्ट एक प्रतिक्रिया प्रदान करने की क्षमता रखती है.

यहाँ प्रस्तुत electrospun scaffolds के कारण चयनित, सिंथेटिक सह बहुलक पाली (लैक्टिक सह एसिड) (PLGA) से तैयार किया गया है खाद्य एवं औषधि इसके biodegradable और biocompatible गुणों के कारण प्रशासन (एफडीए) की मंजूरी, और एक ट्रैक होने विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं 16-18 के विकास और समारोह का समर्थन करने का रिकॉर्ड है. तैयार ratiometric analyte उत्तरदायी nanosensors पीएच के लिए उत्तरदायी हैं. nanosensors एक डाई, परिवार पीएच को उत्तरदायी और अन्य है, जहां एक biocompatible प मैट्रिक्स जेल में दो फ्लोरोसेंट रंगों को शामिल सूत्रों का कहना है कि यह पीएच के लिए उत्तरदायी नहीं है के रूप में एक आंतरिक मानक के रूप में कार्य करता है. वे काफी ओवरलैप नहीं है के रूप में इसके अलावा परिवार और Tamra दोनों की प्रतिदीप्ति अलग से विश्लेषण किया जा सकता है. प्रतिदीप्ति ईएमआई के अनुपात का निर्धारणविशिष्ट तरंगदैर्य पर दोनों रंगों के ssion अन्य पर्यावरणीय स्थितियों के स्वतंत्र पीएच प्रतिक्रिया देता है. आत्म - रिपोर्टिंग scaffolds विकसित 3 डी मॉडल में खलल न डालें बिना बगल में और वास्तविक समय में पीएच का दोहरा मूल्यांकन अनुमति दे सकता है. हम इन scaffolds सेल लगाव और प्रसार का समर्थन करने में सक्षम हैं और प्रश्न में analyte के लिए उत्तरदायी रहते हैं कि प्रदर्शन किया है. इंजीनियर निर्माणों में द्वारा उत्पादों अम्लीय के कैनेटीक्स understudied बनी हुई है और इस तरह के रूप में पीएच उत्तरदायी scaffolds का उपयोग बहुत तरह के अध्ययन में 19 की सुविधा सकता है. इसके अलावा, ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए आत्म - रिपोर्टिंग scaffolds के उपयोग का अवसर पूरी तरह से समझने की निगरानी और इन विट्रो में 3 डी मॉडल ऊतक निर्माणों का विकास, noninvasively और वास्तविक समय में अनुकूलन करने के लिए प्रस्तुत करता है.

पीएच उत्तरदायी nanosensors भी electrospun PLGA scaffol पर सुसंस्कृत fibroblasts के intracellular पर्यावरण के लिए दिया गया हैडी एस. रंगों से प्रतिदीप्ति उत्सर्जन का अनुपात फ़ाई पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया और एक आत्म रिपोर्टिंग पाड़ शामिल पीएच nanosensors की तुलना में थे. एक 3 डी वातावरण में संवर्धित कोशिकाओं को nanosensors के वितरण गहरी एक nondestructive ढंग से निर्माण के भीतर analyte एकाग्रता की निगरानी सक्षम हो सकता है. इसलिए nanosensors nondestructively 3D भर में सेल व्यवहार का आकलन करने के लिए एक व्यवहार्य इमेजिंग उपकरण लंबी अवधि के विश्लेषण की अनुमति constructs हो सकता है. एक 3 डी निर्माण के भीतर व्यक्ति की कोशिकाओं की analyte एकाग्रता स्क्रीनिंग वे पर्याप्त पोषक तत्व और ऑक्सीजन सांद्रता प्राप्त कर रहे हैं कि सुनिश्चित कर सके. निगरानी प्रक्रिया पैरामीटर ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की प्रभावी जन परिवहन के लिए मानकीकृत तकनीक के विकास में सहायता कर सकता है. intracellular वातावरण और polymeric scaffolds में nanosensors का समावेश करने के लिए nanosensors के वितरण 3D const भीतर सेल व्यवहार्यता का आकलन करने के साथ ही पाड़ प्रदर्शन की अनुमति के लिए जोड़ा जा सकता हैऊतक विकास की प्रक्रिया के दौरान ructs. यह इन निर्माणों की वृद्धि हुई ज्ञान के लिए नेतृत्व और जैविक रूप से प्रासंगिक ऊतक के विकल्प का निर्माण प्रगति कर सकते हैं.

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Protocol

अवलोकन

धारा 1 पीएच उत्तरदायी nanosensors और SEM का उपयोग कर प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोमेट्री और उनके आकार का उपयोग पीएच को nanosensor प्रतिक्रिया के लक्षण वर्णन की तैयारी का वर्णन है.

धारा 2 electrospun बहुलक scaffolds और SEM का उपयोग उनके आकारिकी और आकार के लक्षण वर्णन की तैयारी का वर्णन है. धारा 2 भी पीएच उत्तरदायी nanosensors के शामिल किए जाने के साथ electrospun scaffolds हैं जो स्वयं रिपोर्टिंग scaffolds की तैयारी का वर्णन. परिणामस्वरूप स्वयं रिपोर्टिंग scaffolds electrospun फाइबर में किसी भी morphological परिवर्तन आ गई है कि आकलन है कि SEM की विशेषता है. शामिल nanosensors से उत्पन्न आत्म रिपोर्टिंग scaffolds से प्रतिदीप्ति confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन किया है.

धारा 3 electrospun पाड़ और आत्म रिपोर्टिंग पाड़ पर कोशिकाओं की संस्कृति का वर्णन करता है. scaffolds पहले preparat में निष्फल रहे हैंscaffolds नसबंदी और कोशिकाओं की संस्कृति आत्म रिपोर्टिंग scaffolds के प्रतिदीप्ति क्षमता को प्रभावित निर्धारित करें कि क्या मूल्यांकन कर रहे हैं, जो सेल संस्कृति निम्नलिखित के लिए आयन. प्रोटोकॉल भी electrospun scaffolds पर सुसंस्कृत हैं कि कोशिकाओं को nanosensors के वितरण का वर्णन करता है. Lysotracker डाई nanosensors सेलुलर अम्लीय डिब्बों में नहीं लिया गया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग किया जाता है.

1. तैयारी और पीएच उत्तरदायी जेल प Nanosensors का विश्लेषण

पीएच उत्तरदायी जेल प nanosensors के 1.1 तैयारी

नोट: यह तैयारी एक धूआं हुड में प्रदर्शन किया जाना चाहिए.

  1. (और -6) carboxyfluorescein, succinimidyl एस्टर dimethylformamide में (परिवार एसई) (1.5 मिलीग्राम) (DMF) (1 मिलीलीटर) एक दौर में कुप्पी और 6 carboxytetramethylrhodamine तली - 5 भंग करके पीएच nanosensors के भीतर उपयोग के लिए fluorophores की तैयारी , दूसरे दौर में succinimidyl एस्टर DMF में (Tamra-एसई) (1.5 मिलीग्राम) (1 मिलीलीटर) कुप्पी तली.प्रत्येक कुप्पी 3 aminopropyltriethoxysilane (APTES) (1.5 एमएल) जोड़ें और अंधेरे में 24 घंटे के लिए एक सूखी नाइट्रोजन वातावरण (21 डिग्री सेल्सियस) के तहत हलचल यानी पन्नी में नमूने लपेटो.
  2. एक दौर तली फ्लास्क में निहित इथेनॉल का एक मिश्रण (6 मिलीग्राम) और अमोनियम हाइड्रॉक्साइड (30% wt, 4 मिलीग्राम) के लिए ऊपर रंजक (250 μl) के दोनों जोडें और 1 घंटा (21 डिग्री सेल्सियस) के लिए हलचल.
  3. धीरे धीरे एक और 2 घंटे के लिए सरगर्मी जारी, मिश्रण को tetraethylorthosilicate (TEOS) (0.5 मिलीलीटर) जोड़ें. मिश्रण बादल छाए रहेंगे बंद हो जाएगा. nanosensors रोटरी वाष्पीकरण द्वारा एकत्र किया जा सकता है. Nanosensors भविष्य में उपयोग के लिए 4 ओ सी में एक कांच की शीशी में संग्रहित किया जा सकता है.

    चेतावनी: उनके शुष्क रूप में nanosensors के आगे से निपटने के एक धूआं हुड में या संतुलन एक Weighsafe में उदाहरण के लिए, संलग्न किया जाना चाहिए उन्हें वजन के मामले में किया जाना चाहिए.

पीएच 1.2 Nanosensor रिस्पांस

  1. Mixi से पीएच 5.5-8.0 से लेकर सॉरेनसेन के फॉस्फेट बफर समाधान तैयारसोडियम फॉस्फेट अकेले आधार (0.2 एम) और सोडियम फास्फेट द्विक्षारकीय (0.2 एम) स्टॉक समाधान की एनजी विशिष्ट अनुपात. एक पीएच मीटर का उपयोग कर अंतिम पीएच की जाँच करें. सोडियम हाइड्रोक्साइड (NaOH) (4 मीटर) या हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल) (2 एम) का उपयोग पीएच के लिए किसी भी मामूली समायोजन करें.
  2. समाधान बादल बन जाता है जब तक सबसे पहले तो एक ultrasonicator में पोत डूब 3 मिनट के लिए एक भंवर पर nanosensor समाधान युक्त पोत धारण करके पीएच बफ़र्स (5 मिलीग्राम / एमएल) में पीएच nanosensors निलंबित (लगभग 5 मिनट). पूरी तरह से समाधान में nanosensors निलंबित करने के लिए इन चरणों को दोहराएँ.
  3. एक ऑप्टिकल क्युवेट में पहली समाधान प्लेस और 5 के लिए 488 एनएम उत्तेजना तरंग दैर्ध्य का उपयोग करें - (और -6) carboxyfluorescein (परिवार) और 6 carboxytetramethylrhodamine (Tamra) के लिए 568 एनएम. परिवार और Tamra एक प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग के लिए 558-580 एनएम के लिए 500-530 एनएम उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य लीजिए.
  4. पीएच अलग पीएच पर देखा जा सकता है कि इतने ऑप्टिकल क्युवेट में समाधान बदलें और सी के लिए जारीउत्सर्जन स्पेक्ट्रा ollecting.
  5. एक अंशांकन वक्र का उत्पादन करने के लिए प्रत्येक पीएच मूल्य पर उत्पादित उत्सर्जन Maxima के अनुपात की गणना.

Nanosensors के 1.3 SEM

  1. एक कार्बन लेपित इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप ठूंठ पर nanosensors का एक नमूना प्लेस और एक आर्गन वातावरण के तहत 5 मिनट के लिए सोने के साथ कोट धूम.
  2. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) स्कैनिंग द्वारा निरीक्षण करें. इलेक्ट्रॉन चार्ज (चित्रा 1) कम करने के लिए काम दूरी, वोल्टेज और बढ़ाई समायोजित इमेजिंग के दौरान.

2. PLGA scaffolds के तैयार करने और विश्लेषण

2.1 Electrospinning PLGA Scaffolds

  1. एक धूआं हुड में पाली pyridinium फार्मेट साथ dichloromethane में (लैक्टिक सह एसिड) (PLGA) (डीसीएम) (20% (डब्ल्यू / डब्ल्यू)) (पीएफ) (1% (डब्ल्यू / डब्ल्यू)) को भंग. एक 18 जी कुंद भरण सुई और एक सिरिंज पंप करने के लिए सुरक्षित रूप से फिट के साथ एक 10 मिलीलीटर सिरिंज में समाधान रखें.
  2. 20 सेमी की दूरी पर एक 20 से सुई टिप दूरीसेमी x 15 सेमी एल्यूमीनियम एकत्रित थाली.
  3. एल्यूमीनियम का संग्रह प्लेट के लिए सिरिंज और पृथ्वी की टिप करने के लिए एक उच्च वोल्टेज बिजली की आपूर्ति की इलेक्ट्रोड संलग्न.

    चेतावनी: देखभाल के रूप में उच्च वोल्टेज यानी हमेशा electrospinning उपकरणों के किसी संभालने से पहले बिजली की आपूर्ति बंद करने के लिए किया जाता है लिया जाना चाहिए.
  4. 2 घंटे के लिए 12 केवी पर 3.5 मीटर / घंटा के एक निरंतर प्रवाह दर का उपयोग कर समाधान उद्धार. इन शर्तों का उपयोग electrospinning लगभग 60 माइक्रोन की एक पाड़ गहराई दे देंगे.
  5. विलायक अवशेषों लुप्त हो जाना करने की अनुमति के लिए 24 घंटे के लिए एक धूआं हुड में पाड़ छोड़ दें.

2.2 Electrospinning पीएच उत्तरदायी PLGA Scaffolds

  1. 2.1 धारा में लेकिन बहुलक समाधान (5 मिलीग्राम / एमएल) के लिए nanosensors जोड़ने के संशोधन के साथ वर्णित के रूप में पीएच उत्तरदायी nanosensors शामिल scaffolds तैयार करें. Ultrasonication की सहायता से PLGA समाधान में nanosensors निलंबित (लगभग 5 मिनट) से पहले एक 10 एमएल सिरिंज में रखने के लिए.

2.3 PLGA पाड़ के SEM और पीएच उत्तरदायी पाड़

  1. एक कार्बन लेपित इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप ठूंठ पर PLGA पाड़ या पीएच उत्तरदायी पाड़ का एक नमूना प्लेस और nanosensors के SEM (चित्रा 1) के लिए वर्णित के रूप में आगे बढ़ना.

पीएच उत्तरदायी पाड़ के 2.4 कैलिब्रेशन

  1. एक 35 मिमी संस्कृति की थाली में पीएच उत्तरदायी पाड़ का एक नमूना प्लेस और उचित बफर समाधान में विसर्जित कर दिया.
  2. एक confocal खुर्दबीन पर nanosensors भीतर Tamra उत्तेजित करने के लिए परिवार और एक 568 एनएम क्रिप्टन लेजर उत्तेजित करने के लिए एक 488 एनएम आर्गन लेजर का उपयोग करें. परिवार और Tamra के लिए 558-580 एनएम के लिए 500-530 एनएम पर पीएच उत्तरदायी scaffolds के लिए प्रतिदीप्ति उत्सर्जन को ध्यान से देखें. (चित्रा 2). उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के संग्रह से बचने के लिए अनुक्रमिक स्कैनिंग का प्रयोग करें.

3. PLGA scaffolds और पीएच उत्तरदायी PLGA Scaffolds पर सेल संस्कृति

ntent "> नोट: निम्न एक सेल संस्कृति कैबिनेट में प्रदर्शन किया जाना चाहिए.

सेल संस्कृति के लिए PLGA scaffolds के 3.1 तैयारी

  1. 2 सेमी 2 टुकड़ों में PLGA या पीएच उत्तरदायी PLGA scaffolds काटें.
  2. 15 मिनट प्रत्येक पक्ष के लिए 8 सेमी की दूरी पर पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश के साथ irradiating द्वारा scaffolds के जीवाणुरहित.
  3. 12 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली के लिए scaffolds के स्थानांतरण और शीर्ष पर एक स्टील की अंगूठी जगह है. (5% v / v) के अंदर फॉस्फेट buffered खारा (पीबीएस) में और स्टील की अंगूठी के बाहर, रातोंरात सेते पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन का एक समाधान जोड़ें (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2). 2 सेमी बाहरी व्यास, 1 सेमी भीतरी व्यास, 1 सेमी गहराई: स्टील की अंगूठी नॉटिंघम विश्वविद्यालय में निर्मित और निम्न आयाम दिया गया था नोट.
  4. स्टरलाइज़ समाधान निकालें और पीबीएस के साथ धो लो.
  5. (500 μl) और बाहर (500 μl) स्टील की अंगूठी की, एक मशीन में जगह (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 के अंदर करने के लिए सेल संस्कृति मीडिया जोड़ें
  6. एक सेल निलंबन की तैयारी और एक Trypan ब्लू बहिष्कार परख का उपयोग कर एक कोशिका गिनती प्रदर्शन करते हैं.
  7. 1 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक सेल नंबर प्राप्त करने के लिए एक सेल निलंबन बनाएँ.
  8. इस्पात रिंग के अंदर और बाहर से मीडिया निकालें.
  9. स्टील की अंगूठी (1 मीटर) के बाहर पर prewarmed सेल संस्कृति मीडिया के साथ बदलें.
  10. स्टील की अंगूठी के अंदर करने के लिए सेल निलंबन के 300 μl जोड़ें - रॉक थाली पीछे और आगे धीरे कोशिकाओं को वितरित करने के लिए.
  11. एक मशीन में सेल संस्कृति थाली प्लेस (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) - हर 2-3 दिनों मीडिया को रीफ्रेश - सेल लगाव तथापि के रूप में लंबे समय तक प्रयोग की आवश्यकता के रूप में के लिए संस्कृति के लिए जारी, 24 घंटा के भीतर जगह ले जाना चाहिए था.

PLGA पाड़ पर संवर्धित कोशिकाओं को 3.2 Nanosensor डिलिवरी

  1. धारा 3.1 में वर्णित के रूप में PLGA पाड़ पर बीज कोशिकाओं. यह अध्ययन एक रिक्त PLGA पाड़ (नहीं contai के लिएजब इमेजिंग निंग nanosensors) की वजह से प्रतिदीप्ति उत्सर्जन की ओवरलैप करने के लिए इस्तेमाल किया गया था.
  2. (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) 72 घंटे के लिए कोशिकाओं वितरण nanosensor करने से पहले पाड़ भर में बड़े होते हैं और विस्थापित करने की अनुमति देने के लिए एक मशीन में सेल वरीयता प्राप्त पाड़ रखें.
  3. प्रसव nanosensor से पहले 1 घंटे के लिए (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) सेते हैं, पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोने और मानक संस्कृति मीडिया से एंटीबायोटिक और सीरम मुक्त मीडिया के लिए मीडिया बदलें. नोट: 3T3 कोशिकाओं के लिए मानक संस्कृति मीडिया भ्रूण बछड़ा सीरम (10% (v / v)), एल glutamine समाधान (2 मिमी), पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम शामिल हैं (1% (v / v)) .
  4. ऊष्मायन अवधि के दौरान संक्षिप्त समाधान ए बनाने के लिए Optimem (50 μl) के साथ nanosensors (5 मिलीग्राम) sonicating द्वारा nanosensor-liposome जटिल तैयार
  5. Optimem (45 μl) को 2000 Lipofectamine (5 μl) जोड़कर समाधान बी बनाएँ, 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
  6. समाधान जोड़ेंएक समाधान करने के लिए बी, nanosensor-liposome जटिल है जो समाधान सी फार्म को 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
  7. कोशिकाओं का हल सी (100 μl) जोड़ें और 3 घंटे के लिए (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) सेते हैं.
  8. इनक्यूबेटर, महाप्राण मीडिया से सेल वरीयता प्राप्त scaffolds निकालें और confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा जीवित कोशिका दृश्य की अनुमति पीबीएस (1 मिलीलीटर) जोड़ने से पहले पीबीएस के साथ दो बार धोने. नोट: अलग पीएच पर एक अंशांकन प्रदर्शन किया जा रहा था क्योंकि सेल संस्कृति मीडिया में उपस्थित फिनोल लाल सूचक भी autofluorescence का कारण है और नहीं था कि इतना पीबीएस इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया गया था. हालांकि फिनोल लाल स्वतंत्र मीडिया सेल संस्कृतियों की लंबी अवधि के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  9. विभिन्न पीएच के बफ़र्स में सेल वरीयता प्राप्त पाड़ विसर्जित कर दिया और कोशिकाओं के साथ जुड़े nanosensors की प्रतिक्रिया पर नजर.
  10. Confocal माइक्रोस्कोपी (figu का उपयोग कर प्रतिदीप्ति देख कर परिवार और Tamra से प्रतिदीप्ति तीव्रता के अनुपात का निर्धारण करके फ़ाई मॉनिटरपुन 3).

स्तनधारी कोशिकाओं के भीतर 3.3 Nanosensor स्थान

  1. के रूप में धारा 3.2 में वर्णित केवल परिवार डाई (Tamra के प्रतिदीप्ति उत्सर्जन LysoTracker लाल के रूप में एक ही वर्णक्रम क्षेत्र में है क्योंकि यह है) युक्त nanosensors साथ कोशिकाओं को सेते हैं. खंड 1.1 में लेकिन तैयारी और Tamra जोड़ने की चूक के साथ वर्णित के रूप में इन nanosensors तैयार करें.
  2. Nanosensor वितरण अवधि के बाद 50 एनएम को LysoTracker लाल शेयर समाधान पतला.
  3. PLGA scaffolds पर संवर्धित कोशिकाओं को पतला समाधान (2 μl) के एक विभाज्य जोड़ें.
  4. 1 घंटा (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) के लिए LysoTracker लाल के साथ कोशिकाओं को सेते हैं.
  5. ऊष्मायन अवधि के बाद मीडिया को हटाने और confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग को देखने के लिए तैयार करने में (पीएच 7.4) (2 मिलीलीटर) पीबीएस के लिए मीडिया को बदलने से पहले पीबीएस (7.4 पीएच) के साथ दो बार धोने कोशिकाओं. नोट: phenol लाल स्वतंत्र मीडिया के बजाय पीबीएस के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  6. परमाणु दाग ​​नाटकीय जोड़ेंपीबीएस को Q5 तो अंतिम एकाग्रता 5 माइक्रोन और 3 मिनट (37 डिग्री सेल्सियस 5% सीओ 2) के लिए कोशिकाओं के साथ सेते है. यह DRAQ5 साथ ऊष्मायन अवधि के बाद मीडिया को बदलने के लिए आवश्यक नहीं है.
  7. 650,, केवल nanosensors DRAQ5 क्रोमोफोर उत्तेजित और 500-530 एनएम, 580-600 एनएम प्रतिदीप्ति निरीक्षण करने LysoTracker लाल और 633 एनएम हीलियम / नीयन लेजर उत्तेजित करने के लिए एक 568 एनएम क्रिप्टन लेजर परिवार उत्तेजित करने के लिए एक 488 एनएम आर्गन लेजर का उपयोग -750 (चित्रा 3) क्रमशः एनएम. उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के संग्रह से बचने के लिए अनुक्रमिक स्कैनिंग का प्रयोग करें.

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Representative Results

तैयार पीएच उत्तरदायी nanosensors के आकार के वितरण imaged nanosensors की आबादी मापा और 240-470 एनएम (चित्रा 1 ए) की रेंज में नैनोमीटर आयाम है पाया गया जहां SEM, विशेषता का उपयोग कर रहा था. एक संकीर्ण और यथोचित छोटे व्यास की उपलब्धि नैनोकणों तैयार करने के लिए STOBER विधि का उपयोग कर के साथ संगत है. यह अम्लीय शर्तों का उपयोग तैयारी कण आकार में एक विस्तृत फैलाव पैदा करता है जबकि नैनोकणों STOBER विधि का उपयोग कर नैनोकणों के संश्लेषण के दौरान एक बुनियादी पीएच वातावरण तैयार IE का उपयोग, आकार का अच्छा नियंत्रण की अनुमति देता है कि पाया गया है. वर्णित तरीकों का उपयोग कर गढ़े PLGA electrospun फाइबर के प्रतिनिधि SEM micrographs उत्पादित PLGA पाड़ फाइबर नैनोमीटर आयाम है, जहां कम से कम beading या टूटना प्रदर्शित nonwoven फाइबर होते प्रदर्शित किया कि चित्रा 1 बी में दिखाया गया. चित्रा 1C चित्रा 1 बी में नियंत्रण नमूना करने के लिए तुलना कर रहे हैं कि फाइबर, SEM micrographs फाइबर की सतह पर nanosensor एसोसिएशन के प्रमाण उपलब्ध कराने का उत्पादन दर्शाता है कि हालांकि वे कर सकते हैं भी पाड़ फाइबर के भीतर शामिल किया, इन पाड़ / nanosensor scaffolds की गिरावट अध्ययनों से इस nanosensor प्रदर्शन को प्रभावित करता है, तो यह निर्धारित करने के लिए SEM और / या confocal माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन के रूप में किया जा सकता है.

PLGA फाइबर में शामिल करने के बाद उनके ऑप्टिकल गतिविधि को बनाए रखने के लिए nanosensors की क्षमता confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग स्वयं रिपोर्टिंग scaffolds परीक्षण करके सत्यापित किया गया था. पाड़ फाइबर में शामिल जब ऑप्टिकली और रासायनिक सक्रिय रहने की क्षमता का रिटेंशन नजर रखी जा analyte सांद्रता सक्षम हो सकता है. nanosensors से उत्सर्जित प्रतिदीप्ति nanosensors r दिखा दिया किउनके ऑप्टिकल गतिविधि etained और पाड़ फाइबर के साथ जुड़े रहे हैं. रंग प्रतिदीप्ति परिवार (हरा) से उत्सर्जित और पीएच उत्तरदायी nanosensors में शामिल Tamra (लाल) क्रमशः आंकड़े 2A और 2 बी में दिखाया गया है. यह यह संभव analyte सांद्रता बगल में नजर रखी जा करने के लिए बनाता है एक सकारात्मक परिणाम है. यह भी ऑप्टिकली सक्रिय ratiometric nanosensors electrospinning प्रक्रिया का उपयोग कर PLGA पाड़ तंतुओं में शामिल किया गया है कि पहली बार है. Nanosensors PLGA तंतुओं में समावेश निम्नलिखित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कल्पना की जा सकती है कि इस बात की पुष्टि करने के बाद, analyte एकाग्रता में परिवर्तन करने के लिए nanosensor प्रतिक्रिया सत्यापित किया गया था. पीएच भिन्न बफ़र्स में पाड़ डुबो Tamra संदर्भ डाई काफ़ी बदलाव नहीं किया द्वारा उत्सर्जित प्रतिदीप्ति whilst के परिवार डाई से प्रतिदीप्ति तीव्रता का एक परिवर्तन में हुई. दोनों रंगों के फ्लोरोसेंट तीव्रता के अनुपात ठेस के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैचित्रा -2 में दिखाया गया है एक अंशांकन वक्र uce. nanosensors के लिए अंशांकन वक्र अकेले का मूल्यांकन और electrospun PLGA पाड़ में शामिल जब तुलनीय है और nanosensors आत्म रिपोर्टिंग scaffolds में शामिल करने के बाद उनके ऑप्टिकल गतिविधि को बनाए रखने कि दर्शाता है. reversibly अलग पीएच मान का जवाब करने के लिए आत्म - रिपोर्टिंग पाड़ की क्षमता बारी - बारी से 5.5 और 7.5 के पीएच मान के साथ बफ़र्स में पाड़ डुबो कर मूल्यांकन किया गया था. उलटने आत्म रिपोर्टिंग पाड़ पीएच में कई चक्रीय परिवर्तन का जवाब कर सकते हैं, जहां चित्रा 2 डी में दिखाया के रूप में बहुत अच्छा हो पाया था. लंबे समय तक अध्ययन nanosensor समावेश पर PLGA गिरावट के प्रभाव का आकलन करने के लिए प्रदर्शन नहीं किया गया है, यह nanosensors एक ratiometric प्रतिक्रिया प्रदान क्योंकि वर्तमान nanosensors की मात्रा परिणाम को प्रभावित नहीं करेगा कि सोचा है.

Analyte उत्तरदायी nanosensors एक liposom का उपयोग कर दिया गयाजिसका विकास रिक्त PLGA scaffolds के द्वारा समर्थित किया गया 3T3 fibroblasts के intracellular पर्यावरण के लिए अल अभिकर्मक एजेंट. रिक्त PLGA scaffolds पर सुसंस्कृत 3T3 fibroblasts की Confocal माइक्रोस्कोपी छवियों nanosensors क्रमशः परिवार और Tamra आंकड़े 3 ए में दिखाया गया है और बी से मनाया प्रतिदीप्ति साथ fibroblast कोशिकाओं के साथ जुड़े रहे हैं प्रदर्शित करता है. इन चैनलों से प्रतिदीप्ति overlaying रंजक (चित्रा -3 सी में पीले प्रतिदीप्ति के रूप में चित्रित) nanosensors 'biocompatible मैट्रिक्स के भीतर फँस बनी है, सुझाव है कि दो रंगों से प्रतिदीप्ति सह स्थानीय है कि पता चलता है. nanosensors परिवार से सह स्थानीयकृत प्रतिदीप्ति की कमी इसका सबूत है अम्लीय डिब्बों के भीतर निहित 3T3 fibroblasts और नहीं के cytoplasm के भीतर माना जाता है केवल nanosensors और चित्रा 3 डी में दिखाया गया Lysotracker लाल रंग. पीएच उत्तरदायी nanosensors के प्रतिदीप्ति तीव्रता उद्धारकोशिकाओं चित्रा 3E में दिखाए जाते हैं जो परिणाम की पीएच में परिवर्तन के अधीन थे, whilst 3T3 fibroblasts के एड नजर रखी थी. उत्पादन ग्राफ electrospun PLGA पाड़ पर संवर्धित कोशिकाओं रेंज 6.8-7.0 में एक फ़ाई बनाए रखा है कि यह दर्शाता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. Nanosensors, PLGA फाइबर और आत्म रिपोर्टिंग scaffolds के SEM micrographs. (ए) गोलाकार नैनोमीटर आकार के कणों (बी) दिखा पीएच उत्तरदायी जेल प nanosensors फाइबर आकारिकी न्यूनतम beading और breakages nanosensors से फैलने वाला होने के लिए मनाया जा सकता है, जहां (सी) पीएच उत्तरदायी स्वयं रिपोर्टिंग scaffolds के साथ नियमित रूप से है जहां PLGA electrospun nonwoven फाइबर PLGA अभी तक फाइबर आकारिकी Nanos शामिल नहीं है कि नियंत्रण PLGA फाइबर के साथ तुलनीय रहता हैensors. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2

चित्रा 2. प्रतिदीप्ति PLGA पाड़ फाइबर के साथ जुड़े nanosensors से देखा जा सकता है जहां पीएच उत्तरदायी स्वयं रिपोर्टिंग scaffolds के Confocal माइक्रोस्कोपी छवियों. (ए) परिवार (हरा) पीएच संवेदनशील डाई और (बी) के सूत्रों का कहना है (लाल) संदर्भ डाई. (सी) पीएच उत्तरदायी जेल प nanosensors और पीएच उत्तरदायी scaffolds के अंशांकन रेखांकन demonstPLGA पाड़ फाइबर में शामिल जब nanosensors के ऑप्टिकल और रासायनिक प्रतिक्रिया से प्रभावित नहीं किया गया है कि दर. पीएच 5.5 और 7.5 पीएच के वैकल्पिक बफर समाधान में पाड़ डुबो कर प्रदर्शन किया आत्म रिपोर्टिंग पाड़ (डी) उलटने. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. सेल भाँति nanosensors और पीएच और फी प्रतिक्रिया का रेखांकन. प्रतिदीप्ति की Confocal माइक्रोस्कोपी छवियों भाँति nanosensors से (ए) परिवार (हरा) (बी) के सूत्रों का कहना है (लाल) (सी) परिवार और Tamra से प्रतिदीप्ति सह स्थानीयकरण (पीले) ( डी) परिवार ही nanosensors (हरा) 3T3 fibroblasts संस्कृति को जन्म दियानाभिक के DRAQ5 (मैजेंटा) लेबलिंग और लाइसोसोम के LysoTracker लाल (लाल) लेबलिंग के साथ PLGA पाड़ पर डी. परिवार और Lysotracker लाल की fluoresence इसलिए यह nanosensors (ई) फ़ाई माप पीएच अंशांकन की तुलना में एक रिक्त PLGA पाड़ पर सुसंस्कृत 3T3 fibroblasts के लिए दिया nanosensors से लिया सेलुलर अम्लीय डिब्बों में भली भाँति किया गया है कि संभावना नहीं है कि प्रदर्शन सह अनुवादित नहीं हैं कोशिकाओं की संस्कृति के बिना एक पीएच संवेदन पाड़ की. यह भी पीएच माप electrospun PLGA पाड़ पर संवर्धित कोशिकाओं रेंज 6.8-7.0 में एक फ़ाई बनाए रखा है के रूप में भली भाँति nanosensors अम्लीय नहीं कर रहे हैं का उपयोग कर प्रदर्शन दर्शाता है कि. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

टिशू इंजीनियरिंग एक विशेष ऊतक या अंग के समारोह में सुधार करने की जगह, को बनाए रखने या बढ़ाने के लिए इन विट्रो ऊतक मॉडल की तरह vivo में और ऊतक प्रतिस्थापन चिकित्सा में दोनों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि जैविक के विकल्प बनाने के लिए चाहते हैं. कई वर्षों की जगह या ऊतकों की सहायता की मरम्मत लेकिन ये अक्सर कारण अंततः अस्वीकृति या आगे संशोधन सर्जरी की ओर जाता है जो मेजबान के ऊतकों और / या संक्रमण, के साथ गरीब एकीकरण को विफल करने के लिए सिंथेटिक के विकल्प इस्तेमाल किया गया है. दाखिल करने से पहले प्रयोगशाला में ऊतक रहने सृजन पूर्ण एकीकरण को प्राप्त करने के मुद्दे के समाधान और संशोधन सर्जरी की आवश्यकता को कम कर सकते हैं. हालांकि, महसूस किया जा करने के लिए इस लक्ष्य के लिए उपयुक्त में इन विट्रो प्रचार और 3 डी निर्माणों के भीतर कोशिकाओं के हेरफेर के लिए इन विट्रो में ऊतक के उचित शारीरिक कंडीशनिंग के साथ मिलकर किया जाना चाहिए. यह एक मौलिक जीव विज्ञान में अनुसंधान जारी रखने के लिए किया जा रहा है तरीकों की एक संख्या में प्राप्त किया जा सकता हैशामिल है लेकिन यह भी कृत्रिम विकल्प के उत्पादन से संबंधित इंजीनियरिंग और विनिर्माण मुद्दों अनुसंधान करने के लिए. यह वर्णित प्रोटोकॉल योगदान करना है कि यह बाद मुद्दा है.

वर्णित PLGA scaffolds के उद्देश्य का उपयोग एक जैविक रूप से प्रासंगिक संरचना में उनके विकास सहायता के लिए स्तनधारी कोशिकाओं के लिए एक अस्थायी सहायता प्रदान करना है. PLGA scaffolds में analyte उत्तरदायी nanosensors के निगमन स्थानीय analyte सांद्रता ऊतक विकास की प्रक्रिया के दौरान एक 3 डी निर्माण के दौरान निगरानी करने की अनुमति दे सकता है. पीएच उत्तरदायी scaffolds के उपयोग द्वारा उत्पादों पाड़ degrades और कोशिकाओं के रूप में उत्पादित अम्लीय प्रभावी रूप से एक 3 डी का निर्माण भीतर से हटाया जा रहा हो जाना के निर्धारण की अनुमति दे सकता. इस प्रक्रिया की निगरानी और इन विट्रो ऊतक उत्थान प्रक्रियाओं के नियंत्रण की मौजूदा कमी को संबोधित करने की दिशा में एक कदम है. खुद को उपकरणों संवेदन कर रहे हैं कि scaffolds के उपयोग में सक्षम हो सकता हैसीटू, वास्तविक समय microenvironmental मूल्यांकन. ऊतकों को नुकसान पहुँचाए बिना निर्माण microenvironment निगरानी आवश्यक है और ऊतक उत्पादन के सभी चरणों में प्रक्रिया की निगरानी की अनुमति देगा.

स्थानीय analyte एकाग्रता रिपोर्ट करने के लिए उत्पादन पीएच उत्तरदायी पाड़ की क्षमता confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग nanosensors से प्रतिदीप्ति उत्पादन की निगरानी के द्वारा मूल्यांकन किया गया था. एक अंशांकन प्रयोग पीएच संवेदन पाड़ के लिए प्रदर्शन किया और PLGA फाइबर में शामिल नहीं पीएच उत्तरदायी nanosensors के बराबर साबित कर दिया था. एक अंशांकन वक्र का उत्पादन करने की क्षमता nanosensors scaffolds के बंध्याकरण की प्रक्रिया पीएच nanosensors के संवेदन क्षमता के लिए किसी भी हानिकारक प्रभाव का कारण नहीं था कि यह भी बहुलक पाड़ में शामिल किया और जब पीएच में बदलाव के लिए उत्तरदायी है कि रहने को दर्शाता है. इसके अलावा, nanosensors PLGA scaffolds पर संवर्धित कोशिकाओं के intracellular पर्यावरण के लिए दिया गया wherफ़ाई में परिवर्तन करने के लिए ई सेलुलर प्रतिक्रिया पर नजर रखी जा सकती है. परिवार और Tamra से प्रतिदीप्ति तीव्रता के अनुपात फ़ाई पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया और एक पीएच उत्तरदायी पाड़ की तुलना में, 3T3 fibroblast कोशिकाओं रेंज पीएच 6.8-7 में एक फ़ाई बनाए रखा है कि सुझाव दे रहे थे. परमाणु दाग ​​DRAQ5 साथ nanosensors साथ ट्रांसफ़ेक्ट Incubating 3T3 fibroblasts सेल जुड़े nanosensors के बहुमत परमाणु क्षेत्र में स्थित नहीं थे कि संकेत दिया. Nanosensor स्थान परिवार और LysoTracker लाल की सह स्थानीयकरण confocal छवियों में पीला पिक्सल द्वारा दर्शाया जाएगी जहां LysoTracker लाल, साथ 3T3 fibroblasts ट्रांसफ़ेक्ट nanosensor incubating द्वारा निर्धारित रूप में इस तरह के endosomes या लाइसोसोम के रूप में अम्लीय डिब्बों के भीतर होना प्रतीत नहीं होता है. ऐसे ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) और internalization के रास्ते के लिए जैविक मार्कर की पहचान द्वारा विश्लेषण के रूप में आगे के अध्ययन के आगे यह पुष्टि कर सकता है. ऐसे समय हल confocal माइक्रोस्कोपी के रूप में इसके अलावा, लंबे समय तक अध्ययनआत्म - रिपोर्टिंग scaffolds पर संवर्धित कोशिकाओं के भीतर nanosensors के लिए लंबी अवधि के भाग्य का निर्धारण कर सकता है. Nanosensors अन्य प्रकार की कोशिकाओं को दिया जा रहे थे तो उनके स्थान परिणाम के रूप में पहचान की जानी चाहिए कि यहाँ दिखाया गया है के रूप में ही नहीं हो सकता.

आत्म - रिपोर्टिंग scaffolds के उपयोग noninvasively ऊतक इंजीनियर निर्माणों के भीतर microenvironmental स्थितियों की निगरानी करने की क्षमता है. सीटू माप में प्रदर्शन करने की क्षमता करने के बाद noninvasively और वास्तविक समय में इन विट्रो में 3 डी ऊतक निर्माणों के विकास के अनुकूलन सक्षम हो सकता है. पीएच उत्तरदायी nanosensors के cytoplasmic स्थान चल रहे प्रयोगों के दौरान फ़ाई की निगरानी के लिए उपयोग किया जा सकता है. कोशिकाओं या आत्म रिपोर्टिंग scaffolds के आंतरिक वातावरण के लिए दिया nanosensors दोनों स्थिर या गतिशील ऊतक संस्कृति प्रणालियों के भीतर इस्तेमाल किया जा सकता है और में ऊतक इंजीनियर निर्माणों का इष्टतम विकास के लिए आवश्यक संस्कृति की स्थिति का निर्धारण करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैंइन विट्रो. इसके अलावा विकास अंततः ऊतक निर्माणों की संस्कृति के लिए एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पद्धति दे, निर्माण के दौरान पोषक तत्वों और ऑक्सीजन का एक निरंतर आपूर्ति सुनिश्चित पोषक कमी पर कार्रवाई कि एक ऑन लाइन सिस्टम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.

वर्णित प्रोटोकॉल गहरी निर्माणों के भीतर इमेजिंग अनुमति देने के लिए आवश्यक हो सकता है बड़ा 3 डी सक्षम करने के लिए, लेकिन confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग इमेजिंग बहु फोटान उत्तेजना imaged किया जा constructs अनुमति देने के लिए उपयुक्त आयामों के साथ scaffolds तैयार किया है. ऐसे माइक्रोस्कोप के लेंस के रूप में इस्तेमाल ऑप्टिकल उपकरण लेंस और निर्माण आयामों के लिए इष्टतम काम दूरी निर्धारित करने के लिए चयन किया जाना चाहिए.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

बीबीएसआरसी से अनुदान कृपया स्वीकार किया है (अनुदान संख्या बी बी H011293 / 1).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethanol Fisher 32221
Anhydrous dimethylformamide (DMF) Sigma 270547
Ammonium hydroxide 50% (v/v) aqueous solution Alfa Aesar 35574 diluted to 30% (v/v) with pure water
TEOS Sigma 13190-3
3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) Sigma A3648
5-(and-6)-carboxyfluorescein, succinimidyl ester (FAM-SE) Invitrogen C1311
6-carboxytetramethylrhodamine, succinimidyl ester (TAMRA-SE) Invitrogen C1171
Sodium phosphate monobasic (0.2 M) Sigma Aldrich S-9638
Sodium phosphate dibasic (0.2 M) Sigma Aldrich S-0876
NaOH Sigma Aldrich S8045
Trypsin/EDTA Sigma Aldrich T4174
Penicillin/Streptomycin Sigma Aldrich P0781
PBS Sigma Aldrich D8537
DMEM Sigma Aldrich D6046
FBS Source Bioscience Batch-213-101992
L-Glutamine Sigma Aldrich G7513
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-019
Optimem Invitrogen 11058-021
LysoTracker Red Invitrogen L-7528
Draq5 Biostatus Ltd DR50050
Nitrogen gas BOC
DCM Sigma Aldrich 320269
TFA Sigma Aldrich T6508
Confocal microscope Leica TCS-SP equipped with argon and krypton lasers and a 63X 0.9NA water immersion lens
UV light UVLS28 UVP, USA
Stirrer plate SB161-3 Jencons-PLS
pH meter Jenway model 3510
Rotary Evaporator Buchi Rotary Evaporator R200
Centrifuge (nanosensors) Hermle Z300
Centrifuge (cell culture) Thermo Scientific Heraeus Biofuge Primo
Vortex Whirlimixer Fisherbrand
Ultrasonicator FB11021 Fisherbrand
Aluminum sheet Nottingham University
35mm cell culture plate Iwaki 3000035
10 ml syringe Becton Dickenson
3T3 Fibroblast cells European Collection of Cell Cultures
PLGA Lakeshore Biomaterials 7525 DLG 7E
Pyridinium formate Sigma Aldrich P8535
Trypan blue Sigma Aldrich T8154
Sodium phosphate monobasic Sigma Aldrich S9638
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich S5136
HCl Sigma Aldrich 320331

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References

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3 आयामी सेल संस्कृति के लिए स्वयं रिपोर्टिंग Scaffolds
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Harrington, H., Rose, F. R. A. J., Aylott, J. W., Ghaemmaghami, A. M. Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture. J. Vis. Exp. (81), e50608, doi:10.3791/50608 (2013).

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