Summary
Biokompatible pH responsive sol-gel nanosensorer kan bli innlemmet i poly (melkesyre-co-glykolsyre) (PLGA) elektrospunnede stillaser. De produserte egenrapportering stillaser kan brukes for in situ overvåking av microenviron forhold mens dyrking celler på stillaset. Dette er fordelaktig da den 3D cellekonstruksjon kan overvåkes i sanntid, uten å forstyrre forsøket.
Abstract
Dyrknings celler i 3D på egnede stillasene er tenkt å bedre etterligner in vivo mikromiljøet og øke celle-celle interaksjoner. Den resulterende 3D cellular konstruere kan ofte være mer relevant å studere molekylære hendelser og celle-celle interaksjoner enn tilsvarende forsøk studert i 2D. Å skape effektive 3D kulturer med høy celle levedyktighet gjennom stillaset forholdene kultur som oksygen og pH må nøye kontrollert som gradienter i analyttkonsentrasjon kan eksistere i hele 3D konstruksjon. Her beskriver vi fremgangsmåter for fremstilling av biokompatible pH-responsive sol-gel-nanosensorer og deres innlemmelse i poly (melkesyre-ko-glykolsyre) (PLGA) elektrospunnede stillasene sammen med deres påfølgende forberedelse til kulturen i pattedyrceller. PH-responsive stillasene kan brukes som verktøy for å fastslå micro pH innenfor et 3D mobilnettet konstruksjon. Videre har vi detalj levering av pH responsive nanosensors til den intracellulære miljø av pattedyrceller som veksten ble støttet av elektrospunnede PLGA stillasene. Den cytoplasmatiske plasseringen av pH-responsive nanosensorer kan benyttes for å overvåke intracellulære pH (phi) under pågående forsøk.
Introduction
En viktig strategi i vevsteknologi er bruk av biokompatible materialer for å fremstille stillas hvis morfologi ligner vevet som det skal erstatte, og er også i stand til å støtte cellevekst og funksjon 1,2. Stillaset gir mekanisk støtte ved at cellebinding og spredning ennå tillater celle migrasjon gjennom mellomrommene i en 3D-mobilnettet konstruksjon. Stillaset må også gi rom for massetransport av celle næringsstoffer og ikke hemme fjerning av metabolske avfall tre.
Electro har dukket opp som en lovende metode for fabrikasjon av polymere stillas som tåler cellevekst 4-6. De ikke-vevde elektrospunnede fibrene som produseres er egnet for cellevekst fordi de ofte er porøse og tillater celle-celle-interaksjon i tillegg til cellemigrasjon gjennom mellomrommene av et 3D-cellekonstruksjon 7.. Det er viktig å overvåke cellelevedyktighet under than periode på kultur og for å sikre at mobil levedyktighet opprettholdes gjennom hele 3D-konstruksjon. For eksempel, kultur forhold som oksygen og pH krever nøye kontroll, som gradienter i analyttkonsentrasjon kan eksistere innenfor 3D-konstruksjon. Bioreaktorer eller perfusjon systemer kan bli anvendt for å etterligne in vivo-betingelser for interstitiell strømmen og som et resultat øker næringstransport og metabolsk avfall fjernes 8.. Spørsmålet om hvorvidt slike systemer er å sikre konstant microenviron forhold kan rettes ved å vurdere den cellulære mikromiljøet i sanntid.
Nøkkelmikromiljøet beregninger som kan bli overvåket i sann tid omfatter: temperatur, kjemisk sammensetning av cellemateriale, konsentrasjonen av oppløst oksygen og karbondioksyd, pH og fuktighet. Av disse beregningene, kan temperaturen bli mest lett overvåkes ved hjelp av in situ-sonder. Metoder for overvåking av de resterende oppført beregninger ofte ivolve fjerning av en alikvot etter prøvetaking, og dermed forstyrrer den cellekultur og øke risikoen for forurensing. Kontinuerlig, real-time metoder blir søkt. Nåværende overvåkingsmetoder som regel stole på instrumenter som fysisk sondere mobil konstruere for eksempel en pH-skjerm eller oksygen probe. Imidlertid kan disse inngripende metoder ødelegge cellekonstruksjon og forstyrre den pågående eksperiment. Ikke-invasiv monitorering av analyttkonsentrasjoner innen 3D konstruksjon kunne muliggjøre sanntids overvåking av ulike miljøaspekter som næringsutarming ni. Dette ville tillate vurdering av næringstilførsel til dypere områder innenfor strukturen og avgjøre om metabolske avfall ble fjernet effektivt 10,11. Systemer som forsøker å løse problemet med invasivitet vanligvis innebære bruk av en perfusjon kammer som passerer kulturmedium gjennom både dyrkings-beholderen, og til eksterne sensorer for å overvåke pH, oksygen-og glukose 12.. Denre er økende interesse i å utvikle sensorer som kan bli direkte integrert i kulturen fartøy som ikke krever fjerning av en prøve for prøvetaking og som sådan vil gi in situ overvåkning.
For å møte slike svakheter for in situ og ikke-invasiv monitorering av microenviron forholdene vi har innarbeidet analytt responsive nanosensorer i elektrospunnede stillasene for å produsere egenrapportering stillaser 13. Stillas som fungerer som føleinnretninger ved å overvåke fluorescens-aktivitet har blitt fremstilt tidligere, hvor avfølingsanordningen var enten selve stillaset polymere laget av electro eller ved hjelp av en analytt reagerer fargestoff som er innlemmet i polymeren før stillaset dannelse 14,15 . Men disse føleinnretninger har potensial til å gi feilaktige optiske utganger forårsaket av mulig interferens fra andre analytter. Bruken av en ratiometrisk føleanordning such som de som er fremstilt på den beskrevne protokoll har potensiale for å eliminere disse mulige bivirkninger og gir en respons som er spesifikk for analytten i spørsmålet.
De elektrospunnede stillasene som presenteres her er utarbeidet fra den syntetiske co-polymer poly (melkesyre-co-glykolsyre) (PLGA), valgt på grunn av at Food and Drug Administration (FDA) godkjenning, på grunn av dets biologisk nedbrytbare og biokompatible egenskaper, og et spor registrering av støtter vekst og funksjon av forskjellige celletyper 16-18. De preparerte ratiometric analytt responsive nanosensorer er følsomt for pH. Den nanosensorer innlemme to fluorescerende fargestoffer i en biokompatibel sol-gel matriks, hvor en fargestoff, er FAM som reagerer på pH, og den andre, TAMRA fungerer som en indre standard som det ikke er følsomt for pH. Videre fluorescensen av både FAM og TAMRA kan analyseres separat som de ikke i betydelig grad overlapper hverandre. Bestemmelse av forholdet mellom fluorescens emission av begge fargestoffer ved bestemte bølgelengder gir en pH-reaksjon uavhengig av andre miljøforhold. De selv rapportering stillaser kan tillate gjentatt vurdering av pH i situ og i sanntid uten å forstyrre utviklet 3D-modellen. Vi har vist at disse stillasene er i stand til å støtte cellebinding og spredning, og forblir som reagerer på analytten det gjelder. Kinetikken syrlig biprodukter i konstruerte konstruerer fortsatt lite studert, og som sådan ved hjelp av pH-responsive stillasene kan i stor grad legge til rette for slike studier 19. Videre presenterer bruken av selvrapportering stillaser for tissue engineering applikasjoner mulighet til å fullt ut forstå, overvåke og optimalisere veksten av 3D modell vev konstruerer in vitro, invasivt og i sanntid.
PH-responsive nanosensorer har også blitt levert til den intracellulære miljø av fibroblaster dyrket på elektrospunnede PLGA stillasds. Forholdet av fluorescensemisjonen fra de fargestoffer som ble brukt til å overvåke Phi og sammenlignet med en selvstendig rapportering stillaset innlemme pH nanosensorer. Leveringen av nanosensorer for celler dyrket i et 3D miljø kunne muliggjøre overvåking av analytt-konsentrasjon dypt inne i konstruksjonen på en ikke-destruktiv måte. Derfor nanosensorer kan være et levedyktig tenkelig verktøyet til ikke-destruktiv vurdere celle atferd gjennom 3D konstruerer slik langsiktig analyse. Screening analyttkonsentrasjonen av individuelle celler i løpet av en 3D-konstruksjon kunne sikre at de får tilstrekkelig nærings-og oksygenkonsentrasjoner. Overvåkning av prosessparametre kunne hjelpe til i utviklingen av standardiserte teknikker for effektiv massetransport av oksygen og næringsstoffer. Leveringen av nanosensorer til det intracellulære miljøet og inkorporering av nanosensorer i polymere stillas kan bli kombinert for å tillate vurdering av cellelevedyktighet så vel som stillas ytelse innen 3D constructs under vev vekstprosessen. Dette kan føre til økt kunnskap om disse konstruerer og fremgang fabrikasjon av biologisk relevante vev erstatter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Oversikt
§ 1 beskriver fremstilling av pH-responsive nanosensorer og karakterisering av nanosensor respons til pH ved hjelp av fluorescens-spektrometri og deres størrelse ved hjelp av SEM.
§ 2 beskriver fremstilling av elektrospunnede polymer stillaser og karakteriseringen av deres morfologi og størrelse ved hjelp av SEM. Avsnitt 2 beskriver også utarbeidelse av egenrapportering stillaser som er elektrospunnede stillasene med inkluderingen av pH responsive nanosensorer. De resulterende egenrapportering Stillasene er preget av SEM å vurdere om eventuelle morfologiske endringer i elektrospunnede fibrene har oppstått. Fluorescens fra egenrapportering stillaser som følge av de inkorporerte nanosensorer vurderes av konfokalmikroskopi.
§ 3 beskriver kulturen i celler på elektrospunnede stillaset og selvrapportering stillaset. Stillasene er første sterilisert i forberedelse;ion for cellekultur følgende som stillasene vurderes for å avgjøre om sterilisering og kulturen i cellene påvirker fluorescens evnen til selv rapportering stillaser. Protokollen beskriver også levering av nanosensorer til celler som er dyrket på elektrospunnede stillaser. Lysotracker fargestoff brukes for å sikre at nanosensorer ikke er tatt inn i mobilnettet sure avdelinger.
En. Forberedelse og analyse av pH Responsive Sol-gel Nanosensorer
1.1 Utarbeidelse av pH Responsive Sol-gel Nanosensorer
Merk: Dette preparatet bør utføres i et avtrekksskap.
- Klargjør fluoroforer for anvendelse innenfor de pH-nanosensorer ved å oppløse 5 - (-og-6)-karboksyfluorescein, succinimidyl-ester (FAM-SE) (1,5 mg) i dimetylformamid (DMF) (1 ml) i en rundbunnet kolbe og 6-carboxytetramethylrhodamine , succinimidyl-ester (TAMRA-SE) (1,5 mg) i DMF (1 ml) i en rundbunnet kolbe.Tilsett 3-aminopropyltrietoksysilan (APTES) (1,5 ml) til hver kolbe og omrør under en tørr nitrogen-atmosfære (21 ° C) i 24 timer i mørket dvs. vikle prøvene i folie.
- Til begge de ovennevnte fargestoffer (250 mL) til en blanding av etanol (6 ml) og ammoniumhydroksyd (30 vekt-%, 4 ml) inneholdt i en rundkolbe, og omrøres i 1 time (21 ° C).
- Tilsett langsomt tetraethylorthosilicate (TEOS) (0,5 ml) til blandingen, fortsetter omrøring i ytterligere 2 timer. Blandingen vil slå skyet. Den nanosensorer kan samles ved rotasjonsfordampning. Nanosensorer kan bli lagret i en glassflaske ved 4 ° C for fremtidig bruk.
Forsiktig videre behandling av nanosensorer i deres tørr form bør utføres i et avtrekksskap, eller i tilfellet med en vekt på dem balanse bør være innelukket, for eksempel i en Weighsafe.
1.2 Nanosensor Response til pH
- Forbered Sørensens fosfatbufferløsninger som spenner fra pH 5,5 til 8,0 ved Mixing spesifikke forhold av monobasisk natriumfosfat (0,2 M) og dinatriumhydrogenfosfat (0,2 M) stamløsninger. Kontroller den endelige pH-verdi ved hjelp av et pH-meter. Gjør eventuelle mindre justeringer i pH ved hjelp av natriumhydroksid (NaOH) (4 M) eller saltsyre (HCl) (2 M).
- Suspender det pH nanosensorer i pH-buffere (5 mg / ml) ved først å holde beholder inneholdende nanosensor løsning på en vortex i 3 min og deretter nedsenke fartøyet i en ultrasonicator inntil oppløsningen blir uklar (ca. 5 min). Gjenta disse trinnene for å fullt suspendere nanosensorer i løsningen.
- Plasser den første løsningen i en optisk kyvette og bruke eksitasjonsbølgelengdene på 488 nm for 5 - (-og-6)-karboksyfluorescein (FAM) og 568 nm for 6-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA). Samle utslippsbølgelengder på 500-530 nm for FAM og 558-580 nm for TAMRA bruke en fluorescens spektrometer.
- Endring løsningene i den optiske kyvette slik at pH kan bli observert ved forskjellige pH og fortsette collecting utslipp spektra.
- Beregn forholdet av utslipps maxima produsert ved hver pH-verdi for å gi en kalibreringskurve.
1.3 SEM av nanosensorer
- Plasser et utvalg av nanosensorer på en karbon belagt elektronmikroskop spire og frese strøk med gull for 5 min under en argon atmosfære.
- Observer ved scanning elektronmikroskopi (SEM). Under avbildning justere arbeidsavstanden, spenning og forstørrelse for å minimere elektronlading (figur 1).
2. Forberedelse og analyse av PLGA Stillas
2,1 Electro PLGA Stillas
- I en avtrekkshette oppløse poly (melkesyre-ko-glykolsyre) (PLGA) i diklormetan (DCM) (20% (w / w)) med pyridinium-formiat (PF) (1% (w / w)). Sett oppløsning inn i en 10 ml sprøyte med en 18 G stump fyll nål og sikkert på plass av en sprøytepumpe.
- Distansere nålespissen 20 cm borte fra en 20cm x 15 cm aluminiumoppsamlingsplaten.
- Fest elektrode av et høyt spenningsstrømtilførselen til tuppen av sprøyten og jorden til aluminiumoppsamlingsplaten.
FORSIKTIG: Du bør være forsiktig så høy spenning brukes dvs. alltid slå av strømforsyningen før du håndterer noen av electro utstyr. - Lever løsningen ved hjelp av en konstant strømningshastighet på 3,5 m / time ved 12 kV i 2 timer. Electro bruke disse forholdene vil gi et stillas dybde på ca 60 mikrometer.
- La stillaset i en avtrekkshette for 24 timer å tillate løsemiddel for å fordampe.
2.2 Electro pH Responsive PLGA Stillas
- Forbered stillasene som omfatter pH responsive nanosensorer som beskrevet i pkt. 2.1, men med endring av å legge nanosensorer til polymerløsning (5 mg / ml). Suspender på nanosensorer i PLGA-løsning ved hjelp av ultrasonication (ca. 5 min) før å plassere inn i en 10 ml sprøyte.
2.3 SEM av PLGA Stillas og pH Responsive Stillas
- Plasser en prøve av PLGA stillas eller pH responsive stillas på en karbon belagt elektronmikroskop spire og fortsett som beskrevet for SEM av nanosensorer (Figur 1).
2.4 Kalibrering av pH Responsive Stillas
- Plasser en prøve av pH responsive stillaset inn en 35 mm kultur plate og legg de i passende bufferløsninger.
- På en konfokalmikroskop bruke en 488 nm argon laser for å opphisse FAM og en 568 nm krypton laser for å opphisse TAMRA innenfor nanosensorer. Observer fluorescensemisjon for pH-responsive stillas på 500-530 nm for FAM og 558-580 nm for TAMRA. (Figur 2). Bruk sekvensiell skanning for å unngå samling av eksitasjonsbølgelengdene.
Tre. Cell Culture på PLGA Stillaser og pH Responsive PLGA Stillas
ntent "> Merk: Følgende bør utføres i en cellekultur skap.3.1 Utarbeidelse av PLGA Stillas for Cell Culture
- Skjær PLGA eller pH-responsive PLGA stillasene i 2 cm 2 stk.
- Steril stillas ved å bestråle med ultrafiolett (UV) lys med en avstand på 8 cm i 15 minutter på hver side.
- Overfør stillasene til en 12-godt kultur plate og legg en stålring på toppen. Tilsett en løsning av Penicillin / Streptomycin (5% volum / volum) i fosfat-bufret saltløsning (PBS) til innsiden og utsiden av stålring, inkuberes over natten (37 ° C, 5% CO2). Legg merke til stålring ble produsert ved The University of Nottingham og har følgende dimensjoner: 2 cm ytre diameter, 1 cm indre diameter, 1 cm dybde.
- Fjern det steriliserende løsning og vask med PBS.
- Til celledyrkningsmedium til innsiden (500 ul) og utsiden (500 ul) av stålringen, som legges i en inkubator (37 ° C, 5% CO 2
- Forbered en celle suspensjon og utføre en celletall ved hjelp av en Trypan Blå eksklusjon analysen.
- Opprett en cellesuspensjon for å oppnå en celle rekke 1 x 10 6 celler / ml.
- Fjern mediet fra innsiden og utsiden av stålringen.
- Erstatt med prewarmed celledyrkningsmedier på utsiden av stålring (1 m).
- Tilsett 300 ul av cellesuspensjonen til innsiden av stålring - skjær plate frem og tilbake forsiktig for å fordele cellene.
- Plasser cellekulturplate i en inkubator (37 ° C, 5% CO2) - bør cellebinding har funnet sted i løpet av 24 timer, men fortsetter kulturen så lenge forsøket krever - å oppdatere media hver 2-3 dager.
3.2 Nanosensor Levering til celler dyrket på PLGA Stillas
- Seed celler bort på PLGA stillas som er beskrevet i kapittel 3.1. For denne studien en blank PLGA stillaset (ikke contaiNing nanosensorer) ble brukt på grunn av overlapping av fluorescens utslipp når imaging.
- Plasser cellen seeded stillaset i en inkubator (37 ° C, 5% CO2) i 72 timer for å tillate cellene å vokse og migrerer gjennom hele stillaset før nanosensor levering.
- Før nanosensor levering vaskes cellene med PBS og endre mediet fra standard kulturmedier til antibiotika-og serumfrie medier, inkuberes (37 ° C, 5% CO2) i 1 time. Merk: standard kulturmedier for 3T3-celler består av Dulbeccos modifiserte Eagles medium supplert med kalvefosterserum (10% (v / v)), L-glutamin-løsning (2 mM), penicillin / streptomycin (1% (v / v)) .
- I løpet av inkubasjonsperioden forberede nanosensor-liposom-kompleks ved kort sonicating nanosensorer (5 mg) med Optimem (50 mL) for å gi oppløsning A.
- Opprett-løsning B ved tilsetning av Lipofectamine 2000 (5 mL) for å Optimem (45 ul), inkuber ved romtemperatur i 5 min.
- Legg løsningA til oppløsning B, inkuber ved romtemperatur i 20 min for å danne oppløsning C, som er nanosensor-liposom-kompleks.
- Til løsning C (100 ul) på celler og inkuberes (37 ° C, 5% CO2) i 3 timer.
- Fjern celle seeded stillasene fra inkubatoren, Sug mediet og vask to ganger med PBS før tilsetning PBS (1 ml) for å gi levende celle visualisering ved konfokal mikroskopi. Merk: PBS ble anvendt i denne protokollen, slik at fenolrødt indikator tilstede i cellekulturmedier ikke forårsake autofluorescens og også fordi en kalibrering ved forskjellig pH ble utført. Imidlertid fenolrødt frie media kan brukes for sikt-analyse av cellekulturer.
- Fordyp cellen seeded stillaset i buffere med forskjellig pH-verdi og overvåke responsen av nanosensorer forbundet med cellene.
- Overvåk PHI ved å bestemme forholdet mellom fluorescensintensiteter fra FAM og TAMRA ved å observere fluorescens hjelp konfokalmikroskopi (Figure 3).
3,3 Nanosensor Beliggenhet innen pattedyrceller
- Inkuber cellene med nanosensorer som bare inneholder FAM fargestoff som beskrevet i kapittel 3.2 (dette er fordi fluorescens utslipp av TAMRA i samme spektral region som LysoTracker Red). Forbered disse nanosensorer som beskrevet i pkt. 1.1, men med utelatelse av å forberede og legge TAMRA.
- Etter nanosensor leveringsperioden fortynne LysoTracker Red stamløsning til 50 nM.
- Til en aliquot av fortynnet oppløsning (2 mL) i celler dyrket på PLGA stillaser.
- Inkuber cellene med LysoTracker Red for en time (37 ° C, 5% CO 2).
- Etter inkuberingsperioden fjernes mediet, og cellene vaskes to ganger med PBS (pH 7,4) før endring av mediet til PBS (pH 7,4) (2 ml) i forberedelse for visning ved hjelp av konfokal mikroskopi. Merk: fenolrødt frie media kan brukes istedenfor PBS.
- Legg atom flekken DraQ5 i PBS slik at den endelige konsentrasjonen er 5 mM, og inkuberes med cellene i 3 minutter (37 ° C 5% CO2). Det er ikke nødvendig å endre mediet etter inkubasjonsperioden med Draq5.
- Bruk en 488 nm argon laser for å opphisse FAM bare nanosensorer, en 568 nm krypton laser for å opphisse LysoTracker Red og 633 nm helium / neon laser for å opphisse Draq5 kromofor og observere fluorescens ved 500-530 nm, 580-600 nm, 650 -750 nm henholdsvis (figur 3). Bruk sekvensiell skanning for å unngå samling av eksitasjonsbølgelengdene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne størrelsesfordelingen av de preparerte pH-responsive nanosensorer ble karakterisert ved hjelp av SEM, hvor populasjonen av nanosensorer avbildes ble målt og funnet å ha nanometer dimensjoner i området fra 240 til 470 nm (figur 1A). Oppnåelse av en smal og rimelig liten diameter er forenlig med bruk av Stöber fremgangsmåte for fremstilling av nanopartikler. Det er blitt funnet at bruk av en basisk pH-miljø under syntese av nanopartikler dvs. nanopartikler ble fremstilt ved bruk av Stöber metoden tillater god kontroll av størrelse, mens preparatet ved hjelp av sure betingelser gir en bred spredning i partikkelstørrelse. Representative SEM mikrografer av PLGA elektrospunnede fibrene fremstille ved hjelp av de beskrevne metoder er vist i Figur 1B viser at den produserte PLGA stillaset består av ikke-vevde fibre som viser minimal perler eller brudd, hvor fibrene har nanometerdimensjoner. Figur 1C figur 1B, The SEM mikrografer gi bevis på nanosensor assosiasjon på overflaten av fibrene, men de kan også bli innarbeidet i stillaset fibre, kan nedbrytnings studier av disse stillas / nanosensor stillasene utføres i forbindelse med SEM-og / eller konfokal mikroskopi for å bestemme om dette påvirker nanosensor ytelse.
Muligheten av nanosensorer for å beholde sin optiske aktivitet etter innlemmelse i PLGA fibrene ble bekreftet ved å undersøke egenrapportering stillasene ved hjelp konfokalmikroskopi. Retensjon av evnen til å forbli optisk og kjemisk aktivt når innlemmet i stillaset fibrene kan gjøre det mulig analyttkonsentrasjoner som skal overvåkes. Fluorescens slippes ut fra nanosensorer viste at nanosensorer retained deres optisk aktivitet og er forbundet med stillaset fibre. Fluorescens slippes ut fra fargestoffer FAM (grønn) og TAMRA (rød) innarbeides i pH-responsive nanosensorer er vist i figurene 2A og 2B respektivt. Dette er et positivt resultat som gjør det mulig for analyttkonsentrasjoner som skal overvåkes in situ. Det er også første gang at optisk aktive ratiometric nanosensorer har blitt innlemmet i PLGA stillas fibrene ved hjelp av electro prosessen. Etter å ha bekreftet at nanosensorer kan visualiseres ved hjelp av fluorescens-mikroskopi etter inkorporering i PLGA-fibre, ble nanosensor respons på endringer i analytt-konsentrasjon verifisert. Neddykking av stillaset i buffere med forskjellig pH-verdi resulterte i en endring i fluorescens-intensiteten fra FAM fargestoff, mens fluorescensen avgitt av det TAMRA referanse fargestoff har ikke merkbart endret. Forholdet mellom fluorescerende intensitet på begge fargestoffer kan brukes for å prodUCE en kalibreringskurve, som vist i figur 2C. Kalibreringskurve for nanosensorer vurderes alene og når innlemmet i elektrospunnede PLGA stillaset er sammenlignbare og viser at nanosensorer beholde sin optiske aktivitet etter innlemmelse i de selv rapportering stillaser. Muligheten av selv rapportering stillaset til reversibelt svare til forskjellige pH-verdier ble vurdert ved vekselvis å dyppe stillaset i buffere med pH-verdier på 5,5 og 7,5. Denne reversibilitet ble funnet å være meget god, som vist i figur 2D, hvor den selv rapportering stillaset kan svare til en rekke sykliske forandringer i pH. Langtidsstudier har ikke blitt utført for å vurdere effekten av PLGA degradering på nanosensor innlemmelse, det er antatt at fordi nanosensorer gir et ratiometric respons mengden av nanosensorer stede vil ikke påvirke resultatet.
Analytt responsive nanosensorer ble levert med en liposomal transfeksjon agenten til den intracellulære miljø av 3T3 fibroblaster som veksten ble støttet av tomme PLGA stillasene. Konfokalmikroskopi bilder av 3T3 fibroblaster dyrket på tomme PLGA stillasene viser at nanosensorer er forbundet med fibroblast celler med fluorescens observert fra henholdsvis FAM og TAMRA vist i figur 3A og B. Overliggende fluorescens fra disse kanaler, viser at fluorescensen fra de to fargestoffer som er co-lokalisert, noe som tyder på at de fargestoffer som har vært innesluttet innenfor nanosensorer 'biokompatibel matriks (som vist ved gul fluorescens i figur 3C). Den nanosensorer er antatt å være innenfor cytoplasma av 3T3 fibroblaster og ikke som finnes på sure lommer som vist ved den manglende co-lokalisert fluorescens fra FAM bare nanosensorer og Lysotracker Red dye vist i figur 3D. Fluorescens intensiteten av pH-responsive nanosensorer levereed å 3T3 fibroblaster ble overvåket mens cellene ble utsatt for forandringer i pH og resultatene av disse er vist i figur 3E. Diagrammet viser at de produserte celler dyrket på den elektrospunnede PLGA stillaset har opprettholdt et PHI i området 6,8 til 7,0.
Figur 1. SEM mikrografer av nanosensorer, PLGA fibre og egenrapportering stillaser. (A) pH-responsive sol-gel nanosensorer som viser sfærisk nanometer store partikler (B) PLGA elektrospunnede vevde fibre der fiber morfologi er vanlig med minimal beading og ødeleggelser (C) pH-responsive egenrapportering stillasene der kan observeres de nanosensorer som skal stikker fra PLGA ennå fiber morfologi forblir sammenlignes med kontroll PLGA fibre som ikke inneholder nanosensors. Klikk her for å se større bilde .
Figur 2. Konfokalmikroskopi bilder av pH-responsive egenrapportering stillaser hvor fluorescens kan observeres fra nanosensorer forbundet med PLGA stillas fiber. (A) FAM (grønn) pH responsive fargestoff og (B) Tamra (rød) referansen fargestoff. (C) Kalibrerings grafer av pH-responsive sol-gel nanosensorer og pH-responsive stillaser demonstrerer athastighet at den optiske og kjemisk reaksjon av nanosensorer ikke er blitt påvirket når de inkorporeres i de PLGA stillas fibre. (D) Reversibilitet av selvrapportering stillas utføres ved å dyppe stillaset i alternative bufferløsninger med pH 5,5 og pH 7,5. Klikk her for å se større bilde .
Figur 3. Konfokalmikroskopi bilder av celle internalisert nanosensorer og grafer av pH og Phi respons. Fluorescens fra de internalisert nanosensorer (A) FAM (grønn) (B) TAMRA (red) (C) samlokalisering av fluorescens fra FAM og TAMRA (gul) ( D) FAM bare nanosensorer (grønn) levert til 3T3 fibroblaster kulturd på PLGA stillas med Draq5 (magenta) merking av kjernen og LysoTracker Red (rød) merking av lysosomer. Den fluorescens av FAM og Lysotracker rødt er ikke samlokalisert derfor demonstrere at det er usannsynlig at nanosensorer har blitt internalisert i cellulære sure avdelinger (E) phi målinger tatt fra nanosensorer levert til 3T3 fibroblaster dyrket på en blank PLGA stillas i forhold til pH-kalibrering på en pH-føler stillas uten at kulturen av celler. Dette viser også at pH-målinger utføres ved å bruke internnanosensorer er ikke surt som celler dyrket på elektrospunnede PLGA stillaset har opprettholdt en Phi i området 6,8-7,0. Klikk her for å se større bilde .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vev Engineering mål å lage biologisk erstatninger som kan brukes både som in vivo som in vitro vev modeller, og i vev erstatningsterapi for å reparere, skifte ut, opprettholde eller øke funksjonen til et bestemt vev eller organ. Syntetiske erstatninger har vært brukt i mange år for å erstatte eller hjelpemiddel reparasjon av vev, men disse har ofte mislykkes på grunn av dårlig integrasjon med vertsvevet og / eller infeksjon, noe som til slutt fører til avvisning eller ytterligere revisjon kirurgi. Genererer levende vev i laboratoriet før implantering kan ta opp spørsmålet om å oppnå full integrering og redusere behovet for revisjon kirurgi. Men for dette mål kan realiseres hensiktsmessig in vitro-formering og manipulering av celler i 3D konstruksjoner bør være kombinert med passende fysisk kondisjonering av vev in vitro. Dette kan oppnås på en rekke måter, det ene er å fortsette forskningen på den grunnleggende biologiinvolvert, men også for å forske på ingeniør-og produksjonsproblemer knyttet til produksjon av syntetiske substitutter. Det er denne siste utgaven at den beskrevne protokollen har som mål å bidra.
Den tilsiktede bruk av de beskrevne PLGA stillasene er å tilveiebringe en midlertidig støtte for pattedyrceller for å hjelpe deres vekst i et biologisk relevant struktur. Inkorporering av analytt responsive nanosensorer inn i PLGA stillaser kan tillate lokale analyttkonsentrasjoner som skal overvåkes gjennom et 3D-konstruksjon under vev vekstprosessen. Bruken av pH-responsive stillas kan tillate fastsettelse av om syrlig biprodukter produsert som stillas degraderer og celler vokser blir effektivt fjernet fra en 3D-konstruksjon. Dette er et skritt mot å ta dagens mangel på prosessovervåking og kontroll av in vitro vev fornyelsesprosesser. Utnyttelsen av stillas som er seg selv sensing enheter kan gjøre det mulig isitu, sanntidsmicroenviron vurdering. Overvåking av konstruere mikromiljø uten å skade vevet er avgjørende, og vil tillate prosessovervåking på alle stadier av produksjon av vev.
Evnen til det produserte pH responsive stillas for å rapportere den lokale analyttkonsentrasjon ble vurdert ved å måle fluorescens som sendes ut fra nanosensorer ved hjelp av konfokal mikroskopi. En kalibreringseksperiment ble utført for pH avføling stillaset, og viste seg å være sammenlignbar med de pH-responsive nanosensorer er ikke innlemmet i PLGA fibre. Evnen til å produsere en kalibreringskurve viser at nanosensorer forblir følsom overfor endringer i pH-verdien når innlemmet i polymeren stillaset, og også at fremgangsmåten for sterilisering av stillasene ikke forårsake noen skadelige effekter på føle evne til pH nanosensorer. Videre nanosensorer ble levert til den intracellulære miljø av celler dyrket på PLGA stillasene der hvore cellulær respons på endringer i Phi kan overvåkes. Forholdet mellom de fluorescensintensiteter fra FAM og TAMRA ble brukt til å overvåke Phi og sammenlignet med en pH-responsive stillaset, noe som tyder på at de 3T3 fibroblast celler har opprettholdt et PHI i området pH 6,8 til 7. Ruger 3T3 fibroblaster transfektert med nanosensorer med atom flekken Draq5 indikerte at de fleste cellerelaterte nanosensorer ikke ble plassert i det kjernefysiske området. Nanosensor plassering synes ikke å være innenfor sure avdelinger som endosomes eller lysosomer som bestemmes ved inkubasjon nanosensor transfektert 3T3 fibroblaster med LysoTracker Red, hvor samlokalisering av FAM og LysoTracker Red ville bli avbildet av gule piksler i confocal bilder. Videre studier som analyse ved transmisjonselektronmikroskopi (TEM) og identifikasjon av biologiske markører for internaliseveier kunne kontrollere denne ytterligere. I tillegg, langtidsstudier som tid-løst konfokalmikroskopikunne fastslå den langsiktige skjebne nanosensorer innenfor celler dyrket på egenrapportering stillaser. Ved nanosensorer skulle leveres til andre celletyper, og deres plassering bør identifiseres som et resultat ikke kan være den samme som den som er vist her.
Bruk av selvrapportering stillaser har potensial til invasivt overvåke microenviron forhold innen vev konstruert konstruksjoner. Å ha evnen til å utføre in situ målinger kan gjøre det mulig å optimalisere veksten av 3D vev konstruerer in vitro invasivt og i sanntid. Den cytoplasmatiske plasseringen av pH-responsive nanosensorer kan benyttes for å overvåke phi under pågående forsøk. De nanosensorer som leveres til det interne miljøet i celler eller egenrapportering stillaser kan både brukes innen statiske eller dynamiske vevkultursystemer og kan føre til fastsettelse av kultur vilkår som kreves for optimal vekst av vev konstruert konstruksjoner ivitro. Videre utvikling kan føre til et on-line system som virker på næringsutarming sikre en jevn forsyning av næringsstoffer og oksygen i hele konstruksjonen, til syvende og sist gi en reproduserbar metode for kulturen i vev konstruksjoner.
De beskrevne protokoller er fremstilt stillas med dimensjoner som passer for å tillate avbildning ved hjelp av konfokal mikroskopi imidlertid å muliggjøre større 3D konstruksjoner som skal avbildes multifoton eksitasjon kan være nødvendig for å tillate avbildning innen dypere konstruksjoner. Det optiske utstyr som brukes for eksempel som et mikroskop-objektiv bør velges for å bestemme den optimale arbeidsavstanden for objektivet og konstruktet dimensjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Finansiering fra BBSRC er vennlig erkjent (stipend nummer BB H011293 / 1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Fisher | 32221 | |
| Anhydrous dimethylformamide (DMF) | Sigma | 270547 | |
| Ammonium hydroxide 50% (v/v) aqueous solution | Alfa Aesar | 35574 | diluted to 30% (v/v) with pure water |
| TEOS | Sigma | 13190-3 | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma | A3648 | |
| 5-(and-6)-carboxyfluorescein, succinimidyl ester (FAM-SE) | Invitrogen | C1311 | |
| 6-carboxytetramethylrhodamine, succinimidyl ester (TAMRA-SE) | Invitrogen | C1171 | |
| Sodium phosphate monobasic (0.2 M) | Sigma Aldrich | S-9638 | |
| Sodium phosphate dibasic (0.2 M) | Sigma Aldrich | S-0876 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | S8045 | |
| Trypsin/EDTA | Sigma Aldrich | T4174 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6046 | |
| FBS | Source Bioscience | Batch-213-101992 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Optimem | Invitrogen | 11058-021 | |
| LysoTracker Red | Invitrogen | L-7528 | |
| Draq5 | Biostatus Ltd | DR50050 | |
| Nitrogen gas | BOC | ||
| DCM | Sigma Aldrich | 320269 | |
| TFA | Sigma Aldrich | T6508 | |
| Confocal microscope | Leica TCS-SP | equipped with argon and krypton lasers and a 63X 0.9NA water immersion lens | |
| UV light | UVLS28 UVP, USA | ||
| Stirrer plate | SB161-3 Jencons-PLS | ||
| pH meter | Jenway model 3510 | ||
| Rotary Evaporator | Buchi Rotary Evaporator R200 | ||
| Centrifuge (nanosensors) | Hermle Z300 | ||
| Centrifuge (cell culture) | Thermo Scientific Heraeus Biofuge Primo | ||
| Vortex | Whirlimixer Fisherbrand | ||
| Ultrasonicator | FB11021 Fisherbrand | ||
| Aluminum sheet | Nottingham University | ||
| 35mm cell culture plate | Iwaki | 3000035 | |
| 10 ml syringe | Becton Dickenson | ||
| 3T3 Fibroblast cells | European Collection of Cell Cultures | ||
| PLGA | Lakeshore Biomaterials | 7525 DLG 7E | |
| Pyridinium formate | Sigma Aldrich | P8535 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S5136 | |
| HCl | Sigma Aldrich | 320331 |
References
- Takimoto, Y., Dixit, V., Arthur, M., Gitnick, G. De novo liver tissue formation in rats using a novel collagen-polypropylene scaffold. Cell Transplantation. 12 (4), 413-421 (2003).
- Sales, V. L., Engelmayr, G. C., et al. Protein precoating of elastomeric tissue-engineering scaffolds increased cellularity, enhanced extracellular matrix protein production, and differentially regulated the phenotypes of circulating endothelial progenitor cells. Circulation. 116 (11), I55-I63 (2007).
- Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nature Materials. 4 (7), 518-524 (2005).
- Li, D., Xia, Y. N.
- Sill, T. J., von Recum, H. A. Electro spinning: Applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29 (13), 1989-2006 (2008).
- Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. Electrospinning of polymeric nanofibers for tissue engineering applications: A review. Tissue Engineering. 12 (5), 1197-1211 (2006).
- Sawyer, N. B. E., Worrall, L. K., et al. In situ monitoring of 3D in vitro cell aggregation using an optical imaging system. Biotechnology and Bioengineering. 100 (1), 159-167 (2008).
- Dan, L., Chua, C. K., Leong, K. F. Fibroblast Response to Interstitial Flow: A State-of-the-Art Review. Biotechnology and Bioengineering. 107 (1), 1-10 (2010).
- Pancrazio, J. J., Wang, F., Kelley, C. A. Enabling tools for tissue engineering. Biosensors & Bioelectronics. 22 (12), 2803-2811 (2007).
- You, Y., Lee, S. W., Youk, J. H., Min, B. M., Lee, S. J., Park, W. H. In vitro degradation behaviour of non-porous ultra-fine poly(glycolic acid)/poly(L-lactic acid) fibres and porous ultra-fine poly(glycolic acid) fibres. Polymer Degradation and Stability. 90 (3), 441-448 (2005).
- Dong, Y. X., Liao, S., Ramakrishna, S., Chan, C. K. Distinctive degradation behaviors of electrospun PGA, PLGA and P(LLA-CL) nanofibers cultured with/without cell culture. Multi-Functional Materials and Structures. 47 - 50, 1327-1330 (2008).
- Xu, Y. H., Sun, J. J., Mathew, G., Jeevarajan, A. S., Anderson, M. M. Continuous glucose monitoring and control in a rotating wall perfused bioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 87 (4), 473-477 (2004).
- Harrington, H. C., Rose, F. R. A. J., Reinwald, Y., Buttery, L. D. K., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. Electrospun PLGA fibre sheets incorporating fluorescent nanosensors: self-reporting scaffolds for application in tissue engineering. Analytical Methods. 5 (1), (2013).
- Wang, X. Y., Drew, C., Lee, S. H., Senecal, K. J., Kumar, J., Sarnuelson, L. A. Electrospun nanofibrous membranes for highly sensitive optical sensors. Nano Letters. 2 (11), 1273-1275 (2002).
- Yang, Y., Yiu, H. H. P., El Haj, A. J. On-line fluorescent monitoring of the degradation of polymeric scaffolds for tissue engineering. Analyst. 130 (11), 1502-1506 (2005).
- Blackwood, K. A., McKean, R., et al. Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement. Biomaterials. 29 (21), 3091-3104 (2008).
- Bashur, C. A., Dahlgren, L. A., Goldstein, A. S. Effect of fiber diameter and orientation on fibroblast morphology and proliferation on electrospun poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) meshes. Biomaterials. 27 (33), 5681-5688 (2006).
- Li, W. J., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. Electrospun nanofibrous structure: A novel scaffold for tissue engineering. Journal of Biomedical Materials Research. 60 (4), 613-621 (2002).
- Sung, H. J., Meredith, C., Johnson, C., Galis, Z. S. The effect of scaffold degradation rate on three-dimensional cell growth and angiogenesis. Biomaterials. 25 (26), 5735-5742 (2004).
