Summary
생체의 pH 응답 졸 - 겔 나노 센서는 폴리 (락트산 - 코 - 글리콜 산) (PLGA) 전기 방사 지지체에 혼입 될 수있다. 생성 된 자기보고 지지체는 지지체에 세포를 배양하는 동안 미세 환경 조건 인 시츄 모니터링에 사용될 수있다. 3D 셀룰러 구조는 실험을 방해하지 않고 실시간으로 모니터링 할 수있는 이는 유익하다.
Abstract
적절한 지지체에 3 차원 배양 세포는 더 생체 내 미세 환경을 모방 및 세포 - 세포 상호 작용을 증가하는 것으로 생각된다. 그 결과 3 차원 세포 구조는 종종 차원에서 연구와 유사한 실험을보다 분자 이벤트 및 세포 - 세포 상호 작용을 공부에 더 관련이있을 수 있습니다. 발판에 걸쳐 높은 세포 생존 능력과 효과적인 3D 문화를 만들려면 산소주의 깊게 분석 농도 구배로 제어 할 산도 필요로 배양 조건은 3 차원 구조 전반에 걸쳐있을 수 있습니다. 여기에서 우리는 많은 포유 동물 세포의 문화에 대한 자신의 이후의 준비와 함께 (락트산 - 코 - 글리콜 산) (PLGA) 전기 방사 발판으로 생체 적합성의 pH 반응 졸 - 겔 나노 센서 및 그 설립을 준비하는 방법을 설명합니다. 산도 반응 발판은 3 차원 세포 구조 내에서 미세 환경의 산도를 결정하는 도구로 사용할 수 있습니다. 또한, 세부에게 산도 반응 nanose의 전달을 우리성장 전기 방사 PLGA 지지체에 의해 지원되었다 포유 동물 세포의 세포 내 환경에 nsors. 산도 응답 나노 센서의 세포질 위치는 전진 동안 실험 세포 내 산도 (PHI)를 모니터링하는 데에 이용 될 수있다.
Introduction
조직 공학의 주요 전략은 형태는 교체 예정의 조직과 유사하며 세포 성장 및 1,2 함수를 지원할 수 지지체를 제조하는 생체 적합성 물질의 사용이다. 비계는 세포 부착 및 증식이 아직 3 차원 세포 구조의 틈새를 통해 세포 이동을 할 수 있도록하여 기계적인 지원을 제공합니다. 비계는 세포의 영양분의 질량 수송을 허용하고 신진 대사 폐기물 3의 제거를 방해하지 않아야합니다.
전기 방사는 세포 성장의 4-6 지원할 수있는 고분자 지지체의 제조를위한 유망한 방법으로 떠오르고있다. 그들은 종종 다공성이며 3D 셀룰러 구조 (7)의 간극을 통하여 세포 - 세포 상호 작용뿐만 아니라 세포 이동을 허용로서 생성 부직포 전기 방사 섬유 세포 성장에 적합하다. 그것은 t 중에 세포 생존을 모니터링하는 것이 중요그는 문화의 기간 및 그 세포 생존을 보장하기는 3D 구조의 전체에 걸쳐 유지된다. 분석 농도 구배가 3D 구문에 존재할 수있는 예를 들어, 이러한 산소와 pH가 배양 조건, 조심 제어를 필요로합니다. 생물 반응기 또는 관류 시스템은 격자 간 흐름의 생체 내 조건에서 결과적 증가 영양소 입금 및 대사 폐기물 제거 8로 모방하기 위해 사용될 수있다. 이러한 시스템은 일정한 미세 환경 조건을 보장하는지 여부의 질문에 실시간으로 셀룰러 미시를 평가함으로써 해결 될 수있다.
실시간으로 모니터링 할 수있는 키 미시 메트릭은 다음을 포함한다 : 온도, 셀 매체의 화학적 조성, 용존 산소와 이산화탄소의 농도, 산도, 다습. 이러한 메트릭, 온도가 가장 쉽게 현장 프로브에 사용하여 모니터링 할 수 있습니다. 일반적으로 잔존 나열된 메트릭을 모니터링하기위한 방법따라서 volve 샘플링에 대한 나누어지는 제거하고 세포 배양을 방해하고 오염의 위험을 증가시킨다. 연속, 실시간 방법이 모색되고있다. 현재 모니터링 방법은 일반적으로 물리적으로 pH를 모니터 또는 산소 프로브와 같은 세포 구조를 조사 악기에 의존한다. 그러나 이러한 침입 방법은 세포 구조를 손상 지속적인 실험을 방해 할 수 있습니다. 3D 구조 내에서 분석 농도의 비 침습적 모니터링은 영양 고갈 9 등 다양한 환경 적 측면의 실시간 모니터링을 가능하게 할 수 있습니다. 이 구조 내에서 깊은 지역에 영양 공급의 평가를 허용하고 신진 대사 폐기물을 효과적으로 10,11 제거되는 여부를 결정하는 것입니다. 침입의 문제를 해결하기위한 시도 시스템은 일반적으로 pH가, 산소를 모니터링하고 12 포도당 배양 용기 모두를 통해 외부 센서에 배양액을 통과 관류 챔버의 사용을 수반한다.드레 직접 샘플링 분취 액의 제거를 필요로하지 않고 같은 시츄 모니터링에 제공 할 배양 용기에 통합 될 수있는 센서의 개발에 대한 관심이 높아지고있다.
현장과 우리가 자기보고 발판 (13)을 생성하는 전기 방사의 발판으로 분석 반응하는 나노 센서를 통합 한 미세 환경 조건의 비 침습적 모니터링에 대한 이러한 단점을 해결하기 위해. 감지 장치는 전기 방사에 의해 또는 종래 골격 형성 14,15로 중합체에 혼입된다 분석 반응 염료의 사용을 통해 생성 된 실제 고분자 지지체 하나 어디에 형광 활성을 모니터링함으로써 같은 촬상 장치의 역할을 지지체는, 미리 제조 된 . 그러나, 이러한 촬상 장치는 다른 분석에서 가능한 간섭으로 인한 잘못된 광 출력을 줄 가능성이있다. 비율 적 감지 장치 스와의 사용설명 된 프로토콜에서 제조 된 것과 같은 채널이 가능한 부작용을 제거하고 해당 분석 물에 대한 특정 응답을 제공하는 잠재력을 보유하고있다.
여기에 제시된 전기 방사의 발판이로 인해 선택, 합성 공중 합체 폴리 (락트산 - 코 - 글리콜 산) (PLGA)로부터 제조 된 식품의 약국의 생분해 성 및 생체 특성으로 인해 관리 (FDA) 승인 및 추적하는 데 다양한 세포 유형 16-18의 성장 및 기능을 지원하는 기록. 제조 된 비율 계량 분석 응답 나노 센서는 산도에 반응합니다. 나노 센서가 하나의 염료, FAM은 산도에 응답하고, 다른 생체 적합성 인 졸 - 겔 매트릭스로 두 형광 염료를 통합, TAMRA는 산도에 응답 아니므로 내부 표준으로서 작용한다. 그들은 크게 겹치지 않는 더욱이 TAMRA FAM 및 양쪽의 형광 별도로 분석 할 수있다. 형광 EMI의 비율을 결정특정 파장에서 두 염료 (투약) 소지는 다른 환경 조건의 독립의 pH 응답을 제공합니다. 자기보고 비계가 개발 한 3D 모델을 방해하지 않고 현장에서 실시간으로 pH를 반복 평가를 허용 할 수 있습니다. 우리는이 지지체는 세포 부착 및 증식을 지원할 수있는 문제의 분석에 응답하여 남아 있는지 보여 주었다. 설계 구조의 부산물 산성의 반응 속도는 understudied 아르 유지와 같은 산도 반응 발판을 사용하여 크게 이러한 연구 19을 용이하게 할 수 있습니다. 또한, 조직 공학 응용 프로그램에 대한 자기보고 발판의 사용 기회를 완전히 이해 모니터와 체외에서 3D 모델의 조직 구조의 성장, 비 침습적으로 실시간으로 최적화를을 제공합니다.
산도 반응 나노 센서는 전기 방사 PLGA의 scaffol에 따라 배양 섬유 아세포의 세포 내 환경에 배달 된DS. 염료의 형광 발광의 비율은 피를 모니터링하는 데 사용하고 자기보고 골격 도입 산도 나노 센서에 비교 하였다. 3D 환경에서 배양 된 세포에 나노 센서의 배송이 깊은 비파괴 방식으로 구문에 분석 농도의 모니터링을 가능하게 할 수 있습니다. 따라서 나노 센서 비파괴 3D를 통해 세포 행동을 평가하기 위해 실행 가능한 이미징 도구 장기 분석을 허용 생성 할 수있다. 3D 구조 내의 개별 세포의 분석 농도를 선별가 충분한 영양과 산소 농도를 받고있는 것을 확신 할 수있을 것입니다. 모니터링 프로세스 파라미터는 산소와 영양분의 효과적인 대량 수송을 위해 표준화 된 기술의 개발에 도움이 있었다. 세포 내 환경과 고분자 지지체에 나노 센서의 결합으로 나노 센서의 배송은 3 차원 CONST 내에서 세포 생존 능력의 평가뿐만 아니라 비계 성능을 허용하기 위해 결합 될 수있다조직 성장 프로세스 동안 ructs. 이것은 이러한 구조의 지식 증가로 이어질 생물학적으로 관련 조직 대체물의 제조를 진행 할 수 있습니다.
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Protocol
개요
제 1 반응은 pH가 나노 센서와 SEM을 이용하여 형광 분석법 및 사이즈를 이용하여 pH를 행 나노 센서 응답의 특성화의 제조를 설명한다.
2 장에서는 전기 방사 된 고분자 지지체 및 SEM을 사용하여 형태와 크기의 특성의 준비에 대해 설명합니다. 섹션 2는 pH가 반응 나노 센서의 포함과 함께 전기 방사 공중 발판 자기보고 지지체의 제조 방법을 설명합니다. 그 결과 자기보고 발판은 전기 방사 섬유의 모든 형태 학적 변화가 발생했는지 여부를 평가하기 위해 SEM을 특징으로한다. 통합 된 나노 센서에서 발생하는 자기보고 발판에서 형광 공 초점 현미경에 의해 평가된다.
3 장에서는 전기 방사 비계와 자기보고 지지체에 세포의 문화를 설명합니다. 발판은 먼저 프레파라트에 멸균비계는 살균과 세포의 문화가 자기보고 비계의 형광 기능에 영향을 미치는 여부를 결정하기 위해 평가하는 세포 배양 다음에 대한 이온. 프로토콜은 전기 방사 지지체에 배양하는 세포에 나노 센서의 전달을 설명합니다. Lysotracker 염료는 나노 센서는 휴대 산성 구획으로 수행되지 않았 음을 확인하는 데 사용됩니다.
1. 준비 및 산도 응답 졸 - 겔 나노 센서의 분석
산도 응답 졸 - 겔 나노 센서의 1.1 준비
참고 :이 준비 흄 후드에서 수행해야합니다.
- (및-6) - 카르복시, 숙신 에스테르 디메틸 포름 아미드 (FAM-SE) (1.5 mg)을 (DMF) (1 ㎖) 라운드 플라스크와 6 carboxytetramethylrhodamine을 바닥 - 5를 용해하여 pH를 나노 센서 내에서 사용하기 위해 형광 준비 또 다른 라운드에서 숙신 에스테르 DMF에 (TAMRA-SE) (1.5 mg)을 (1 ㎖) 바닥 플라스크.각 플라스크에 3 - 아미노 프로필 트리에 톡시 실란 (APTES) (1.5 mL)을 추가하고 어둠 속에서 24 시간 동안 건조 질소 분위기 (21 ° C)에서 교반 즉 호일 샘플을 감싸줍니다.
- 둥근 바닥 플라스크에 포함 된 에탄올의 혼합물 (6 ㎖)과 수산화 암모늄 (30 중량 %, 4 ㎖)에 위의 염료 (250 μL)의 양을 추가하고 1 시간 (21 ° C)에 저어.
- 천천히 추가로 2 시간 동안 교반 계속 혼합물에 테트라 에틸 오르토 실리케이트 (TEOS) (0.5 ㎖)를 추가합니다. 혼합물 흐린 켜집니다. 나노 센서는 회전 증발에 의해 수집 될 수 있습니다. 나노 센서는 향후 사용을 위해 4 ℃로 유리 바이알에 저장 될 수있다.
주의 : 자신의 마른 형태의 나노 센서의 추가 처리가 연기 후드 또는 균형 Weighsafe 예를 들면, 묶어야합니다 그 무게의 경우 수행해야합니다.
pH가 1.2 나노 센서 응답
- 믹시에 의해 산도 5.5-8.0에 이르기까지 Sørensen의의 인산염 완충 용액을 준비나트륨 인산 (0.2 M) 및 제 2 인산 나트륨 (0.2 M) 스톡 용액 NG 특정 비율. pH 미터를 사용하여 최종 pH를 확인합니다. 수산화 나트륨 (NaOH를) (4 M) 또는 염산 (HCL) (2 M)를 사용하여 산도에 대한 약간의 조정을합니다.
- 이 솔루션은 흐린 될 때까지 먼저 다음 초음파 세척기에서 선박을 잠수 3 분의 소용돌이에 나노 센서 솔루션을 포함하는 용기를 개최하여 pH를 버퍼 (5 ㎎ / ㎖)의 산도 나노 센서를 일시 중단 (약 5 분). 완전히 용액에 나노 센서를 일시 중단이 단계를 반복합니다.
- 광 베트로 최초의 솔루션을 놓고 5에 488 ㎚의 여기 파장을 사용 - (및-6) - 카르복시 (FAM)와 6 carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) 568 nm의. FAM과 TAMRA는 형광 분광계를 사용하는 558-580 nm의에 대한 500-530 nm의 방출 파장을 수집합니다.
- pH가 다른 pH에서 관찰 할 수 있도록 광 큐벳에서 해법을 변경 및 C를 계속발광 스펙트럼을 ollecting.
- 교정 곡선을 생성하기 위하여 각각의 pH 값에서 생성 발광 최대 값의 비율을 계산한다.
나노 센서의 1.3 SEM
- 탄소 코팅 전자 현미경 스텁에 나노 센서의 샘플을 놓고 아르곤 분위기에서 5 분 동안 금으로 코팅 스퍼터.
- 주사 전자 현미경 (SEM)으로 관찰한다. 전자 충전 (그림 1)을 최소화하기 위해 작동 거리, 전압 및 배율을 조정 이미징 동안.
2. PLGA 발판의 준비 및 분석
2.1 전기 방사 PLGA 발판
- 흄 후드에서 폴리 피리 디늄 메이트와 디클로로 메탄 (락트산 - 코 - 글리콜 산) (PLGA) (DCM) (20 % (w / w)) (PF) (1 % (W / W))를 녹입니다. 18 G 무딘 채우기 바늘과 주사기 펌프에 안전하게 적합으로 10 ML의 주사기로 솔루션을 놓습니다.
- 거리를 20 cm (20)의 바늘 끝 거리cm X 15cm 알루미늄 포집 판.
- 알루미늄 집 전판에 주사기 지구의 선단부에 고전압 전원 장치의 전극을 부착.
주의 : 관리는 높은 전압 즉, 항상 전기 방사 장비 중 하나를 처리하기 전에 전기 공급을 끄고 사용주의해야한다. - 2 시간 동안 12 kV의에 3.5 m / h의 일정한 유속을 이용하여 솔루션을 제공. 이러한 조건을 사용하여 전기 방사는 약 60 ㎛의 발판 깊이를 제공 할 것입니다.
- 용매 잔류 물이 증발 할 수 있도록 24 시간 동안 흄 후드의 발판을 남겨주세요.
2.2 전기 방사의 pH 응답 PLGA 발판
- 섹션 2.1에 있지만 고분자 용액 (5 ㎎ / ㎖)에 나노 센서를 추가로 수정 한 바와 같이 pH를 응답하여 나노 센서를 통합 발판을 준비한다. 초음파의 도움을 PLGA 솔루션의 나노 센서를 일시 중단 (약 5 분) 이전 10 ML의 주사기에 배치합니다.
2.3 PLGA 비계의 SEM과의 pH 응답 비계
- 탄소 코팅 전자 현미경 스텁에 PLGA 지지체 또는 산도 반응 발판의 샘플을 놓고 나노 센서의 SEM (그림 1)에 설명 된대로 진행합니다.
산도 응답 비계의 2.4 교정
- 35mm 배양 접시에 산도 반응 발판의 샘플을 놓고 적절한 완충 용액에 담그지.
- 공 초점 현미경에 나노 센서 내에서 TAMRA을 자극하는 FAM과 568 nm의 크립톤 레이저를 자극하는 488 nm의 아르곤 레이저를 사용합니다. FAM과 TAMRA에 대한 558-580 nm의에 대한 500-530 nm에서의 pH 반응 발판의 형광 방출을 관찰합니다. (그림 2). 여기 파장의 수집을 방지하기 위해 순차적 인 검색을 사용합니다.
3. PLGA 발판과의 pH 응답 PLGA 발판에 따라 세포 배양
ntent "> 주 : 다음은 세포 배양 캐비닛에서 수행되어야한다.세포 배양을위한 PLGA 발판 3.1 준비
- 2cm 2 조각으로 PLGA 또는 산도 반응 PLGA 지지체를 잘라.
- 15 분 각면 8 cm의 거리에서 자외선 (UV) 빛을 조사하여 발판을 소독.
- 12 잘 문화 판에 발판을 전송하고 상단에 스틸 링을 배치합니다. (5 % V / V) 내부에 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)와 스틸 링 밖에서 밤새 품어 페니실린 / 스트렙토 마이신의 솔루션을 추가 (37 ° C, 5 % CO 2). 2cm 외부 직경 1cm 내부 직경 1 cm 깊이 : 강철 반지는 노팅엄 대학에서 제조 다음과 같은 차원이되었다합니다.
- 살균 용액을 제거하고 PBS로 세척.
- (500 μL) 및 외부 (500 μL) 스틸 링, 인큐베이터에있는 곳 (37 ° C, 5 % CO 2 내부에 세포 배양 배지를 추가
- 세포 현탁액을 준비하고 트리 판 블루 배제 분석을 사용하여 세포 수를 수행합니다.
- 1 × 106 세포 / ml의 세포 수를 달성하기 위해 세포 현탁액을 만들기.
- 스틸 링의 내부와 외부에서 용지를 제거합니다.
- 스틸 링 (1 평방 미터)의 외부에 데워진 세포 배양 배지로 교체하십시오.
- 스틸 링의 내부에 세포 현탁액 300 μl를 추가합니다 - 바위 플레이트 앞뒤로 부드럽게 세포를 배포합니다.
- 인큐베이터로 세포 배양 접시를 놓고 (37 ° C, 5 % CO 2) - 2-3 일마다 미디어를 새로 고침 - 세포 부착 그러나 한 실험이 필요로에 대한 문화를 계속, 24 시간 내 자리를 차지한다.
PLGA 비계에 배양 된 세포에 3.2 나노 센서 납품
- 3.1 절에 설명 된대로 PLGA 지지체 위에 종자 세포. 이 연구 빈 PLGA 지지체 (하지 contai에 대한이미징 때 닝 나노 센서가)에 의한 형광 방출의 중첩에 사용되었다.
- (37 ° C, 5 % CO 2) 72 시간 동안 세포 전달 나노 센서하기 전에 발판에 걸쳐 성장하고 마이그레이션 할 수 있도록 인큐베이터로 세포 시드 발판을 놓으십시오.
- 배달 나노 센서에 앞서 1 시간 (37 ° C, 5 % CO 2) 배양, PBS로 세포를 씻어 표준 배지에서 항생제 및 혈청 무료 미디어에 미디어를 변경합니다. 참고 : 3T3 세포에 대한 표준 배지는 소 태아 혈청 (10 % (V / V)), L-글루타민 용액 (2 ㎜), 페니실린 / 스트렙토 마이신과 보충 둘 베코의 수정 된 이글 매체의 구성 (1 % (V / V)) .
- 배양 기간 동안 간단히 솔루션 A.을 만들 티멤 (50 μL)와 나노 센서 (5 mg)을 초음파 처리하여 나노 센서 - 리포좀 복합체를 제조
- 티멤 (45 μL)에 리포 펙 타민 2000 (5 μL)를 추가하여 용액 B를 만들고 5 분 실온에서 알을 품다.
- 솔루션 추가용액 B에, 나노 센서 - 리포좀 복잡한 솔루션 C를 형성하기 위해 20 분 동안 실온에서 품어.
- 세포에 용액 C (100 μL)를 첨가하고 3 시간 동안 (37 ° C, 5 % CO 2) 배양.
- 인큐베이터, 대기음 미디어에서 셀 시드 발판을 제거하고 공 초점 현미경으로 살아있는 세포의 시각화를 허용하는 PBS (1 ㎖)를 추가하기 전에 PBS로 두 번 세척한다. 참고 : 다른 pH에서 보정이 수행되고 있었기 때문에 세포 배양 배지에 존재하는 페놀 빨간색 표시도 자기 형광을 일으킬하지 않고되도록 PBS는이 프로토콜에 사용되었다. 그러나 페놀 레드 무료 미디어는 세포 배양의 장기 분석을 위해 사용될 수 있습니다.
- 다른 pH를 버퍼에 셀 시드 발판을 담그고 세포와 관련된 나노 센서의 반응을 모니터링 할 수 있습니다.
- 공 초점 현미경 (Figu를 사용하여 형광을 관찰함으로써 및 TAMRA FAM에서 형광 농도의 비율을 결정함으로써 피를 모니터링다시 3).
포유 동물 세포 내에서 3.3 나노 센서 위치
- 로 3.2의 설명 FAM 염료 (TAMRA의 형광 방출이 LysoTracker 레드와 같은 스펙트럼 영역에 있기 때문입니다)를 포함하는 나노 센서와 세포를 품어. 1.1 절에 있지만, 준비하고 TAMRA를 추가 생략하여 설명한 바와 같이 이러한 나노 센서를 준비합니다.
- 나노 센서의 납품 기간에 따라 50 nm의 LysoTracker 레드 원액을 희석.
- PLGA 인공 지지체에 배양 세포에 희석 용액 (2 μL)의 분취 량을 추가합니다.
- 1 시간 (37 ° C에서 5 % CO 2)에 LysoTracker 레드와 세포를 품어.
- 배양 기간에 따라 용지를 제거하고 공 초점 현미경을 사용하여보기위한 준비 (산도 7.4) (2 ㎖) PBS에 미디어를 변경하기 전에 PBS (산도 7.4)로 두 번 세포를 씻으십시오. 주 : 페놀 레드 무료 미디어 대신 PBS로 사용할 수 있습니다.
- 핵 얼룩 드라 추가PBS에 Q5 그래서 최종 농도는 5 μM과 3 분 (37 ° C 5 % CO 2)의 세포 배양이다. 그것은 DRAQ5와 잠복기 다음 용지를 변경할 필요가 없다.
- 650 만 나노 센서 DRAQ5 발색단을 흥분과 500-530 nm의 580-600 nm에서 형광을 관찰 할 수 LysoTracker 레드와 633 nm의 헬륨 / 네온 레이저를 자극 할 수있는 568 nm의 크립톤 레이저를 FAM을 자극하는 488 nm의 아르곤 레이저를 사용하여 -750 (그림 3) 각각 nm의. 여기 파장의 수집을 방지하기 위해 순차적 인 검색을 사용합니다.
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Representative Results
준비된 산도 응답 나노 센서의 크기 분포는 묘화 나노 센서의 인구가 측정 및 240-470 nm의 (도 1a)의 범위 내에서 나노 미터 크기를 갖는 것으로 하였다 SEM을 사용하여 분석되었다. 좁고 비교적 작은 직경의 과제는 나노 입자를 제조 Stöber 메서드를 사용과 일치한다. 그것은 산성 조건을 사용하여 제제가 입경 넓은 분산을 생성하는 반면 나노 입자 Stöber 방법을 사용하여 나노 입자의 합성 중에 염기성 pH 환경 준비 IE하여, 사이즈의 양호한 제어를 허용하는 것이 발견되었다. 설명 된 방법을 사용하여 제조 된 PLGA의 전기 방사 섬유의 대표적인 SEM 현미경 사진이 생성 된 PLGA 지지체가 섬유는 나노 미터 치수가 최소한의 구슬 장식이나 파손을 표시 부직포 섬유로 구성되어 있음을 보여주는 그림 1B에 표시됩니다. 그림 1C ㎖를도 1b에 대조 샘플에 필적 섬유, SEM 현미경 사진은 섬유의 표면에 나노 센서 협회의 증거를 제공 생기는 것을 증명하지만 그들이 모른다 또한 비계 섬유 내에 통합 할 수 이러한 발판 / 나노 센서 비계의 분해 연구는이 나노 센서의 성능에 영향을 미치는 여부를 확인하기 위해 SEM 및 / 또는 공 초점 현미경과 함께 수행 될 수있다.
PLGA 섬유에 결합 다음 자신의 광학 활성을 유지하는 나노 센서의 기능은 공 초점 현미경을 사용하여 자기보고 발판을 검사하여 확인 하였다. 비계 섬유에 혼입시 광학적 및 화학적으로 활성 상태로 유지하는 능력의 유지력은 모니터링 될 피 분석 물 농도를 사용 있었다. 나노 센서로부터 방출 된 형광 나노 센서가 r에 시연광학적 활동을 etained 및 비계 섬유와 연결되어 있습니다. 형광 염료 FAM (그린)으로부터 출사하고 pH를 반응 나노 센서에 통합 TAMRA (레드)는 각각도 2a 및도 2b에 도시된다. 이는 실현 가능한 피 분석 물 농도를 반응계에서 모니터링 할 수있게 긍정적 인 결과이다. 또한 광학 활성 비율 계량 나노 센서는 전기 방사 공정을 사용하여 PLGA 지지체 섬유에 포함 된 것은 이번이 처음이다. 나노 센서가 PLGA 섬유에 혼입 다음 형광 현미경을 이용하여 가시화 될 수 있음을 확인하는 데, 피 분석 물 농도 변화에 나노 센서 응답은 확인되었다. pH가 다른의 버퍼에 발판을 가라 앉히기하면 TAMRA 참조 염료에 띄게 변경하지 않은 의해 방출 된 형광 동안 FAM 염료의 형광 강도의 변화의 결과. 두 염료의 형광 강도의 비율은 자극에 사용될 수있다도 2c에 도시 된 바와 같이 검량선을 UCE. 나노 센서에 대한 교정 곡선은 단독으로 평가하고 전기 방사 PLGA 지지체에 통합 할 때 비교하고 나노 센서는 자기보고 골격에 결합 다음 자신의 광학 활성을 유지하는 것이 보여줍니다. 역으로 서로 다른 pH 값에 응답하는 자기보고 지지체의 능력 교대 5.5 및 7.5의 pH 값과 버퍼의 발판을 가라 앉히기에 의해 평가되었다. 가역성은 자기보고 발판 pH의 다수의주기 변화에 대응할 수있는 그림 2D에서와 같이 매우 좋은 것으로 밝혀졌다. 장기 연구는 나노 센서 내장시 PLGA 저하의 효과를 평가하기 위해 수행되지 않은, 그것이 나노 센서가 비율 적 반응을 제공하기 때문에, 본 나노 센서의 수량이 결과에 영향을 미치지 않을 것이다 것으로 생각된다.
분석 반응이 나노 센서는 liposom를 사용하여 전달했다성장 빈 PLGA 지지체에 의해 지원되었다 3T3 섬유 아세포의 세포 내 환경에 알 형질 에이전트. 빈 PLGA 인공 지지체에 따라 배양 3T3 섬유 아세포의 공 초점 현미경 이미지는 나노 센서가 각각 FAM과 TAMRA도 3a에 도시와 B에서 관찰 형광와 섬유 아세포의 세포와 연관되어 있음을 보여줍니다. 이 채널에서 형광을 오버레이하면 염료 (그림 3C 노란색 형광에 의해 묘사 된대로) 나노 센서 '생체 적합성 매트릭스 내 속은 남아있는 것을 제안, 두 염료의 형광 공동 현지화 된 것을 보여줍니다. 나노 센서는 FAM에서 공동 지역화 된 형광의 부족에 의해 입증 산성 구획에 포함 된 3T3 섬유 아세포와하지의 세포질 내에있는 것으로 생각되고 있습니다 만 나노 센서도 3D에 도시 Lysotracker 붉은 염료. 산도 반응 나노 센서의 형광 강도는 전달세포가도 3e에 도시되어있는 결과의 pH 변화를 실시 하였다 동안 3T3 섬유 아세포에 ED는 모니터링 하였다. 생성 된 그래프는 전기 방사 PLGA 지지체에 따라 배양 세포가 범위 6.8-7.0에서 피를 유지하고 있음을 보여줍니다.
그림 1. 나노 센서, PLGA 섬유와 자기보고 비계의 SEM 현미경 사진. (A) 구형 나노 미터 크기의 입자 (B)를 표시하는 pH가 반응 졸 - 겔 나노 센서 섬유 형태는 최소한의 구슬 장식과 파손 나노 센서가 돌출 될 관찰 할 수있다 (C) 액 반응자가보고 비계와 정규 PLGA의 전기 방사 부직포 섬유 PLGA 아직 섬유 형태는 나노를 포함하지 않는 제어 PLGA 섬유와 비교 남아ensors. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. 형광 PLGA 지지체 섬유와 관련된 나노 센서에서 관찰 할 수있다 산도 반응자가보고 비계의 공 초점 현미경 이미지. (A) FAM (녹색)의 pH 반응 염료와 (B) TAMRA (적색) 기준 염료. (C)의 pH 응답 졸 - 겔 나노 센서 및 pH가 반응 비계의 교정 그래프 demonstPLGA 비계 섬유 내에 통합 할 때 나노 센서의 광학 및 화학 반응이 영향을받지 않았 음을 속도. 산도 5.5 pH가 7.5의 대체 버퍼 솔루션의 발판을 가라 앉히기에 의해 수행 된 자기보고 발판의 (D) 가역성은. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. 세포 내면화 된 나노 센서 및 pH와 피 응답의 그래프. 형광 공 초점 현미경 이미지 내면화 나노 센서에서 (A) FAM (녹색) (B) TAMRA (빨강) (C) FAM과 TAMRA에서 형광의 공동 현지화 (노란색) ( D) FAM은 나노 센서 (녹색) 3T3 섬유 아세포 문화에 전달핵의 DRAQ5 (마젠타) 표시와 리소좀의 LysoTracker 레드 (빨강) 표시와 PLGA 지지체에 따라 D. FAM과 Lysotracker 레드의 fluoresence 따라서이 나노 센서는 (E) 피 측정 pH 보정에 비해 빈 PLGA 지지체에 따라 배양 3T3 섬유 아 세포에 전달 나노 센서에서 가져온 휴대 산성 구획으로 내면화 된 것 같지는 않다 시연 공동 지역화되지 않습니다 세포의 배양없이 pH를 감지 발판. 이것은 또한 pH 측정은 전기 방사 PLGA 지지체에 따라 배양 세포가 범위 6.8-7.0에서 피를 유지하고있다으로 내면화 된 나노 센서는 산성 수 없습니다 사용하여 수행 할 수 있다는 사실을 보여줍니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
조직 공학은 특정 조직이나 기관의 기능을 수리, 교체, 유지 또는 향상시키기 위해 생체 조직 모델과 같은 생체 조직 대체 요법에 모두로 사용할 수있는 생물학적 대체를 만드는 목표로. 몇 년 교체하거나 조직의 원조 수리 그러나이 자주 인해 궁극적으로 거부하거나 추가 재수술에 이르게 호스트 조직 및 / 또는 감염, 가난한 통합에 실패하는 합성 대체가 사용되었습니다. 주입 이전에 실험실에서 생체 조직 생성은 완전 통합을 달성하는 문제를 해결하고 치환술에 대한 필요성을 감소시킬 수있다. 그러나 실현이 목표에 적합한 생체 외 전파와 3D 구조 내에서 세포의 조작은 체외에서 조직의 적절한 육체적 인 조절과 결합되어야한다. 이것은 하나의 근본적인 생물학에 대한 연구를 계속 진행되는 다수의 방식으로 달성 될 수있다참여뿐만 아니라, 합성 대체의 생산에 관련 엔지니어링 및 제조 문제를 조회. 그것은 설명 프로토콜이 기여하는 것을 목표로하는 것이 후자의 문제입니다.
기재된 PLGA 지지체의 사용 목적은 생물학적으로 중요한 구조로 그들의 성장을 지원하기 위해 포유 동물 세포로 임시지지를 제공하는 것이다. PLGA 인공 지지체로 분석 반응 나노 센서의 설립은 지역 분석 농도는 조직의 성장 과정에서 3 차원 구조를 통해 모니터링 할 수 있습니다. 산도 반응 발판의 사용은 부산물 발판 저하 및 세포로 생성 된 산성 효과적으로 3 차원 구조 내에서 제거되는 자라다 여부의 결정을 허용 할 수 있습니다. 이것은 프로세스 모니터링 및 체외 조직 재생 공정의 제어의 전류 부족을 해결 향해 단계이다. 자신이 장치를 감지하는 발판의 활용으로 가능하게 할 수있다현장 실시간 미세 환경 평가. 조직을 손상시키지 않고 구조의 미세 환경을 모니터링하는 것은 필수적이며, 조직의 생산의 모든 단계에서 프로세스 모니터링을 허용합니다.
로컬 분석 물 농도를보고 생성 pH가 반응 지지체의 기능은 공 초점 현미경을 이용한 나노 센서로부터 형광 출력을 모니터링함으로써 평가되었다. 교정 실험은 pH를 감지 발판 수행 및 PLGA 섬유에 포함되지 산도 반응 나노 센서의 비교 입증했다. 검량선을 생산하는 능력은 나노 센서가 비계의 살균 처리가 산도 나노 센서의 감지 능력에 어떤 해로운 영향을 유발하지 않았다는 것을 또한 고분자 지지체에 혼입하여 pH의 변화에 응답하여 남아 있는지 보여준다. 또한, 나노 센서는 PLGA 지지체에 배양 세포의 세포 내 환경에 전달했다 어디 있나피 변화에 전자 세포 반응을 모니터링 할 수 있습니다. FAM 및 TAMRA에서 형광 농도의 비율은 피를 모니터링하는 데 사용하고 pH를 응답하여 비계에 비해, 3T3 섬유 아세포는 6.8-7의 pH 범위에서 피를 유지 한 것을 제안 하였다. 핵 얼룩 DRAQ5와 나노 센서로 형질 보육 3T3 섬유 아세포는 세포 관련 나노 센서의 대부분이 핵 지역에 위치하지 않은 것으로 나타났다. 나노 센서의 위치는 FAM과 LysoTracker 레드의 공동 현지화가 공 촛점 이미지에 노란색의 픽셀에 의해 설명 될 것 LysoTracker 레드와 3T3 섬유 아 세포를 형질 전환 된 나노 센서를 배양에 의해 결정과 같은 엔도 솜 또는 리소좀 산성 구획 내에 표시되지 않습니다. 예컨대 투과 전자 현미경 (TEM) 및 내재화 경로위한 생물학적 마커의 식별에 의한 분석과 같은 추가 연구는 더욱이를 확인할 수 있었다. 이러한 시간 분해 공 초점 현미경으로서 또, 장기간의 연구자기보고 지지체에 배양 된 세포 내에서 나노 센서의 장기 거동을 결정할 수있다. 나노 센서는 다른 세포 유형에 전달 될 것 인 경우에 그들의 위치가 결과로 확인해야하는 것은 그 다음과 같이 동일하지 않을 수 있습니다.
자기보고 지지체의 사용은 비 침습적 조직 공학 구조물 내의 미세 환경 조건을 감시 할 가능성이있다. 시츄 측정에서 수행하는 기능을 갖는 것은 비 침습적으로 실시간으로 생체 차원 조직 구조의 성장을 최적화 할 수 있도록. 산도 응답 나노 센서의 세포질 위치는 전진 실험 중에 피를 모니터링하는 데에 이용 될 수있다. 세포 또는자가보고 지지체의 내부 환경에 전달 나노 센서는 정적 또는 동적 조직 배양 시스템 내에서 사용될 수있는 조직 구조 설계의 최적 성장을 위해 필요한 배양 조건 판정을 초래할 수체외. 추가 개발은 궁극적으로 조직 구조의 문화에 대한 높은 재현성 방법을 제공, 구조 전체에 영양분과 산소의 일관된 공급을 보장하는 영양 고갈에 따라 행동에 온라인 시스템으로 이어질 수 있습니다.
설명 프로토콜은 깊은 구조 내에서 영상을 허용해야 할 수 있습니다 큰 3D를 사용하려면, 그러나 공 초점 현미경을 사용하여 영상은 다 광자 여기를 이미지 할 생성 수있는 적합한 치수의 발판을 준비했습니다. 그러한 현미경 렌즈로 사용 광학 기기는 렌즈와 구조 치수에 대한 최적의 작동 거리를 결정하기 위하여 선택되어야한다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
BBSRC에서 자금 조달이 친절하게 인정 (허가 번호 BB H011293 / 1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Fisher | 32221 | |
| Anhydrous dimethylformamide (DMF) | Sigma | 270547 | |
| Ammonium hydroxide 50% (v/v) aqueous solution | Alfa Aesar | 35574 | diluted to 30% (v/v) with pure water |
| TEOS | Sigma | 13190-3 | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma | A3648 | |
| 5-(and-6)-carboxyfluorescein, succinimidyl ester (FAM-SE) | Invitrogen | C1311 | |
| 6-carboxytetramethylrhodamine, succinimidyl ester (TAMRA-SE) | Invitrogen | C1171 | |
| Sodium phosphate monobasic (0.2 M) | Sigma Aldrich | S-9638 | |
| Sodium phosphate dibasic (0.2 M) | Sigma Aldrich | S-0876 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | S8045 | |
| Trypsin/EDTA | Sigma Aldrich | T4174 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6046 | |
| FBS | Source Bioscience | Batch-213-101992 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Optimem | Invitrogen | 11058-021 | |
| LysoTracker Red | Invitrogen | L-7528 | |
| Draq5 | Biostatus Ltd | DR50050 | |
| Nitrogen gas | BOC | ||
| DCM | Sigma Aldrich | 320269 | |
| TFA | Sigma Aldrich | T6508 | |
| Confocal microscope | Leica TCS-SP | equipped with argon and krypton lasers and a 63X 0.9NA water immersion lens | |
| UV light | UVLS28 UVP, USA | ||
| Stirrer plate | SB161-3 Jencons-PLS | ||
| pH meter | Jenway model 3510 | ||
| Rotary Evaporator | Buchi Rotary Evaporator R200 | ||
| Centrifuge (nanosensors) | Hermle Z300 | ||
| Centrifuge (cell culture) | Thermo Scientific Heraeus Biofuge Primo | ||
| Vortex | Whirlimixer Fisherbrand | ||
| Ultrasonicator | FB11021 Fisherbrand | ||
| Aluminum sheet | Nottingham University | ||
| 35mm cell culture plate | Iwaki | 3000035 | |
| 10 ml syringe | Becton Dickenson | ||
| 3T3 Fibroblast cells | European Collection of Cell Cultures | ||
| PLGA | Lakeshore Biomaterials | 7525 DLG 7E | |
| Pyridinium formate | Sigma Aldrich | P8535 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S5136 | |
| HCl | Sigma Aldrich | 320331 |
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