Summary
De amphipod Parhyale hawaiensis is een veelbelovend model organisme voor studies van schaaldieren embryologie en vergelijkende geleedpotigen ontwikkeling en evolutie. Dit protocol beschrijft een methode voor het handmatig verwijderen van enkele blastomeren van vroeg decollete stadium embryo's van Parhyale.
Abstract
De amphipod Parhyale hawaiensis is een klein schaaldier gevonden in intertidale mariene habitats wereldwijd. In het afgelopen decennium, heeft Parhyale ontpopt als een veelbelovende modelorganisme voor laboratoriumonderzoek van ontwikkeling, een nuttig outgroup vergelijking met de goed bestudeerd geleedpotige modelorganisme Drosophila melanogaster. In tegenstelling tot de syncytieel splitsingen van Drosophila, de vroege breuklijnen van Parhyale zijn holoblastic. Lot in kaart brengen met behulp van tracer kleurstof ingespoten in de vroege blastomeres hebben aangetoond dat alle drie de kiem lagen en de kiembaan worden vastgesteld door de acht-cellig stadium. In dit stadium zijn drie blastomeren gedoemd aanleiding geeft tot het ectoderm, drie gedoemd aanleiding geeft tot het mesoderm, en de resterende twee blastomeren zijn de voorlopers van het endoderm en kiemlijn respectievelijk. Echter, blastomere ablatie experimenten aangetoond dat Parhyale embryo belangrijke regulerende capabiliti bezitten ookes, zodanig dat het lot van blastomeren geablateerd bij de acht-cellig stadium kan worden overgenomen door de nakomelingen van enkele van de resterende blastomeren. Blastomeer ablatie is eerder beschreven door een van twee methoden: injectie en daaropvolgende activatie van fototoxische kleurstoffen of handmatige ablatie. Echter, fotoablatie doodt blastomeren, maar niet de dode cel lichaam te verwijderen van het embryo. Volledige fysische verwijdering van specifieke blastomeren kan daarom een voorkeurswerkwijze ablatie voor sommige toepassingen. Hier presenteren we een protocol voor handmatig verwijderen van enkele blastomeren van de acht-cellig stadium van embryo Parhyale illustreren de instrumenten en handmatige procedures voor volledige verwijdering van het cellichaam terwijl de resterende blastomeren levend en intact. Dit protocol kan worden toegepast op elk Parhyale cel acht-cellig stadium, of blastomeren andere vroege stadia splitsing. Bovendien, in beginsel dit protocol voor vroege reini kanvage stadium embryo's van andere holoblastically klieven ongewervelde zeedieren.
Introduction
De amphipod schaaldier Parhyale hawaiensis heeft in het afgelopen decennium ontpopt als een veelbelovende modelorganisme met een groot potentieel voor gebruik in de evolutionaire ontwikkelingsbiologie onderzoek 1. Onder de geleedpotigen, meest modelsystemen insecten en de meest uitgebreid bestudeerde van deze is de fruitvlieg Drosophila melanogaster. D. melanogaster is een lid van de insectenorde Diptera, en als zodanig laat verschillende embryologische functies die zijn afgeleid met betrekking tot die van basaal vertakking insecten 2. Bovendien zijn insecten genest binnen de subphylum Pancrustacea 3, betekent dat insecten hun naaste verwanten in de "natuurlijke" group langdurige genoemd pancrustaceans en dat deze groep paraphyletic. Dit suggereert dat naast basaal vertakking insecten modellen, zijn studies van andere schaaldieren vereist om een breder zicht op de evolutionaire geschiedenis van de ontwikkelingskarakteristieken krijgen eennd moleculaire mechanismen die zijn zo goed bestudeerd in D. melanogaster. Maar heel weinig schaaldieren zijn goed ingeburgerd voor experimentele laboratoriumanalyse van ontwikkeling. De amphipod P. hawaiensis is een zeer handelbaar laboratoriummodel systeem vatbaar voor een aantal experimentele technieken. Amphipoden weer vele unieke eigenschappen binnen hun ouder superorder Peracarida (strand hoppers, Scuds, en goed garnalen), en worden daarom gedacht dat relatief afgeleid worden binnen deze groep van kreeftachtigen. Toch is de relatieve gemak van embryologische en functionele genetische manipulatie aangeboden door Parhyale maken dit amphipod een waardevolle aanvulling op de huidige inventaris van modelorganismen.
Als een proefdier, P. hawaiensis biedt vele voordelen. Dieren zijn tolerant voor een breed scala aan temperaturen en zoutgehaltes, en te overleven goed in de grote culturen van kunstmatig zeewater 1. Het is gemakkelijk om tuss onderscheidenEEN mannen en vrouwen op basis van duidelijke morfologische verschillen, met name, de grote, verslaafd, voorste romp appendages die mannetjes gebruiken om de vrouwtjes te grijpen tijdens de paring. Voor embryologische en ontwikkelingswerk, P. hawaiensis heeft een aantal zeer aantrekkelijke eigenschappen. Embryogenese duurt ongeveer 10 dagen en de tijd om geslachtsrijp is ongeveer zes weken bij 28 º C (maar let op dat Parhyale overleeft goed bij temperaturen van ongeveer 20-30 º C, en dat nadere ontwikkelingsstoornissen enscenering informatie is beschikbaar voor embryo verhoogd bij 18 º C 4 , 25 º C 4, en 26 º C 5,6). Volwassenen paren het hele jaar door in het laboratorium, zodat de embryo's zijn beschikbaar op elk moment van het jaar. Vrouwtjes 2-20 (afhankelijk van de leeftijd van de vrouw) bevruchte eieren in een ventrale broedbuidel gelegen tussen de eerste verscheidene paren benen (Figuren 1A en 1B), en het is mogelijk deze embryo verzamelens zeer vroeg in de ontwikkeling zonder het doden van de vrouw of beschadiging van de embryo's (figuur 1C). De embryo's overleven in gefilterd kunstmatig zeewater tot aan het uitkomen, voor daaropvolgende genexpressie of histologische analyse 7 kan worden vastgesteld, en een gedetailleerde stagingtabel maakt nauwkeurige identificatie van de vooruitgang door ontwikkeling 5. Robuuste protocollen zijn gebruikt om genexpressie analyse uit te voeren door in situ hybridisatie 8-15 of immunokleuring 4,16,17, functionele knockdown door RNA interferentie 13,15 of morfolino 12 en stabiele kiemlijn transgenese 18. De transgenese systeem, induceerbare expressie 14 en enhancer trap 19 werkwijzen kunnen ook worden gebruikt om genfunctie in P. onderzoeken hawaiensis. Terwijl een openbaar genoomopeenvolging is momenteel niet beschikbaar, een transcriptome met transcripten geproduceerd tijdens oögenese en embryogenese heeft been de novo geassembleerd en geannoteerd 20, en gedeponeerd in een doorzoekbare database 21, faciliteren genontdekking. Kortom, blz. hawaiensis is een zeer soepel model organisme geschikt voor meerdere experimentele en genetische benaderingen voor het begrip ontwikkeling.
In tegenstelling tot de eerste syncytieel splitsingen D. melanogaster, P. hawaiensis embryo's kleven holoblastically na de bevruchting (Figuur 2A). Lineage tracing analyse heeft aangetoond dat door het derde splitsing, elk van de derde splitsing blastomeren is speciaal voorbestemd aanleiding geeft tot een van de drie kiemlagen of germinale 6 (figuur 2B). Deze gegevens, samen met de microarray data 22, cellijn analyseert 6,23 en blastomere isolatie experimenten 4 hebben gesuggereerd dat ontwikkelings mogelijkheden zijn gescheiden op zijn minst enige derde splitsing blastomeres door asymmetrische erfenis van cell lot determinanten. Dienovereenkomstig, in blastomeer ablatie experimenten waarin de kiembaan precursor (aangeduid met "g" in de Parhyale cellijn nomenclatuur 6) werd onder de acht cel stadium embryo ontbrak kiemcellen in latere ontwikkelingsstadia 4, zoals aangegeven door de afwezigheid van cellen uiting van de eiwit Vasa, dat is een kiem lijn marker in de meeste metazoa 24. Daarentegen somatische blastomeer ablatie experimenten toonden aan dat P. hawaiensis embryo's bezitten ook belangrijke regulerende functies, zodanig dat het lot van mesoderm of ectoderm voorloper blastomeren weggenomen bij de acht-cel stadium kunnen worden overgenomen door de afstammelingen van enkele van de resterende blastomeren 25. Hoe regulatieve lot van de cel vervanging kan optreden, en de mate van autonome cellot goedkeuring door somatische blastomeren, blijft onbekend. Experimentele embryologische technieken zoals blastomere ablatie kan nuttig zijn in Understanding van de relatieve autonomie en nonautonomy cel beslissingen over het lot 26,27 en zijn daarom van belang bij de studie van P. hawaiensis embryogenese.
In de experimenten die regulatieve vervanging van ectodermale en mesodermaal geslachten aangetoond, werd blastomere ablatie uitgevoerd door injectie 28 en daaropvolgende excitatie van fototoxische kleurstoffen 25. Hoewel deze techniek is effectief bij het doden van de geïnjecteerde blastomeer (pen) niet volledig dode cellichaam uit het embryo. Bovendien zijn verschillen waargenomen tussen cellijn gegevens die tot gastrulatie stadia van embryogenese door injectie blastomeren met fluorescerende tracers lijn 28,29 en gegevens verzameld door volgende onverstoord blastomeren door de ontwikkeling van dezelfde embryonale stadia 23. Volledige fysische verwijdering van specifieke blastomeren kan daarom een voorkeurswerkwijze ablatie voor sommige toepassingen.
We hebben eerder de resultaten van cellijn gepubliceerde analyses van embryo's waarin de afzonderlijke cellen handmatig werden weggenomen 23. Echter, de delicate handelingen die nodig zijn om enkele blastomeren van vroeg decollete stadium verwijderen van embryo's nog niet volledig beschreven. Hier presenteren we een protocol voor de verzameling van P. hawaiensis embryo's en handmatige ablatie van een blastomeer uit een acht-cellig stadium embryo. Het doel van deze methode is om volledige verwijdering van het cellichaam van het embryo bereiken, waardoor waarneming van de cellulaire gedrag en cellot bevoegdheden van de resterende cellen gedurende embryogenese en post-embryonale ontwikkeling. Het protocol duidelijk verwijdering van de kiembaan precursor g (figuur 2C), maar kan worden toegepast op een cel acht-cellig stadium, of blastomeren van eerdere klieving fasen. In principe zou dit protocol worden toegepast op enkele cellen van de vroege splitsing stadium embryo's van Othe verwijderenr holoblastically klieven ongewervelde zeedieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Reacties die nuttig kan zijn in het uitvoeren van bepaalde stappen zijn cursief weergegeven.
1. Dag 1: Voorbereiding van Materialen
- Bereid de volgende materialen (zie tabel van materialen en apparatuur):
- 15 cm en 22 cm pasteurpipetten
- Diamond schrijver
- gefiltreerd kunstmatig zeewater (zoutgehalte tussen ,0018-,0020) bevattende 1 mg / ml amfotericine B (1:100 van 100 mg / ml voorraadoplossing), 100 eenheden / ml penicilline en 100 mg / ml streptomycine (01:50 van een voorraadoplossing met 5.000 eenheden / ml penicilline en 5.000 mg / ml streptomycine)
- gefilterd kunstmatig zeewater (zoutgehalte tussen ,0018-0,0020) zonder toevoegingen
- een grote plastic container voor huisvesting stellen (ten minste 15 cm x 15 cm x 5 cm)
- klein (3 cm of 5 cm) Petrischaaltjes gevoerd met Sylgard
- klein (3 cm of 5 cm) petrischaaltjes
- een horlogeglas of glas multi-well plaat
- pincet (we gebruiken stompe tang afgeleid weerm oude Dumont # 5 tang die per ongeluk zijn beschadigd in andere laboratoriumprocedures die wij hergebruikt met een tang slijpsteen zodat de uiteinden van de forceps zijn glad, dat beide tanden dezelfde lengte, en dat zij niet langer scherpe punten. Uiterst fijne tang, zoals nieuwe Dumont # 5 tang, zijn ongewenst omdat ze embryo's en / of vrouwtjes kunnen verwonden.)
- een Pasteur pipet met het einde verbreed (zie stap 1.2 hieronder)
- embryo herwinningshulpmiddel bestaande uit een dunne, gebogen wolfraam draad ingebed in het dunne uiteinde van een Pasteur pipet (kan worden vervangen door een alternatieve uitvoering, zie 1.3)
- mondpipet met een kleine opening (zie stap 1.4 hieronder)
- een glazen naald gemaakt van een getrokken glas capillair (zie stap 1.5)
- Om de verbrede Pasteur pipet, eerste score op ongeveer 15 cm Pasteur pipet op het punt waar de pipet begint te verkleinen met een diamant schrijver, wikkel de scoorde regio van de pipet in een Kimwipe of keukenpapier om de vingers te beschermen, en vervolgens zorgvuldig maken afbreken van de tip aan de breuklijn. Houd het gebroken uiteinde van de pipet op een bunsenbrander vlam enkele seconden ingedrukt om de randen glad. De opening moet iets smaller dan de maximale breedte van de pipet.
- Om de wolfraam draad dissectie-instrument te maken, plaatst u een wolfraam draad in het einde van een 15 cm glas Pasteur pipet, kort ingedrukt boven een bunsenbrander vlam om het glas te smelten, de vaststelling van de draad op zijn plaats. Gebruik een tang om voorzichtig curve het einde van de draad in een haakvorm. Zie figuur 3 een voorbeeld van een geschikte vorm voor dit instrument.
- Om een kleine opening voor de mond pipet te maken, trekt u het dunne uiteinde van een 22 cm Pasteur pipet in twee delen over een vlam, en breek de punt van het smalle uiteinde. Plaats in het uiteinde van de mondpipet houder.
- Maak de glazen naald die wordt gebruikt om de blastomeren plaats prikken tijdens de ablatie procedure met een naald trekker. Een geschikt gevormde naald is getoond in figuur 4. Deze naald werd getrokken op een Sutter P97 naald trekker met behulp van een programma met parameters 2x (warmte = 566, trek = 100, snelheid = 20 tijd = 250) + 1X (warmte = 566, trek = 100, snelheid = 100, tijd = 250). Het specifieke programma en instrument gebruikt om de naald te maken kan variëren, maar de naald moet een fijne punt hebben, maar ook stevig genoeg om niet te breken wanneer geduwd tegen het chorion van het embryo.
2. Dag 1: Verzamelen Parhyale Koppelen stellen
- Gebruik de verbrede Pasteur pipet (stap 1.2) te verzamelen paring P. hawaiensis paren uit de grote cultuur container, en overbrengen naar een aparte container met cleunen kunstmatig zeewater. Het is niet noodzakelijk dat zeewater worden gefilterd. Het beste is om paring paren in de late namiddag verzamelen en laat de paren bij kamertemperatuur (20-23 ° C) gedurende de nacht, zodat de volgende ochtend meeste embryo's zijn onlangs bevrucht en gedeponeerd en dus vroeg in splitsing stadia voor ablatie. Verzamel minstens 20 paren paren om te zorgen dat sommige vrouwtjes gaat uitvoeren vroeg decollete stadium embryo's door de volgende ochtend.
3. Dag 2: Gathering Parhyale Embryo
- De volgende ochtend, bezielen gefilterd kunstmatig zeewater (FASW) met CO 2. Een deel van de vrouwtjes tijdens de nacht vrij gezwommen uit hun mannetjes; innen deze gescheiden vrouwen en verdoven ze in FASW / CO 2. De resterende ongepaarde mannetjes van de parende container verwijderd en aan de grote cultuur. Resterende paring paren kunnen later worden opgeslagen voor het embryoop de dag of de volgende dag.
- Transfer een enkele verdoofde vrouwelijke dragende embryo's om een horloge glas in FASW / CO 2. Alle gescheiden vrouwen zal waarschijnlijk hebben neergelegd eieren, die zichtbaar zal zijn op het oog als bleke roze of paarse bolvormige deeltjes door de transparante coxale platen van de vrouwen (figuur 1A). Om te bepalen of de embryo's in een vroeg stadium decollete en dus geschikt voor blastomeer ablatie, zal de onderzoeker moeten de embryo's uit de broedbuidel verwijderen en onderzoeken ze onder een microscoop.
- Het bekijken van de procedure van een dissectie microscoop, pakt de coxale platen langs een kant van het lichaam met een tang. Embryo's zullen zichtbaar zijn in het ventrale broedbuidel tussen deze coxale platen (Figuur 1B).
- Plaats de dunne, gebogen draad gereedschap (figuur 3; stap 1.3) in het achterste einde van de broedbuidel, en til de draad in de richting van het voorste einde van de broedbuidel om het broed te scheidenzakje bekledingen (deze worden gewijzigd ventrale appendages genoemd oostegites 30), het openen van het zakje en de embryo's losmaken. Embryo's die binnen het eerste uur of zo worden gelegd allemaal ingesloten in een zeer dunne, transparante membraan dat gemakkelijk kan worden verstoord door de draad gereedschap, dit membraan verdwijnt ongeveer 2-3 uur na leg, en embryo's niet gebonden aan elkaar of aan de vrouwelijke op enigerlei wijze vanaf dit punt de hele embryogenese. Als onderzoekers vinden het lastig of moeilijk te manoeuvreren de gebogen draad gereedschap embryo's uit het broed zakje te verwijderen, een alternatief werktuig kan worden gebruikt, zolang de bewegingen zijn zacht en geen agressieve druk wordt aangebracht op de embryo's of het broed zakje. Andere hulpmiddelen zijn geschikt voor het verwijderen van embryo's uit de broedbuidel omvatten stomp pincet of een glazen capillair met een afgesloten en gladgestreken einde.
- Gebruik een ongewijzigd 15 cm Pasteur pipet om het water te spoelen door de geopende broedbuidel, duwen thij embryo's, die moet naar de bodem van het horlogeglas. Breng de vrouwelijke schoon FASW (zonder CO 2) om het herstel gewacht voordat herinvoering van haar naar de belangrijkste cultuur. Meerdere vrouwen kan worden geplaatst in dezelfde herstel gerecht, maar laat vrouwen om volledig te herstellen alvorens terug te keren ze naar het station cultuur, omdat ze door andere dieren kan worden gegeten als ze nog gedeeltelijk verdoofd.
- Gebruik een ongewijzigd 15 cm Pasteur pipet om de embryo's over te dragen aan een petrischaal met schone FASW en bekijken onder de microscoop om hun embryonale stadium te bepalen. Afzonderlijke embryo die op de derde splitsing (fase 4 5), die geschikt zijn voor deze procedure. Het moet ook mogelijk zijn om dit protocol van toepassing op elke splitsing fase voorafgaand aan kiem disc vorming (stadia 7-08 mei).
4. Dag 2: ablatie enkele cellen
- Vul Sylgard gevoerde petrischaal met een ondiepe laag van FASW. Gebruik een ongewijzigd 15 cm Pasteur piPette een single embryo transfer naar de plaat.
- Met stompe tang voorzichtig rol de embryo de cel te geablateerd (figuren 2A en 2B) te identificeren. De kiem lijn voorloper g kunnen worden geïdentificeerd als de kleinste micromere, die zit op de top van de kleinste macromere Mav. Bovendien wordt g niet rechtstreeks contact opnemen met de cel en, dat is de micromere direct tegenover het, zoals de mesoderm voorloper micromeres ml en mr delen een cel grens in het midden van het embryo. Mr is de blastomere rechts van g en ml is micromere links van g. De zuster macromeren van mr, ml, en en zijn de ectoderm voorlopers Er, El, en Ep respectievelijk.
- Met tang in de LEFt de hand als de onderzoeker rechtshandig is (of in de rechterhand als de onderzoeker is linkshandig), oriënteren het embryo met de cel van belang om de juiste (of naar links als de onderzoeker is linkshandig), en zachtjes begrijpen het embryo tussen de tang om het te stabiliseren.
- Met behulp van een getrokken glazen naald (stap 1.5 hierboven; Figuur 4), voorzichtig doorboren de cel van belang. Steek de naald te ver, om niet om de naald te duwen in de cellen naburige of onder de cel van belang. De naald hoeft alleen het chorion en onderliggende celmembraan doorboren, en hoeft niet te diep tot in de cel te worden geablateerd.
- Wisselen de naald gebruikt om het embryo voor de glas-einde van een mond pipet met een fijne prikken trok Pasteur pipet (stap 1.4). Houd de punt van de pipet dicht bij het gat gemaakt in de cel van belang en toepassing zeer zachte zuigkracht.
- Zeer knijp het embryo met de tang. Als de inhoud van de blastolouter wordt uit het chorion geduwd door het gat gemaakt in stap 4.4, zuig het in de mond pipet om een vrij uitzicht op het embryo mogelijk te maken. Als het gat groot genoeg is, kan de kern van de cel doorboord worden gezien ook ontstaan. Dit is een goede controle om ervoor te zorgen dat de gehele inhoud van de cel zijn verwijderd en kan niet worden geregenereerd.
- Neem zorgvuldig het embryo als de blastomere van belang wordt verwijderd. De rand van de lekke cel wijken naar het gat in de chorion, waardoor de snijpunten van de onderliggende cellen zichtbaar. Blijven toepassen druk totdat alle blastomere van belang is verwijderd. Gebruik een tang om het embryo te rollen van links naar rechts en visueel bevestigen dat alle blastomere belangstelling verdwenen is.
- Met ongewijzigde 15 cm Pasteur pipet het embryo te reinigen FASW + (FASW + 1 mg / ml amfotericine B, 100 eenheden / ml penicilline en 100 mg / ml streptomycine).
- Hef-blastomere ablatie embryo's in afzonderlijke putjeseen schone 48 putjes plaat in FASW +, verandert 50% van antibiotica aangevuld FASW + per dag. In onze handen te overleven en ontwikkelen goed, zelfs na ablatie, bij een bereik van temperaturen 18-28 º C. embryo Onderzoekers moeten de embryo verhogen bij een temperatuur waarvoor zij een schoon (maar niet noodzakelijk aseptisch) oppervlak waarop de embryo's met minimale verstoring verhogen. Om te kunnen vergelijken met de timing van ontwikkelingsgebeurtenissen in-blastomere ablatie embryo's met controles, verwijzen we naar de gedetailleerde ontwikkeling enscenering informatie die beschikbaar is voor embryo verhoogd bij 18 º C 4, 25 º C 4 is, en 26 º C 5,6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na succesvolle ablatie van enkele derde splitsing P. hawaiensis micromeres zoals beschreven in dit protocol, geleidelijk de resterende micromeres verschuiven hun positie lichtjes zodat de ruimte vroeger bezet door de geablateerde blastomere gedeeltelijk bezetten. Bijvoorbeeld, wanneer g wordt verwijderd, de naburige blastomeren mr en ml enigszins verschuiven en kom naar de laterale randen van cellen die vroeger in direct contact met g (vergelijk figuur 2A en 2C) waren delen. Na succesvolle ablatie, kan de resterende blastomeren een lichte vertraging (van minder dan een uur) weer te geven alvorens vierde decollete, maar ze moeten dan weer dezelfde splitsing patronen en timing die zij zouden hebben getoond in gemanipuleerde embryo's ten minste tot gastrulation stadia 23 . Na ablatie van een van de vier micromeres, afstammelingen van de resterende blastovennen mogen verder normale splitsing timing en cellulaire gedrag, waaronder vorming van een karakteristieke cellulaire regeling zogenaamde "rozet" en de opening van gastrulatie bewegingen 23. Het aandeel van de embryo's die de ablatie procedure en volledige embryogenese overleven door te broedproces kunnen aanvankelijk in de orde van ongeveer 10% voor een onderzoeker nieuw voor de techniek, maar met ervaring moet gemiddeld ongeveer 50%, en kan oplopen tot 75% met de praktijk en waakzaam verzorging van embryo na blastomeer ablatie. Tabel 1 toont voorbeelden van aantallen embryo geablateerd overlevingskansen van een reeks opeenvolgende ablatie experimenten uitgevoerd door dezelfde onderzoeker, waaruit blijkt dat de overlevingskans algemeen ten minste 80% van de eerste dagen na ablatie, en dat de overlevingskans tot stijging uitkomen met toenemende ervaring van de onderzoeker.
Onvolledige blastomere verwijdering zou zijnblijkt uit het zien van restanten van de blastomere die hadden moeten worden weggenomen, die membraan componenten, cytoplasma, of dooier korrels, nog steeds gelegen in het chorion van het embryo kunnen zijn. Een vertraging in vierde splitsing van meer dan twee uur, of onregelmatige splitsingspatronen of cellulaire gedrag van afstammelingen van de resterende blastomeren, kan ook aangeven succesvol ablatie. Deze verschijnselen kunnen het gevolg zijn van beschadiging tijdens de ablatie procedure veroorzaakt voor andere blastomeren zijn. Als andere dan de beoogde voor ablatie weergave morfologische afwijkingen of desintegreren, dan weer beschadigen blastomeres heeft waarschijnlijk andere blastomeren zijn veroorzaakt tijdens de ablatie procedure.
Als lot van de cel markers zijn verkrijgbaar aan de nakomelingen van specifieke derde splitsing blastomeren wier lot niet zijn onderworpen aan regulerende vervanging labelen, kan dan extra bevestiging van de succesvolle ablatie worden verkregen door middel van etikettering gemanipuleerde embryo's met die markers Follovleugel de ablatie. Markers van sommige mesodermale en ectodermale gebieden zijn beschreven in midden tot late stadia van embryogenese 8,14,15. Omdat beide kiembladen regulerende vervanging na het verlies van een van de blastomeren oprichter 25 kunnen ondergaan, deze markers kunnen niet eenduidig bepalen of blastomeer ablatie geslaagd. In het geval van de kiembaan voorloper g, al zijn nakomelingen worden gekenmerkt door de expressie van vasa transcript 12 en eiwit 4 hele embryogenese en embryo's waarin g is weggenomen gebrek kiemcellen minstens tot begin kiem band stadia 4. Succesvolle ablatie van g kan dus worden bevestigd door onderzoek vasa expressie na ablatie in latere stadia van de embryogenese (figuur 5).
th = "5in" fo: src = "/ files/ftp_upload/51073/51073fig1highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/51073/51073fig1.jpg" />
Figuur 1. Volwassen Parhyale hawaiensis vrouwelijke en embryo's. (A) Zijaanzicht van een volwassen vrouwtje P. hawaiensis, waaruit coxale platen (pijlen), thoracale aanhangsels (pijlpunten) en embryo's zichtbaar als roze of paarse bolvormige deeltjes door de transparante coxale platen (blauwe gestippelde lijnen). Anterior naar links. (B) Ventral weergave van een volwassen vrouwelijke P. hawaiensis waaruit embryo's zichtbaar in de broedbuidel (blauwe gestippelde lijnen). Anterior naar links. (C) Embryo's vrijgegeven van broedbuidel normaal ontwikkelen in FASW. Verschillende stadia variërend van S1 tot broedeieren zijn vertegenwoordigd, opgevoerd volgens Browne et al. 5 Schaal bar = 1 mm (A) en (B);. 500 um (C).51073/51073fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Acht cellig stadium embryo's van P. hawaiensis. (A) live acht-cellig stadium (fase S4 5) niet-gemanipuleerde embryo, bestaande uit vier micromeres (kleinere cellen) en vier macromeren (grotere cellen). (B) Schematische voorstelling van een acht-cellig stadium embryo blijkt mobiele lot benamingen van alle blastomeren in een wild-type embryo zoals geopenbaard door lineage tracing op basis van fluorescente markers 6. (C) Leef S4 stadium embryo dat de g blastomere verwijderd met behulp van het huidige protocol heeft gehad. De omcirkelde gebied toont het gebied vroeger bewoond door de g blastomere; deresterende micromeres zijn positie verschoven licht als gevolg van de ablatie van g. Schaal bar = 250 micrometer in (A) en (C). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Draad instrument dat wordt gebruikt voor het verwijderen van embryo's uit de broedbuidel. De hier getoonde instrument werd gemaakt door het invoegen van een wolfraam draad in het smalle uiteinde van een Pasteur pipet en zachtjes smelten van het glas om de draad af te dichten in de plaats, vervolgens met behulp van een tang om een flauwe bocht in te voeren in de draad. Andere hulpmiddelen zijn geschikt voor het verwijderen van embryo's uit de broedbuidel omvatten stomp pincet of een glazen capillair met een afgesloten en gladgestreken einde. Scale bar = 1 cm.
Figuur 4. Glazen naald gebruikt voor het doorprikken blastomeren tijdens de ablatie procedure. De hier getoonde naald werd getrokken op een Sutter P97 naald trekker met behulp van een programma met de parameters 2 x (warmte = 566, trek = 100, snelheid = 20 tijd = 250) + 1 x (warmte = 566, trek = 100, snelheid = 100, tijd = 250). Andere instrumenten of programma's kunnen worden gebruikt om naalden voor ablatie trekken, zolang zij van dezelfde algemene vorm als de hier getoonde. Schaal bar = 1 cm.
Figuur 5. Waarin de resultaten van blastomere eenblation tijdens de embryogenese. (A) Gonade gebied van een wild-type stadium S29 embryo kort voor het uitkomen, tonen geslachtscellen gelabeld door anti-Vasa immunokleuring (pijlpunten). De anti-Vasa antilichaam hier gebruikt specifiek is voor P. hawaiensis Vasa (Linsler, Alwes en Extavour, ongepubliceerde gegevens). (B) Gonade regio een podium S29 embryo dat de g blastomere verwijderd bij de acht-cel stadium had, toont afwezigheid van geslachtscellen zoals geopenbaard door de afwezigheid van specifieke anti-Vasa signaal in de gonaden regio (pijlpunten). Schaal bar in (A) = 100 micrometer en geldt ook voor (B). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Ablatie ronde | # Geablateerd | # (%) Overleeft50% ontwikkeling | # (%) Overleefde tot 90-100% ontwikkeling |
| 1 | 49 | 41 (83,7) | 6 (12,2) |
| 2 | 48 | 46 (95,8) | 17 (35.4) |
| 3 | 31 | 25 (80,6) | 22 (71,0) |
| 4 | 97 | 72 (74.2) | 56 (57,7) |
| 5 | 108 | 100 (92.6) | 65 (60,2) |
| 6 | 50 | 36 (72.0) | 37 (74,0) |
| TOTAAL | 383 | 320 (83,6) | 203 (53,0) |
Tabel 1. Vertegenwoordiger ablatie survivalstatistieken. Na micromere ablatie, werd de overleving zowel binnen de eerste 50% van de ontwikkelingskosten (5-6 dagen bij 25 º C) en vervolgens bij 90-100% ontwikkeling (10-12 dagen bij 25 º C) scoorde. Ablatie rondes 1-6 zijn representatieve voorbeelden van experimenten uitgevoerd door een onderzoeker (AR Nast) in chronologische volgorde in de loop van een periode van acht maanden. Onderzoekers moeten vinden dat, zoals hier getoond, overleving 90-100% ontwikkeling stijging met ervaring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We beschrijven een protocol voor handmatige ablatie en volledige fysieke verwijdering van enkele blastomeren van de vroege stadia van de splitsing amphipod P. hawaiensis. We demonstreren het gebruik van dit protocol door het verwijderen van de enkele kiembaan voorloper cel g van een acht-cellig stadium embryo, en laten zien dat ablatie succesvol door te bevestigen ontbreken van g 's dochter cellen in latere embryogenese is geweest. Dit protocol kan worden gebruikt om elk van de micromeres van het embryo in een vroeg stadium splitsing te verwijderen. Om dit protocol om macromeren in dit stadium, of verwijder blastomeren in eerste of tweede splitsing fasen kunnen gebruikers eenvoudig de geringe modificaties van het creëren van een iets grotere gat in de chorion bij stap 4.4 en toepassen van druk en zuiging langer toepassen om het grotere volume van de celinhoud verwijderen bij stap 4.6. We hebben ontdekt dat na het gebruik van dit protocol, de ontwikkeling van de resterende blastomeren na ablatie is unaanzienlijk afwijken splitsing en mobiele bewegingspatronen tenminste tot het moment van gastrulatie 23.
Dit protocol kan nuttig zijn voor verder onderzoek naar de ontwikkelingsmogelijkheden van de vroege splitsing blastomeren in deze amphipod zijn. Veel vragen moeten nog worden beantwoord in dit gebied, waaronder waarom sommige cellen, maar niet anderen lot kan veranderen aan die van ablatie blastomeren te vervangen, en de precieze timing en de mechanismen van deze regulerende veranderingen. Het protocol kan worden aangepast om ablatie van meer dan een cel passen, door simpelweg herhalen van stappen 4,2-4,7 achtereenvolgens de blastomeren plaats.
Het is belangrijk om een hoge kwaliteit stereomicroscoop een passende verlichting gebruiken om de vroege splitsing blastomeren bekijken en correct te identificeren. We vinden dat laterale invallende witte licht van een koude lichtbron glasvezel is het meest geschikt voor dit doel. Invallend licht direct boven de preparaten gebruikennl creëert reflecties die de cellulaire morfologie en de grenzen zouden kunnen verbergen, terwijl doorgelaten licht niet aan de dichte dooier van de embryo's en blastomeren dringen zijn daarom moeilijk te onderscheiden. Het is zeer nuttig voor het horlogeglas of petrischaal met embryo's op een zwarte ondergrond in plaats van een witte of transparante glazen oppervlak worden geplaatst, aangezien dit het beste contrast voor de bleke embryo's.
Een beperking van dit protocol is dat de blastomere van belang correct en ondubbelzinnig moet worden aangeduid voor het begin van de procedure. Fotoablatie technieken zou nuttiger zijn voor onderzoekers nieuw voor het systeem, omdat de embryo's kunnen worden overgelaten aan het ontwikkelen voor een paar decollete cycli na injectie van de fluorescente kleurstof 28, en de identiteit van de geïnjecteerde blastomere bevestigde na de injectie, maar voordat fotoablatie, door analyse van de patronen van de cellulaire nakomelingen, die goed zijn beschreven in eerdere cellijnleeftijd analyseert 6,23. Zodra onderzoekers zijn bekend met de P. hawaiensis embryo en alle blastomeren identificeren met vertrouwen kan de ablatie handleiding beschreven worden gebruikt voor toepassingen waarbij volledige fysische verwijdering van een blastomeer, dan het doden van de cel zonder de dode cellichaam van het embryo, wenselijk.
Deze procedure kan in principe worden toegepast op enkele blastomeren uit decollete stadium embryo's van andere holoblastically klieven schaaldieren of andere zee-of zoetwater ongewervelde waarvan chorions of bevruchting membranen kunnen niet gemakkelijk worden verwijderd te verwijderen. Modificaties kunnen onder andere met behulp van incubatie media met de juiste zoutgehalte kenmerken, en het wijzigen van de vorm van de naald om meer delicate membranen (langere, dunnere naalden) of meer robuuste embryonale bekledingen (korter, sneller afbouwen naalden) tegemoet te komen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Rayhan Arif en Hassaan Shahawy voor camerawerk, Tripti Gupta en Frederike Alwes voor hulp verfijnen van de cel ablatie techniek en Extavour lab leden om feedback over de data, video en manuscript. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het Harvard Stem Cell Institute (Seed Grant nummer SG-0057-10-00) de Ellison Medical Foundation (New Scholar Award aantal AG-NS-07010-10) aan CGE, en de Universiteit van Harvard Research Program awards uit aan ARN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 cm Pasteur pipette | Wheaton | 53499-630 VWR | For transferring intact and blastomere-ablated embryos from dish to dish. |
| 22 cm Pasteur pipette | Wheaton | 53499-632 VWR | For making mouth pipette tips. |
| 3 cm Petri dishes | Thermo Scientific | 25382-334 VWR | Use some unaltered to collect and store embryos; coat some with a layer of Sylgard (see below) to create a working surface for blastomere ablations. |
| 48-well Plates | Greiner Bio-One | 82051-004 VWR | For culturing embryos following ablation. |
| Bottle top filters 0.2 µm | Nalge Nunc International | 28199-296 VWR | For creating FASW (See below). |
| Bunsen burner | VWR | 89038-530 VWR | For creating tungsten wire tool and fine tip of mouth pipette. |
| Diamond scribe | Musco Sports Lighting | 52865-005 VWR | For creating wide-mouthed Pasteur pipettes for collecting couples. |
| Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 Fine Science Tools | For holding anaesthetized females during removal of embryos from brood pouch. These do not have to be fine-tipped Dumont forceps - the tips can be at least as blunt as those of the forceps for which the catalogue number is listed here. |
| Fungizone-Amphotericin B | Sigma | A2942 Sigma Aldrich | Add to FASW to a final concentration of 1 mg/ml, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. |
| Glass capillaries 4 in long, 1/0.58 OD/ID (mm) | World Precision Instruments | 1B100-4 World Precision Instruments | For making needles for puncturing the blastomere to be ablated. |
| Glass watchglass 300 mm diameter | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 Electron Microscopy Sciences | For use in removing embryos from the brood pouch of anesthetized females. |
| Instant Ocean Artificial Sea Water (ASW) | Instant Ocean | IS160 Aquatic EcoSystems | Make ASW by dissolving salt in deionized water to a salinity of 1.022-1.024. |
| Instant Ocean Filtered Artificial Sea Water (FASW) | Instant Ocean | IS160 Aquatic EcoSystems | Use 0.2 µm filters to sterilize ASW. Make up in small amounts (< 250 ml) as needed. |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 21905-026 VWR | For safely breaking off the fine end of Pasteur pipettes modified for collecting couples. |
| Mouth pipette adaptor | Drummond Labware | A5177-5EA Sigma Aldrich | Insert the fine pulled Pasteur pipette tip into this end, to be used for removing extruded cell contents during the ablation procedure. |
| Mouth pipette tubing | Aldrich | Z280356 Sigma Aldrich | Cut this to be long enough to comfortably hang around your neck during the ablation procedure. |
| Needle Puller | Sutter Instrument Company | P97 Sutter Instrument Company | For making needles from glass capillaries for puncturing the blastomere to be ablated. |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Mediatech | 45000-650 VWR | Add to FASW to a final concentration of 100 units/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. |
| Rubber bulb | Electron Microscopy Sciences | 100488-418 VWR | For using Pasteur pipettes to transfer embryos from dish to dish. |
| Sylgard 184 | K. R. Anderson, Inc. | NC9659604 Fisher Scientific | Make up according to manufacturer's instructions. Pour a layer 2-5 mm thick into a 3cm petri dish to create a working surface for blastomere ablations. |
| Tungsten wire 0.004 inches diameter | A-M Systems | 719000 A-M Systems | Use this to make a tool for removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. |
References
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H.
- Sander, K. Pattern formation in insect embryogenesis: the evolution of concepts and mechanisms. Int. J.Insect Morphol. Embryol. 25, 349-367 (1997).
- Regier, J. C., et al. Arthropod relationships revealed by phylogenomic analysis of nuclear protein-coding sequences. Nature. 463, 1079-1083 (2010).
- Extavour, C. G. The fate of isolated blastomeres with respect to germ cell formation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis. Dev. Biol. 277, 387-402 (2005).
- Browne, W. E., Price, A. L., Gerberding, M., Patel, N. H. Stages of embryonic development in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis. Genesis. 42, 124-149 (2005).
- Gerberding, M., Browne, W. E., Patel, N. H. Cell lineage analysis of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis reveals an early restriction of cell fates. Development. 129, 5789-5801 (2002).
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. Fixation and dissection of Parhyale hawaiensis embryos. Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).
- Price, A. L., Patel, N. H. Investigating divergent mechanisms of mesoderm development in arthropods: the expression of Ph-twist and Ph-mef2 in Parhyale hawaiensis. J. Exp. B. Dev. Evol. 310, 24-40 (2008).
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. In situ hybridization of labeled RNA probes to fixed Parhyale hawaiensis embryos. Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).
- Browne, W. W., Schmid, B. G. M., Wimmer, E. A., Martindale, M. Q. Expression of otd orthologs in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis. Dev. Genes Evol. 216, 581-595 (2006).
- Prpic, N. M., Telford, M. J. Expression of homothorax and extradenticle mRNA in the legs of the crustacean Parhyale hawaiensis: evidence for a reversal of gene expression regulation in the pancrustacean lineage. Dev. Genes Evol. 218, 333-339 (2008).
- Kizil, G., Havemann, J., Gerberding, M. Germ cells in the crustacean Parhyale hawaiensis depend on Vasa protein for their maintenance but not for their formation. Dev. Biol. 327, 320-239 (2009).
- Liubicich, D. M., et al. Knockdown of Parhyale Ultrabithorax recapitulates evolutionary changes in crustacean appendage morphology. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13892-13896 (2009).
- Pavlopoulos, A., et al. Probing the evolution of appendage specialization by Hox gene misexpression in an emerging model crustacean. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13897-13902 (2009).
- Vargas-Vila, M. A., Hannibal, R. L., Parchem, R. J., Liu, P. Z., Patel, N. H. A prominent requirement for single-minded and the ventral midline in patterning the dorsoventral axis of the crustacean Parhyale hawaiensis. Development. 137, 3469-3476 (2010).
- Simanton, W., et al. Conservation of arthropod midline netrin accumulation revealed with a cross-reactive antibody provides evidence for midline cell homology. Evol. Dev. 11, 260-268 (2009).
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. Antibody staining of Parhyale hawaiensis embryos. Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).
- Pavlopoulos, A., Averof, M. Establishing genetic transformation for comparative developmental studies in the crustacean Parhyale hawaiensis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 7888-7893 (2005).
- Kontarakis, Z., et al. A versatile strategy for gene trapping and trap conversion in emerging model organisms. Development. 138, 2625-2630 (2011).
- Zeng, V., et al. De novo assembly and characterization of a maternal and developmental transcriptome for the emerging model crustacean Parhyale hawaiensis. BMC Genom. 12, 581 (2011).
- Zeng, V., Extavour, C. G. ASGARD: an open-access database of annotated transcriptomes for emerging model arthropod species. Database. , (2012).
- Nestorov, P., Battke, F., Levesque, M. P., Gerberding, M. The Maternal Transcriptome of the Crustacean Parhyale hawaiensis Is Inherited Asymmetrically to Invariant Cell Lineages of the Ectoderm and Mesoderm. PLoS ONE. 8, (2013).
- Alwes, F., Hinchen, B., Extavour, C. G. Patterns of cell lineage, movement, and migration from germ layer specification to gastrulation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis. Dev. Biol. 139, 110-123 (2011).
- Ewen-Campen, B., Schwager, E. E., Extavour, C. G. The molecular machinery of germ line specification. Mol. Reprod. Dev. 77, 3-18 (2010).
- Price, A. L., Modrell, M. S., Hannibal, R. L., Patel, N. H. Mesoderm and ectoderm lineages in the crustacean Parhyale hawaiensis display intra-germ layer compensation. Dev. Biol. 341, 256-266 (2010).
- Fraser, S. E., Harland, R. M. The molecular metamorphosis of experimental embryology. Cell. 100, 41-55 (2000).
- Olsson, L. A clash of traditions: the history of comparative and experimental embryology in Sweden as exemplified by the research of Gösta Jägersten and Sven Hörstadius. Theory Biosci. 126, 117-129 (2007).
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. Injection of Parhyale hawaiensis blastomeres with fluorescently labeled tracers. Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).
- Chaw, R., Patel, N. H. Independent migration of cell populations in the early gastrulation of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis. Dev. Biol. 371, 94-109 (2012).
- Schmitz, E. H. Crustacea Microscopic Anatomy of Invertebrates. Microscopic Anatomy of Invertebrates. Harrison, F. W. 9, Wiley-Liss, Inc.. 443-528 (1992).
