Summary
Il hawaiensis anfipode Parhyale è un organismo modello promettente per studi di embriologia crostacei e sviluppo artropodi comparativa e l'evoluzione. Questo protocollo descrive un metodo per la rimozione manuale dei singoli blastomeri da embrioni precoci stadio di clivaggio Parhyale.
Abstract
Il hawaiensis anfipode Parhyale è un piccolo crostaceo trovato in intercotidali habitat marini di tutto il mondo. Negli ultimi dieci anni, Parhyale è emerso come organismo modello promettente per studi di laboratorio di sviluppo, fornendo un confronto outgroup utile al ben studiato modello artropodi organismo Drosophila melanogaster. In contrasto con le fratture sinciziale di Drosophila, i primi divisioni di Parhyale sono holoblastic. Mappatura Fate utilizzando coloranti traccianti iniettati nel primi blastomeri hanno dimostrato che tutti e tre i foglietti embrionali e la linea germinale sono stabiliti dallo stadio di otto cellule. In questa fase, tre blastomeri predestinati per dare luogo alla ectoderma, tre sono destinata a dare origine al mesoderma, e gli altri due blastomeri sono rispettivamente i precursori della linea endoderma e germe. Tuttavia, gli esperimenti di ablazione blastomeri hanno dimostrato che gli embrioni Parhyale possiedono anche significativo capabiliti normativoes, in modo tale che i destini di blastomeri ablati allo stadio di otto cellule possono essere presi in consegna dai discendenti di alcuni dei restanti blastomeri. Blastomere ablazione è stato precedentemente descritto da uno dei due metodi: iniezione e successiva attivazione di coloranti fototossiche o ablazione manuale. Tuttavia, fotoablazione uccide blastomeri ma non rimuove il corpo cellulare morto dall'embrione. Completa rimozione fisica di blastomeri specifici può quindi essere un metodo preferito di ablazione per alcune applicazioni. Qui vi presentiamo un protocollo per la rimozione manuale dei singoli blastomeri dalla fase di otto cellule di embrioni Parhyale, illustrando gli strumenti e le procedure manuali necessarie per la rimozione completa del corpo cellulare mantenendo vivo e intatto rimanenti blastomeri. Questo protocollo può essere applicato a qualsiasi cella Parhyale allo stadio di otto cellule, o blastomeri di altre fasi iniziali della scissione. Inoltre, in linea di principio questo protocollo possa essere applicabile ai primi di CleaVage embrioni stadio di altri invertebrati marini holoblastically fendendo.
Introduction
Il Parhyale hawaiensis anfipode crostaceo è emerso negli ultimi dieci anni come organismo modello promettente con un grande potenziale per l'uso in biologia dello sviluppo evolutivo di ricerca 1. Tra gli artropodi, la maggior parte dei sistemi modello sono insetti, e il più ampiamente studiati di questi è il moscerino della frutta Drosophila melanogaster. D. melanogaster è un membro dell'ordine dei Ditteri insetti, e come tale visualizza molte caratteristiche embrionali derivate rispetto a quelli degli insetti basally ramificazione 2. Inoltre, gli insetti sono annidati all'interno del subphylum Pancrustacea 3, il che significa che gli insetti hanno i loro parenti più stretti all'interno del gruppo di lunga data "naturale" chiamato pancrustaceans, e che questo gruppo è parafiletico. Ciò suggerisce che oltre alla ramificazione basally modelli insetti, studi di altri crostacei sono necessari per ottenere una visione più ampia della storia evolutiva dei tratti di sviluppo unmeccanismi molecolari nd che sono stati così ben studiate in D. melanogaster. Tuttavia, poche crostacei sono stati ben stabiliti per analisi di laboratorio sperimentale di sviluppo. Il anfipode P. hawaiensis è altamente trattabile sistema modello di laboratorio, suscettibili di una serie di tecniche sperimentali. Anfipodi mostrano molte caratteristiche uniche nel loro superorder genitori Peracarida (tramogge spiaggia, scudi, e gamberetti così), e sono quindi pensati per essere relativamente derivato all'interno di questo gruppo di crostacei. Tuttavia, la relativa facilità di manipolazione genetica embrionale e funzionale offerto da Parhyale rendono questo anfipode una preziosa aggiunta alla corrente inventario di organismi modello.
Come un animale da laboratorio, P. hawaiensis offre molti vantaggi. Gli animali sono tolleranti ad una vasta gamma di temperature e salinità, e sopravvivono bene in grandi culture di acqua di mare artificiale 1. E 'facile distinguere between maschi e femmine sulla base di differenze morfologiche evidenti, più in particolare, i grandi, uncinate, appendici tronco anteriori che i maschi usano per afferrare le femmine durante l'accoppiamento. Per il lavoro embrionale e dello sviluppo, P. hawaiensis ha diverse caratteristiche molto interessanti. Embriogenesi dura circa 10 giorni e il tempo per la maturità sessuale è di circa sei settimane a 28 ° C (ma si noti che Parhyale sopravvive bene a temperature che variano da circa il 20-30 º C, e che informazioni dettagliate messa in scena dello sviluppo è disponibile per gli embrioni sollevate a 18 º C 4 , 25 ° C 4, e 26 ° C 5,6). Adulti si accoppiano tutto l'anno in laboratorio, in modo da embrioni sono disponibili in qualsiasi periodo dell'anno. Le femmine depongono 2-20 (a seconda dell'età delle donne) uova fecondate in un sacchetto covata ventrale che si trova tra le prime paia di zampe (Figure 1A e 1B), ed è possibile raccogliere questi embrionis molto presto nello sviluppo senza uccidere la femmina o danneggiare gli embrioni (Figura 1C). Gli embrioni sopravvivono in acqua di mare artificiale filtrata fino alla schiusa, possono essere fissati per l'espressione genica o successiva analisi istologica 7, e una tabella dettagliata di gestione temporanea permette l'identificazione precisa dei progressi attraverso lo sviluppo 5. Protocolli robusti sono stati utilizzati per effettuare analisi di espressione genica mediante ibridazione in situ 8-15 o immunoistochimica 4,16,17, knockdown funzionale mediante RNA interference 13,15 o Morpholinos 12, e la linea germinale stabile transgenesi 18. Utilizzando il sistema di transgenesi, espressione inducibile 14 e trappola enhancer 19 metodi possono anche essere usati per studiare la funzione del gene in P. hawaiensis. Mentre una sequenza del genoma a disposizione del pubblico non è al momento disponibile, un trascrittoma contenente le trascrizioni prodotta durante oogenesi e embriogenesi ha apen de novo assemblati e annotati 20, e depositati in un database consultabile 21, facilitando la scoperta del gene. In sintesi, P. hawaiensis è un organismo modello molto maneggevole adatto per molteplici approcci sperimentali e genetici per comprendere lo sviluppo.
A differenza delle prime fratture sinciziale di D. melanogaster, P. embrioni hawaiensis fendere holoblastically segue fecondazione (Figura 2A). Lineage tracing analisi ha mostrato che dal terzo clivaggio, ciascuno dei terzi blastomeri scissione è specificamente destinata a dare origine ad uno dei tre strati germinali o la linea germinale 6 (Figura 2B). Questi dati, insieme ai dati di microarray 22, linea cellulare analisi 6,23, e gli esperimenti di isolamento blastomere 4 hanno suggerito che le potenzialità di sviluppo sono separate da almeno alcuni terzi blastomeri scissione di eredità asimmetrica del cell determinanti destino. Pertanto, in esperimenti blastomere ablazione in cui il precursore linea germinale (chiamato "g" nella linea cellulare nomenclatura Parhyale 6) è stato rimosso nella fase otto cellule, embrioni mancavano cellule germinali in successivi stadi di sviluppo 4, come indicato dall'assenza di cellule esprimendo la proteina Vasa, che è un marker germinale nella maggior metazoi 24. Al contrario, somatiche esperimenti ablazione blastomeri hanno mostrato che P. embrioni hawaiensis possiedono anche notevoli capacità di regolamentazione, in modo tale che le sorti del mesoderma o ectoderma blastomeri precursori ablati allo stadio di otto cellule possono essere presi in consegna dai discendenti di alcuni dei restanti 25 blastomeri. Come regolativo sostituzione destino delle cellule può verificarsi, e il grado di autonomia adozione destino delle cellule somatiche da blastomeri, rimane sconosciuto. Sperimentali tecniche embriologiche come blastomere ablazione può essere utile a comprending l'autonomia relativa e nonautonomy delle decisioni destino delle cellule 26,27 e sono quindi di interesse per lo studio di P. hawaiensis embriogenesi.
Negli esperimenti che hanno dimostrato la sostituzione regolatore del ectodermici e mesodermici lignaggi, ablazione blastomeri è stata eseguita mediante iniezione 28 e la successiva eccitazione coloranti fototossiche 25. Mentre questa tecnica è efficace a uccidere il blastomeri (s) iniettato, non rimuove completamente il corpo cellula morta dall'embrione. Inoltre, sono state osservate differenze tra i dati raccolti attraverso il lignaggio delle cellule agli stadi gastrulazione dell'embriogenesi iniettando blastomeri con traccianti fluorescenti lignaggio 28,29, ei dati raccolti seguendo blastomeri imperturbati attraverso lo sviluppo degli stessi stadi embrionali 23. Completa rimozione fisica di blastomeri specifici può quindi essere un metodo preferito di ablazione per alcune applicazioni.
Abbiamo già pubblicato i risultati della linea cellulare analisi degli embrioni in cui singole cellule sono state asportato manualmente 23. Tuttavia, le delicate operazioni necessarie per rimuovere i singoli blastomeri dai primi scissione embrioni fase non sono ancora state pienamente descritte. Qui vi presentiamo un protocollo per la raccolta di P. embrioni hawaiensis e ablazione manuale di un singolo blastomero da un embrione di otto cellule. L'obiettivo di questo metodo è quello di ottenere la rimozione completa del corpo cellulare dall'embrione, che permette l'osservazione dei comportamenti cellulari e competenze destino cellulare delle restanti cellule durante l'embriogenesi e sviluppo post-embrionale. Il nostro protocollo mostra rimozione del precursore g germinale (Figura 2C), ma può essere applicato a qualsiasi cella nella fase di otto cellule, o di blastomeri di scissione fasi precedenti. In linea di principio, questo protocollo potrebbe essere applicato a rimuovere le singole cellule da embrioni precoci fase scissione di Other holoblastically cleaving invertebrati marini.
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Protocol
Commenti che possono essere utili in esecuzione di alcuni passaggi sono indicati in corsivo.
1. Giorno 1: Preparazione dei Materiali
- Preparare i seguenti materiali (cfr. tabella dei Materiali e attrezzature):
- 15 cm e 22 cm pipette Pasteur
- Diamante scriba
- acqua di mare artificiale filtrata (salinità tra 0,0018-0,0020) contenente 1 mg / ml di amfotericina B (1:100 di una soluzione madre di 100 mg / ml), 100 unità / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina (1:50 di una soluzione madre contenente 5.000 unità / ml di penicillina e 5.000 mg / ml di streptomicina)
- filtrata acqua di mare artificiale (salinità tra 0,0018-0,0020) senza additivi
- un grande contenitore di plastica per le coppie abitative (di almeno 15 cm x 15 cm x 5 cm)
- di piccole dimensioni (3 cm o 5 centimetri) piastre Petri rivestite con Sylgard
- di piccole dimensioni (3 cm o 5 centimetri) piastre di Petri
- un vetro d'orologio o lastra di vetro multi-bene
- Pinza (usiamo una pinza smussato derivati from vecchio Dumont # 5 pinze accidentalmente danneggiati in altre procedure di laboratorio, che abbiamo riproposto utilizzando una pinza pietra per affilare ad assicurare che le estremità della pinza sono lisce, che entrambi i denti sono della stessa lunghezza, e che non hanno più punti taglienti. Pinza estremamente sottili, come i nuovi Dumont # 5 pinze, sono indesiderabili in quanto possono danneggiare gli embrioni e / o femmine).
- una pipetta Pasteur con l'estremità allargata (vedi punto 1.2)
- uno strumento di recupero embrione costituito da un sottile filo di tungsteno curvo incorporato nella estremità sottile di una pipetta Pasteur (potrebbe essere sostituito da un'alternativa attuare; vedere 1.3)
- una pipetta bocca con una piccola apertura (vedi punto 1.4)
- un ago di vetro fatto da un capillare di vetro tirato (vedi punto 1.5 che segue)
- Per rendere la pipetta Pasteur allargato, primo punteggio intorno una pipetta Pasteur 15 centimetri nel punto in cui la pipetta comincia a ridursi con un scribe diamante, avvolgere la regione segnato della pipetta in un asciugamano Kimwipe o carta per proteggere le dita, e poi accuratamente rompere la punta alla linea di frattura. Tenere l'estremità rotto della pipetta su una fiamma del bruciatore Bunsen per alcuni secondi per smussare i bordi. L'apertura dovrebbe essere leggermente più stretta della larghezza massima della pipetta.
- Per rendere lo strumento di dissezione filo di tungsteno, inserire un filo di tungsteno nell'estremità di un 15 centimetri pipetta Pasteur di vetro, premuto brevemente su un becco Bunsen per fondere il vetro, che fissa il filo in posizione. Usare pinze per curva dolcemente alla fine del filo a forma di uncino. Vedi Figura 3 per un esempio di una forma appropriata per questo strumento.
- Per fare una piccola apertura per la pipetta bocca, tirare l'estremità sottile di un 22 centimetri pipetta Pasteur in due parti over una fiamma, e rompere la punta del piede di biella. Inserire nell'estremità del titolare pipetta bocca.
- Effettuare l'ago di vetro che verrà utilizzato per perforare i blastomeri di interesse durante la procedura di ablazione mediante estrattore ago. Un ago opportunamente sagomato è mostrato in Figura 4. Questo ago è stato tirato su un estrattore Sutter P97 ago utilizzando un programma con i parametri 2x (calore = 566, tirare = 100, velocità = 20 time = 250) + 1X (calore = 566, tirare = 100, velocità = 100, tempo = 250). Il programma e specifico strumento usato per fare l'ago può variare, ma l'ago deve avere un punto di fine, ma anche essere abbastanza robusto da non rompersi quando spinto contro il corion dell'embrione.
2. 1 ° giorno: Coppie Gathering Parhyale affini
- Utilizzare la pipetta Pasteur ampliato (fase 1.2 di cui sopra) per raccogliere accoppiamento P. coppie hawaiensis dal grande contenitore di coltura, e trasferirli in un contenitore contenente separato cmagra acqua di mare artificiale. Non è necessario che questa acqua di mare filtrata. E 'meglio raccogliere le coppie di accoppiamento nel tardo pomeriggio e lasciare le coppie a temperatura ambiente (20-23 ° C) durante la notte, in modo che la mattina dopo, la maggior parte degli embrioni sono stati recentemente fecondato e depositato, e quindi a presto scissione fasi adatto per ablazione. Raccogliere almeno 20 coppie di accoppiamento per garantire che alcune femmine saranno portando primi scissione embrioni stadio la mattina seguente.
3. 2 ° giorno: Raduno Parhyale embrioni
- La mattina successiva, infondere acqua di mare artificiale filtrata (FASW) con CO 2. Alcune delle femmine avranno nuotato liberi dai loro maschi durante la notte; raccogliere queste femmine separati e anestetizzare in FASW / CO 2. I restanti maschi spaiati possono essere rimossi dal contenitore coppia di accoppiamento e restituito al grande cultura. Coppie di accoppiamento rimanenti possono essere salvati per la raccolta di embrioni tardinel corso della giornata o il giorno successivo.
- Trasferire una singola femmina anestetizzato portando embrioni per un vetro da orologio in FASW / CO 2. Tutte le femmine separate probabilmente hanno depositato le uova, che sarà visibile ad occhio il rosa pallido o sferoidi viola attraverso le piastre coxal trasparenti delle femmine (Figura 1A). Per determinare se gli embrioni sono nelle fasi iniziali scissione e quindi adatto per blastomeri ablazione, il ricercatore dovrà rimuovere gli embrioni dal sacchetto covata ed esaminarli al microscopio.
- Visualizzazione della procedura sotto un microscopio da dissezione, afferrare i piatti coxal lungo un lato del corpo con una pinza. Gli embrioni saranno visibili nel sacchetto covata ventrale tra questi piatti coxal (Figura 1B).
- Inserire il sottile, strumento filo curvo (figura 3; precedente punto 1.3) nell'estremità posteriore del sacchetto covata, e sollevare delicatamente il filo verso l'estremità anteriore del sacchetto covata per separare la covatarivestimenti sacchetto (questi sono modificati appendici ventrali chiamati oostegites 30), aprendo il sacchetto ed allentando gli embrioni. Gli embrioni che si trovano entro la prima ora o così di essere licenziati sono tutti racchiusi all'interno di una sottile membrana trasparente che sarà facilmente interrotto dallo strumento a filo; questa membrana scompare di circa 2-3 ore dopo la deposizione delle uova e gli embrioni non sono vincolati tra loro o alla femmina in alcun modo da questo punto in poi tutta l'embriogenesi. Se i ricercatori trovano scomodo o difficile da manovrare l'utensile filo curvo per rimuovere embrioni dal sacchetto covata, un'alternativa implementare può essere utilizzato, purché i movimenti sono delicati e nessuna pressione duro viene applicato al embrioni o il sacchetto covata. Altri strumenti adeguati per rimuovere gli embrioni dal sacchetto covata includono pinze smussate o un capillare di vetro con un'estremità sigillata e levigato.
- Utilizzare un inalterata 15 centimetri pipetta Pasteur per svuotare l'acqua attraverso il sacchetto covata aperta, spingendo fuori tegli embrioni, che dovrebbe depositarsi sul fondo del vetro da orologio. Trasferire la femmina per pulire FASW (senza CO 2) per permettere il recupero prima di reintrodurre lei alla cultura principale. Più femmine possono essere collocati nello stesso piatto di recupero, ma le femmine permettono di recuperare completamente prima di restituirli alla cultura principale, in quanto possono essere mangiati da altri animali se sono ancora parzialmente anestetizzati.
- Utilizzare un inalterata 15 centimetri pipetta Pasteur per trasferire gli embrioni in una capsula di Petri con FASW pulito, e visualizzare al microscopio per determinare la loro fase embrionale. Embrioni distinti che sono alla terza fenditura (fase 4 5), che sono adatti per questa procedura. Dovrebbe inoltre essere possibile applicare questo protocollo per ogni fase scissione prima della formazione del disco di germi (stadi 7-8 MAGGIO).
4. 2 ° giorno: ablazione di singole cellule
- Riempire piastra di Petri Sylgard alberato con uno strato di FASW superficiale. Utilizzare un inalterata 15 centimetri Pasteur pipipetta per trasferire un singolo embrione alla piastra.
- Utilizzando pinze smussato, inclinarsi leggermente l'embrione per identificare la cella da asportare (Figure 2A e 2B). La linea germinale precursore g può essere identificato come il micromere più piccolo, che si trova sulla cima della più piccola Mav macromere. Inoltre, g non contattare direttamente la cellula en, che è il micromere direttamente di fronte, come le ml micromeri mesoderma precursori e la quota di mr margine di una cella nel centro dell'embrione. Mr è il blastomere a destra di g, e ml è il micromere a fianco di g. Le macromeres sorella di mr, ml, e en sono i precursori ectoderma Er, El, e Ep, rispettivamente.
- Con una pinza in left mano se il ricercatore è di mano destra (o la mano destra se il ricercatore è mancino), orientare l'embrione con la cella di interesse a destra (oa sinistra se il ricercatore è mancino), e afferrare delicatamente l'embrione tra le pinze per stabilizzarlo.
- Utilizzando un ago tirato vetro (passo 1.5 sopra; la figura 4), forare delicatamente la cella di interesse. Non inserire l'ago troppo, in modo da non spingere l'ago nelle celle vicine o sotto la cella di interesse. L'ago ha solo per forare la membrana cellulare e corion sottostante, e non deve estendersi profondamente nella cella da asportare.
- Sostituire l'ago utilizzato per forare l'embrione per la fine del vetro di una pipetta bocca con una bella tirata Pasteur puntale (precedente punto 1.4). Tenere la punta della pipetta vicino al foro creato nella cella di interesse, e applicare molto delicata aspirazione.
- Molto premere delicatamente l'embrione con le pinze. Dato che il contenuto del blastomera viene spinto fuori dal corion attraverso il foro creato nel passaggio 4.4, succhiare in pipetta bocca per consentire una visuale libera dell'embrione. Se il foro è abbastanza grande, il nucleo della cellula perforato può essere visto emergere pure. Questo è un buon controllo per assicurarsi che tutto il contenuto della cella sono state rimosse e non possono essere rigenerata.
- Osservare attentamente l'embrione come blastomere di interesse viene rimosso. Il bordo della cella forato retrocederà verso il foro del corion, rendendo l'intersezione delle celle sottostanti visibili. Continuare ad applicare la pressione fino a quando tutti blastomero di interesse è stato rimosso. Utilizzare pinze a rotolare l'embrione da un lato all'altro e confermare visivamente che tutto il blastomero di interesse è andato.
- Utilizzando un inalterata 15 centimetri pipetta Pasteur, trasferire l'embrione pulire FASW + (FASW + 1 mg / ml di amfotericina B, 100 unità / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina).
- Sollevare embrioni blastomeri-ablazione a singoli pozzidi una piastra a 48 pozzetti pulita in FASW +, cambiando il 50% di antibiotico-FASW integrato + giornaliero. Nelle nostre mani embrioni sopravvivere e svilupparsi bene, anche a seguito di ablazione, in una gamma di temperature di 18-28 ° C. I ricercatori dovrebbero aumentare i loro embrioni a una temperatura per la quale hanno una superficie pulita (ma non necessariamente sterile) sul quale generare gli embrioni con il minimo disturbo. Per poter confrontare i tempi degli eventi di sviluppo in embrioni blastomeri-ablazione con controlli, rimandiamo il lettore alle informazioni dettagliate messa in scena dello sviluppo che è disponibile per gli embrioni sollevate a 18 º C 4, 25 º C 4, e 26 º C 5,6.
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Representative Results
Dopo il successo ablazione del singolo terzi scissione P. micromeri hawaiensis come descritto in questo protocollo, i restanti micromeri progressivamente spostano le loro posizioni leggermente in modo da occupare parzialmente lo spazio precedentemente occupato dal blastomero ablato. Per esempio, quando g viene rimosso, la vicina blastomeri mr e ML spostare leggermente e venire a condividere i bordi delle celle laterali che erano precedentemente in diretto contatto con g (confronta Figura 2A e 2C). Dopo ablazione successo, i restanti blastomeri possono visualizzare un leggero ritardo (meno di un'ora) prima di entrare quarto scissione, ma dovrebbero riprendere gli stessi schemi scissione e tempi che avrebbero mostrato in embrioni non manipolate almeno fino a gastrulation fasi 23 . Seguendo l'ablazione di una delle quattro micromeri, discendenti della blasto restanteMeres devono anche mostrare tempistica scissione normale e comportamenti cellulari, tra cui la formazione di una disposizione caratteristica di cellulare chiamato la "rosetta" e l'avvio di movimenti gastrulazione 23. La percentuale di embrioni che sopravvivono alla procedura di ablazione e completa embriogenesi fino alla schiusa può essere inizialmente dell'ordine di circa 10% per un ricercatore nuovo alla tecnica, ma con esperienza dovrebbe mediamente il 50%, e può raggiungere il 75% con la pratica e la cura vigile di embrioni seguenti ablazione blastomeri. Tabella 1 mostra esempi di numero di embrioni ablati e tassi di sopravvivenza per una serie di esperimenti di ablazione successivi effettuati dallo stesso ricercatore, dimostrando che i tassi di sopravvivenza sono generalmente almeno il 80% per le prime giorni dopo l'ablazione, e che i tassi di sopravvivenza fino alla schiusa aumento con l'aumentare dell'esperienza del ricercatore.
Rimozione blastomere incompleta sarebbeevidenziato da vedere i resti del blastomero che avrebbe dovuto essere asportate, che potrebbero includere componenti della membrana, citoplasma, o granuli tuorlo, ancora situati nel corion dell'embrione. Un ritardo nella quarta scissione di più di due ore, o modelli scissione irregolari o comportamenti cellulari dei discendenti dei restanti blastomeri, potrebbe anche indicare ablazione riuscita. Questi fenomeni possono essere il risultato di danni causati ad altri blastomeri durante la procedura di ablazione. Se blastomeri diverso da quello di destinazione per la visualizzazione ablazione anomalie morfologiche o disintegrare, poi di nuovo il danno è probabilmente stata causata da altri blastomeri nel corso della procedura di ablazione.
Se marcatori destino cellulare sono disponibili per etichettare i discendenti di specifici blastomeri terzo scissione cui destini non sono soggetti alla sostituzione regolativo, quindi un'ulteriore conferma di ablazione di successo può essere ottenuta con etichettatura manipolato gli embrioni con i marcatori Folloala l'ablazione. Marcatori di alcuni territori mesodermiche e ectodermica sono state descritte a metà fasi tardive della embriogenesi 8,14,15. Tuttavia, poiché entrambi questi strati germinali può subire sostituzione regolativo in caso di perdita di uno dei loro fondatori blastomeri 25, questi indicatori potrebbero non senza ambiguità determinare se o non blastomeri ablazione ha avuto successo. Nel caso della linea germinale precursore g, tutti i suoi discendenti sono contrassegnati mediante l'espressione di vasa trascritto 12 e proteine 4 durante l'embriogenesi, e gli embrioni in cui g è stato asportate cellule germinali mancanza, almeno fino alla fascia presto germe tappe di 4. Ablazione successo di g può quindi essere confermata dall'esame espressione vasa seguente ablazione in fasi successive di embriogenesi (Figura 5).
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Figura 1. Adulto Parhyale hawaiensis femminili ed embrioni. (A) Vista laterale di una femmina adulta P. hawaiensis, mostrando piatti coxal (frecce), appendici toraciche (frecce) ed embrioni visibili come sferoidi di colore rosa o viola attraverso le piastre coxal trasparente (blu contorno tratteggiata). Anteriore è a sinistra. (B) Vista ventrale di una femmina adulta P. hawaiensis mostra embrioni visibili nel sacchetto covata (contorno blu tratteggiata). Anteriore è a sinistra. (C) Embrioni rilasciate da covata sacchetto si sviluppano normalmente in FASW. Una varietà di fasi che vanno da S1 a cova sono presenti, allestita secondo Browne et al 5 Scale bar = 1 mm (A) e (B);. 500 micron di (C).51073/51073fig1highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Otto embrioni stadio delle cellule di P. hawaiensis. (A) Live stadio di otto cellule (stadio S4 5) embrione non manipolata, costituito da quattro micromeri (cellule più piccole) e quattro macromeres (cellule più grandi). (B) Schema di uno stadio embrionale di otto cellule che mostra denominazioni destino delle cellule di tutti i blastomeri in una wild type embrione come rivelato da lineage tracing basato su marcatori fluorescenti 6. (C) Live S4 fase embrionale che ha avuto il g blastomere rimossi con il presente protocollo. La regione cerchiata mostra la regione precedentemente occupato dal g blastomere; l'rimanenti micromeri sono spostate posizione leggermente per effetto dell'ablazione di g. Scale bar = 250 micron di (A) e (C). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Strumento filo utilizzato per la rimozione embrioni dal sacchetto covata. L'utensile mostrato qui è stata effettuata inserendo un filo di tungsteno nella parte più stretta di una pipetta Pasteur e delicatamente fusione del vetro per sigillare il filo in posizione, quindi utilizzando pinze per introdurre una curva dolce nel filo. Altri strumenti adeguati per rimuovere gli embrioni dal sacchetto covata includono pinze smussate o un capillare di vetro con un'estremità sigillata e levigato. Scbar ale = 1 centimetro.
Figura 4. Ago di vetro utilizzato per pungere blastomeri durante la procedura di ablazione. L'ago qui illustrato è stato tirato su un estrattore Sutter P97 ago utilizzando un programma con i parametri 2 x (calore = 566, tirare = 100, velocità = 20, tempo = 250) + 1 x (calore = 566, tirare = 100, velocità = 100, tempo = 250). Altri strumenti o programmi possono essere utilizzati per tirare gli aghi adatti per l'ablazione, purché abbiano la stessa forma generale come quella mostrata qui. Barra della scala = 1 cm.
Figura 5. Valutare i risultati di un blastomeroblation durante l'embriogenesi. (A) Gonade regione di un tipo selvaggio fase S29 embrione poco prima della schiusa, mostrando le cellule germinali etichettati da anti-Vasa immunoistochimica (punte di freccia). L'anticorpo anti-Vasa usato qui è specifico per P. hawaiensis Vasa (Linsler, Alwes e Extavour, dati non pubblicati). (B) Gonade regione di un embrione fase S29 che ha avuto il g blastomere rimosso allo stadio di otto cellule, mostrando assenza di cellule germinali come rivelato dalla mancanza di segnale specifico anti-Vasa nella regione gonade (punte di freccia). Bar Scala in (A) = 100 micron e vale anche per (B). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Rotondo Ablazione | # Ablated | # (%) Sopravvissuteallo sviluppo 50% | # (%) Sopravvissute allo sviluppo del 90-100% |
| 1 | 49 | 41 (83.7) | 6 (12.2) |
| 2 | 48 | 46 (95.8) | 17 (35.4) |
| 3 | 31 | 25 (80.6) | 22 (71.0) |
| 4 | 97 | 72 (74.2) | 56 (57.7) |
| 5 | 108 | 100 (92.6) | 65 (60.2) |
| 6 | 50 | 36 (72.0) | 37 (74.0) |
| TOTALE | 383 | 320 (83.6) | 203 (53.0) |
Tabella 1. Sopravvivenza ablazione Rappresentantestatistiche. Dopo micromere ablazione, la sopravvivenza è stato segnato sia all'interno del primo 50% dello sviluppo (5-6 giorni a 25 ° C) e quindi allo sviluppo 90-100% (10-12 giorni a 25 ° C). Ablazione arrotonda 1-6 sono esempi rappresentativi di esperimenti condotti da un singolo ricercatore (AR Nast) in ordine cronologico nel corso di un periodo di otto mesi. I ricercatori devono scoprire che, come mostrato qui, i tassi di sopravvivenza al 90-100% di incremento di sviluppo con esperienza.
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Discussion
Descriviamo un protocollo per l'ablazione manuale e rimozione fisica completa di singoli blastomeri dalle fasi iniziali della scissione del anfipode P. hawaiensis. Dimostriamo l'uso di questo protocollo rimuovendo la singola linea germinale cellula precursore g da una fase embrionale di otto cellule, e dimostrare che l'ablazione ha avuto successo, confermando l'assenza di s 'g cellule figlie in embriogenesi più tardi. Questo protocollo può essere utilizzato per rimuovere qualsiasi micromeri dall'embrione nelle fasi iniziali scissione. Per utilizzare questo protocollo per rimuovere macromeres in questa fase, o blastomeri nelle fasi prima o seconda scissione, gli utenti possono semplicemente applicare le lievi modifiche di creazione di un foro leggermente più grande nel corion nella fase 4.4, e l'applicazione di pressione e di aspirazione per un tempo più lungo per rimuovere il maggior volume del contenuto della cella nella fase 4.6. Abbiamo scoperto che in seguito all'uso di questo protocollo, lo sviluppo delle restanti blastomeri dopo ablazione è ONUcolpiti rispetto ai modelli scissione e il movimento delle cellule almeno fino al momento della gastrulazione 23.
Questo protocollo potrebbe essere utile per continuare indagine sul potenziale di sviluppo dei primi blastomeri scissione in questo anfipode. Molte domande rimangono senza risposta in questo settore, anche perché alcune cellule ma non altri possono cambiare sorti a sostituire quelli di blastomeri asportate, e la tempistica precisa e meccanismi di questi cambiamenti regolatori. Il protocollo può anche essere modificato per accogliere l'ablazione di più di una cella, semplicemente ripetendo i passaggi 4,2-4,7 successivamente a blastomeri di interesse.
E 'importante utilizzare uno stereomicroscopio di alta qualità con illuminazione adeguato al fine di visualizzare e identificare correttamente i blastomeri scissione precoce. Troviamo che incidente laterale luce bianca da una sorgente di luce fredda fibra ottica è la più utile per questo scopo. Luce incidente direttamente sopra la SPECIMit crea riflessi che possono oscurare le morfologie e confini cellulari, mentre la luce trasmessa non riesce a penetrare il tuorlo denso degli embrioni e dei blastomeri sono quindi difficili da distinguere. E 'più utile per il vetro dell'orologio o un piatto di Petri contenente gli embrioni devono essere collocati su una superficie nera piuttosto che una superficie di vetro bianco o trasparente, in quanto fornisce la migliore contrasto per gli embrioni pallide.
Una limitazione di questo protocollo è che la blastomere di interesse deve essere correttamente identificato in modo inequivocabile, prima di iniziare la procedura. Tecniche di fotoablazione sarebbero più utili per i ricercatori nuovo al sistema, poiché gli embrioni possono essere lasciati sviluppare per alcuni cicli scissione dopo l'iniezione del colorante fluorescente 28, e l'identità del blastomero iniettato confermate post-iniezione, ma prima fotoablazione, analizzando i modelli dei discendenti cellulari, che sono stati ben descritti nella linea cellulare precedenteetà analizza 6,23. Una volta che i ricercatori hanno familiarità con il P. hawaiensis embrione e in grado di identificare tutti i blastomeri con fiducia, l'ablazione manuale qui descritto potrebbe essere utilizzato per applicazioni in cui la rimozione fisica completa di un blastomero, piuttosto che uccidere la cellula senza rimuovere il corpo cellulare morto dall'embrione, è auspicabile.
Questa procedura potrebbe, in linea di principio essere applicata per rimuovere singoli blastomeri da embrioni stadio scissione di altri crostacei holoblastically fendendo, o di altri invertebrati marini o d'acqua dolce le cui chorions o membrane di fecondazione non può essere facilmente rimosso. Le modifiche potrebbero includere utilizzando supporti di incubazione con adeguate caratteristiche di salinità, e modificando la forma dell'ago per accogliere membrane più delicate (più lunghi, aghi sottili) o rivestimenti embrionali più robusti (più brevi, rapido affusolate aghi).
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Rayhan Arif e Hassaan Shahawy per il lavoro della macchina fotografica, Tripti Gupta e Frederike Alwes per l'assistenza affinando la tecnica di ablazione delle cellule, e membri del laboratorio Extavour per il feedback sui dati, video e manoscritto. Questo lavoro è stato in parte sostenuto dalla Harvard Stem Cell Institute (Seed numero di Grant SG-0057-10-00) Ellison Medical Foundation (New Scholar Award numero AG-NS-07010-10) alla CGE, e premi Harvard programma del college di ricerca per ARN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 cm Pasteur pipette | Wheaton | 53499-630 VWR | For transferring intact and blastomere-ablated embryos from dish to dish. |
| 22 cm Pasteur pipette | Wheaton | 53499-632 VWR | For making mouth pipette tips. |
| 3 cm Petri dishes | Thermo Scientific | 25382-334 VWR | Use some unaltered to collect and store embryos; coat some with a layer of Sylgard (see below) to create a working surface for blastomere ablations. |
| 48-well Plates | Greiner Bio-One | 82051-004 VWR | For culturing embryos following ablation. |
| Bottle top filters 0.2 µm | Nalge Nunc International | 28199-296 VWR | For creating FASW (See below). |
| Bunsen burner | VWR | 89038-530 VWR | For creating tungsten wire tool and fine tip of mouth pipette. |
| Diamond scribe | Musco Sports Lighting | 52865-005 VWR | For creating wide-mouthed Pasteur pipettes for collecting couples. |
| Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 Fine Science Tools | For holding anaesthetized females during removal of embryos from brood pouch. These do not have to be fine-tipped Dumont forceps - the tips can be at least as blunt as those of the forceps for which the catalogue number is listed here. |
| Fungizone-Amphotericin B | Sigma | A2942 Sigma Aldrich | Add to FASW to a final concentration of 1 mg/ml, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. |
| Glass capillaries 4 in long, 1/0.58 OD/ID (mm) | World Precision Instruments | 1B100-4 World Precision Instruments | For making needles for puncturing the blastomere to be ablated. |
| Glass watchglass 300 mm diameter | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 Electron Microscopy Sciences | For use in removing embryos from the brood pouch of anesthetized females. |
| Instant Ocean Artificial Sea Water (ASW) | Instant Ocean | IS160 Aquatic EcoSystems | Make ASW by dissolving salt in deionized water to a salinity of 1.022-1.024. |
| Instant Ocean Filtered Artificial Sea Water (FASW) | Instant Ocean | IS160 Aquatic EcoSystems | Use 0.2 µm filters to sterilize ASW. Make up in small amounts (< 250 ml) as needed. |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 21905-026 VWR | For safely breaking off the fine end of Pasteur pipettes modified for collecting couples. |
| Mouth pipette adaptor | Drummond Labware | A5177-5EA Sigma Aldrich | Insert the fine pulled Pasteur pipette tip into this end, to be used for removing extruded cell contents during the ablation procedure. |
| Mouth pipette tubing | Aldrich | Z280356 Sigma Aldrich | Cut this to be long enough to comfortably hang around your neck during the ablation procedure. |
| Needle Puller | Sutter Instrument Company | P97 Sutter Instrument Company | For making needles from glass capillaries for puncturing the blastomere to be ablated. |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Mediatech | 45000-650 VWR | Add to FASW to a final concentration of 100 units/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. |
| Rubber bulb | Electron Microscopy Sciences | 100488-418 VWR | For using Pasteur pipettes to transfer embryos from dish to dish. |
| Sylgard 184 | K. R. Anderson, Inc. | NC9659604 Fisher Scientific | Make up according to manufacturer's instructions. Pour a layer 2-5 mm thick into a 3cm petri dish to create a working surface for blastomere ablations. |
| Tungsten wire 0.004 inches diameter | A-M Systems | 719000 A-M Systems | Use this to make a tool for removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. |
References
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