Summary
Amphipoden Parhyale hawaiensis er en lovende model organisme til studier af krebsdyr embryologi og sammenlignende leddyr udvikling og evolution. Denne protokol beskriver en metode til manuel fjernelse af enkelte blastomeres fra tidlig spaltning stadie embryoner fra Parhyale.
Abstract
Amphipoden Parhyale hawaiensis er et lille krebsdyr findes i tidevandszonen marine habitater på verdensplan. Gennem det seneste årti, har Parhyale dukket op som en lovende model organisme til laboratorieundersøgelser udvikling, der giver et nyttigt udgruppe sammenligning til brønden studerede leddyr model organisme Drosophila melanogaster. I modsætning til de syncytial spaltning af Drosophila de tidlige spaltning af Parhyale er holoblastic. Skæbne kortlægning ved hjælp af tracer farvestoffer indsprøjtes i tidlige blastomeres har vist, at alle tre kim lag og kønscellerne er fastsat af den otte-celle stadiet. På dette stadium er der tre blastomeres skæbnebestemt til at give anledning til ectoderm er tre skæbnebestemt til at give anledning til mesoderm, og de resterende to blastomeres er forløbere for endodermen og kønsceller hhv. Imidlertid har blastomere ablation eksperimenter vist, at Parhyale embryoner også besidder betydelig lovgivningsmæssig capabilities, sådan at skæbner blastomererne ablated på otte-celle stadiet kan overtages af efterkommere af nogle af de resterende blastomeres. Blastomere ablation er tidligere blevet beskrevet af en af to metoder: injektion og efterfølgende aktivering af fototoksiske farvestoffer eller manuel ablation. Men fotoablatio dræber blastomeres men fjerner ikke den døde celle kroppen fra embryoet. Fuldstændig fysisk fjernelse af specifikke blastomeres kan derfor være en foretrukken metode til ablation til nogle anvendelser. Her præsenterer vi en protokol for manuel fjernelse af enlige blastomererne fra otte-celle stadie af Parhyale embryoner, der illustrerer de instrumenter og manuelle procedurer, der er nødvendige for fuldstændig fjernelse af cellen kroppen og samtidig holde de resterende blastomeres live og intakt. Denne protokol kan anvendes på enhver Parhyale celle i otte-celle stadiet eller blastomeres andre tidlige spaltningsprodukter faser. Desuden er denne protokol i princippet kunne være gældende for tidlig cleaVåge embryoer i andre holoblastically kløvning marine hvirvelløse dyr.
Introduction
Amphipoden krebsdyr Parhyale hawaiensis er opstået i løbet af det sidste årti som en lovende model organisme med stort potentiale til brug i evolutionær udviklingsmæssige biologi forskning 1. Blandt de leddyr fleste modelsystemer er insekter, og den mest ekstensivt studerede af disse er frugtfluen Drosophila melanogaster. D. melanogaster er medlem af insektordenen Diptera, og som sådan viser mange embryologiske funktioner, der er afledt med hensyn til de basalt forgrenede insekter 2. Desuden er insekter indlejret i subphylum Pancrustacea 3, hvilket betyder, at insekter har deres nærmeste slægtninge i den mangeårige "naturlige" gruppe kaldet pancrustaceans, og at denne gruppe er paraphyletic. Dette tyder på, at der ud over basalt forgrening insekt modeller, er studier af andre krebsdyr kræves for at få et bredere syn på den evolutionære historie udviklingsmæssige træk ennd molekylære mekanismer, der har været så godt undersøgt i D. melanogaster. Imidlertid har meget få krebsdyr været veletableret eksperimentel laboratorieanalyse af udvikling. Amphipoden P. hawaiensis er en meget medgørlig laboratorium model-system, gøres til genstand for en række eksperimentelle teknikker. Amphipoder vise mange unikke funktioner inden for deres forældre superorder Peracarida (strand tragte, scuds, og godt rejer), og derfor menes at være relativt udledes inden for denne gruppe af krebsdyr. Ikke desto mindre er den relative lethed af embryologiske og funktionel genetisk manipulation, der tilbydes af Parhyale gøre dette amphipoden en værdifuld tilføjelse til den nuværende beholdning af modelorganismer.
Som laboratoriedyr, P. hawaiensis giver mange fordele. Dyr er tolerante over for et bredt område af temperaturer og saltholdighed og overleve godt i store kulturer af kunstigt havvand 1. Det er let at skelne meleen hanner og hunner er baseret på klare morfologiske forskelle, især, de store, hooked, torsoens vedhæng, at mænd bruger til at gribe hunnerne under parring. For embryologiske og udviklingsarbejde, P. hawaiensis har flere meget tiltalende træk. Embryogenesis varer cirka 10 dage, og tiden til kønsmodenhed er cirka seks uger ved 28 º C (men bemærk, at Parhyale overlever godt ved temperaturer fra 20-30 º C, og at detaljerede udviklingsmæssige iscenesættelse information er tilgængelig for embryoner rejst ved 18 º C 4 , 25 º C 4 og 26 º C 5,6). Voksne parre hele året rundt i laboratoriet, så embryoner er tilgængelige på ethvert tidspunkt af året. Hunnerne lå 2-20 (afhængigt af alder af de kvindelige) befrugtede æg i en ventral kuld pose placeret mellem de første par ben (figur 1A og 1B), og det er muligt at samle disse embryos meget tidligt i udviklingen uden at dræbe den kvindelige eller beskadige embryoner (jf. figur 1c). De embryoner overleve i filtreret kunstig havvand igennem til udrugning, der kan fastsættes for efterfølgende genekspression eller histologiske analyser 7, og en detaljeret fasetabel muliggør nøjagtig identifikation af fremskridt gennem udvikling 5.. Robuste protokoller er blevet anvendt til at udføre genekspressionsanalyse ved in situ hybridisering 8-15 eller immunfarvning 4,16,17, funktionelle knockdown af RNA-interferens 13,15 eller morpholinos 12 og stabil kønsceller transgenese 18. Ved hjælp af transgenese system inducerbar ekspression 14 og enhancer trap 19 fremgangsmåder kan også anvendes til at undersøge genfunktion i P. hawaiensis. Mens en offentligt tilgængelig genomsekvens er i øjeblikket ikke tilgængelig, en transkriptom indeholder udskrifter produceres under oogenesen og embryogenesen har bin de novo samlet og kommenteret 20, og deponeres i en søgbar database 21, lette gen opdagelse. I sum, P. hawaiensis er en meget medgørlig model organisme egnet til flere eksperimentelle og genetiske metoder til at forstå udviklingen.
I modsætning til de tidlige syncytial spaltning af D. melanogaster P. hawaiensis embryoner kløve holoblastically efter befrugtningen (figur 2A). Lineage opsporing analyse har vist, at ved tredje spaltning, er hver af de tredje spaltningsprodukter blastomeres specifikt skæbnebestemt til at give anledning til en af de tre kimlag eller kønscellerne 6 (figur 2B). Disse data sammen med microarray-data 22, celleafstamning analyser 6,23, og blastomere isolation eksperimenter 4 har foreslået, at udviklingsmæssige potentialer er adskilt for i det mindste nogle tredje spaltningsprodukter blastomeres ved asymmetrisk arv af cell skæbne determinanter. Følgelig i blastomer ablation eksperimenter, hvor kønscellerne precursor (betegnet "g" i Parhyale cellelinie nomenklatur 6) blev fjernet fra de otte celle stadium embryoner manglede kimceller i senere udviklingsstadier 4, som indikeret ved fravær af celler ekspression af proteinet Vasa, som er en kimcellelinje markør i de fleste metazoans 24. I modsætning hertil viste somatiske blastomere ablation eksperimenter, P. hawaiensis embryoner også besidder betydelige lovgivningsmæssige kapaciteter, således at skæbner mesoderm eller ectoderm precursor blastomererne ablated på otte-celle stadiet kan overtages af efterkommere af nogle af de resterende blastomeres 25. Hvor regulative celle skæbne udskiftning kan forekomme, og omfanget af autonome celle skæbne vedtagelse somatiske blastomeres, er fortsat ukendt. Eksperimentelle embryologiske teknikker såsom blastomer ablation kan være nyttige i understanding relative autonomi og nonautonomy celle skæbne beslutninger 26,27 og er derfor af interesse for studiet af P. hawaiensis embryogenese.
I forsøgene, der demonstrerede regulative udskiftning af ektodermal og mesodermale slægter blev blastomere ablation udføres ved injektion 28 og efterfølgende excitation af fototoksiske farvestoffer 25. Mens denne teknik er effektiv til at dræbe den injicerede blastomer (r), er det ikke helt fjerne døde celler kroppen fra embryoet. Desuden er der observeret forskelle mellem celleafstamning data indsamlet igennem til gastrulation faser af embryogenese ved at indsprøjte blastomeres med fluorescerende afstamning sporstoffer 28,29, og data indsamlet ved at følge uforstyrrede blastomeres gennem udvikling af de samme fosterstadiet 23. Fuldstændig fysisk fjernelse af specifikke blastomeres kan derfor være en foretrukken metode til ablation til nogle anvendelser.
Vi har tidligere offentliggjort resultaterne af celleafstamning analyser af embryoner, som enkeltceller blev manuelt ablated 23. Men de delikate operationer, der er nødvendige for at fjerne enkelte blastomeres fra tidlig spaltningsprodukter embryoer er endnu ikke fuldt ud beskrevet. Her præsenterer vi en protokol for indsamling af P. hawaiensis embryoner og manuel fjernelse af en enkelt blastomer fra en otte-celle embryo. Målet med denne metode er at opnå en fuldstændig fjernelse af cellen kroppen fra embryonet, tillader observation af de cellulære adfærd og celleskæbnen kompetencer de resterende celler under embryogenese og post-embryonale udvikling. Vores protokol viser fjernelse af kønsceller precursor g (figur 2C), men kan anvendes til en celle på otte-celle stadiet eller blastomeres af tidligere spaltningsprodukter etaper. I princippet kunne denne protokol anvendes til at fjerne enkelte celler fra tidlig spaltning stadie embryoner af other holoblastically kløve marine hvirvelløse dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kommentarer, der kan være nyttige i udførelsen bestemte trin er angivet i kursiv.
1.. Dag 1: Fremstilling af Materialer
- Forbered følgende materialer (se tabel af materialer og udstyr):
- 15 cm og 22 cm Pasteur-pipetter
- Diamond skriftklog
- filtreret kunstigt havvand (saltholdighed mellem 0,0018-0,0020) indeholdende 1 mg / ml Amphotericin B (1:100 af en 100 mg / ml stamopløsning), 100 enheder / ml penicillin og 100 mg / ml streptomycin (1:50 af en stamopløsning indeholdende 5.000 enheder / ml penicillin og 5.000 mg / ml streptomycin)
- filtreret kunstig havvand (saltholdighed mellem 0,0018 til 0,0020) uden tilsætningsstoffer
- en stor plastbeholder til boliger par (mindst 15 cm x 15 cm x 5 cm)
- små (3 cm eller 5 cm) petriskåle foret med Sylgard
- små (3 cm eller 5 cm) petriskåle
- et urglas eller glas multi-brønds plade
- pincet (vi bruger stumpe pincet afledt from gamle Dumont # 5 pincet, der blev beskadiget ved ulykke i andre laboratorie-procedurer, som vi har repurposed ved hjælp af en pincet Slibesten til at sikre, at enderne af tangen er glatte, at begge tænder er den samme længde, og at de ikke længere har skarpe punkter. Ekstremt fine tænger, såsom nye Dumont # 5 pincet, er uønskede, da de kan skade fostre og / eller hundyr.)
- en Pasteur-pipette med enden udvidet (se trin 1.2)
- et foster hentning værktøj består af en tynd, buet wolfram indlejret i den tynde ende af en Pasteur-pipette (kan erstattes af et alternativt redskab, se 1.3 nedenfor)
- en mund pipette med en lille åbning (se trin 1.4)
- et glas nål lavet af en trukket glas kapillar (se trin 1.5 nedenfor)
- For at gøre det udvidede Pasteur-pipette, første score omkring 15 cm Pasteur-pipette på det punkt, hvor pipetten begynder at indsnævre med en diamant skriftklog, pak scorede region af pipetten i en Kimwipe eller køkkenrulle til at beskytte fingrene, og derefter forsigtigt brække spidsen ved delekærv. Hold brudt ende af pipetten over en bunsenbrænder flamme i nogle sekunder til at udjævne kanter. Åbningen skal være lidt smallere end den maksimale bredde af pipetten.
- For at gøre det wolfram tråd dissektionsinstrument indsætte en wolfram tråd i enden af en 15 cm glas Pasteur pipette og kortvarigt over en bunsenbrænder flamme holde til at smelte glas, fastsættelse af wiren på plads. Pincet til forsigtigt kurve enden af wiren i en kroget form. Se figur 3 for et eksempel på en passende form til dette værktøj.
- For at gøre en lille åbning til munden pipette, træk den tynde ende af en 22 cm Pasteurpipette i to dele ovis en flamme, og brække spidsen af den lille ende. Sæt ind i enden af munden pipette holderen.
- Gør glasset nål, der vil blive anvendt til at punktere blastomererne af interesse under ablationsproceduren hjælp af en nål aftrækker. En passende udformet kanyle er vist i fig. 4. Denne nål blev trukket på en Sutter P97 nål aftrækker ved hjælp af et program med parametre 2x (varme = 566, træk = 100, hastighed = 20, tid = 250) + 1X (varme = 566, træk = 100, hastighed = 100, tid = 250). Det specifikke program og instrument, der anvendes til at gøre nålen kan variere, men nålen skal have et fint punkt, men også være robust nok til ikke at knække, når skubbes mod chorion af embryoet.
2. Dag 1: Gathering Parhyale Parring Par
- Brug det udvidede Pasteur pipette (trin 1.2) til at indsamle parring P. hawaiensis par fra den store kultur container, og overføre dem til en separat beholder, der indeholder clæne kunstigt havvand. Det er ikke nødvendigt, at denne havvand skal filtreres. Det er bedst at samle parring par i senere på eftermiddagen og lade de par ved stuetemperatur (20-23 º C) natten over, så den næste morgen, de fleste embryoner er for nylig blevet befrugtet og deponeres, og dermed på tidlig spaltning stadier egnet til ablation. Saml mindst 20 parring par for at sikre, at nogle hunner vil gennemføre tidlige spaltningsprodukter embryoer ved den følgende morgen.
3. Dag 2: Gathering Parhyale Embryoner
- Den næste morgen, indgyde filtreret kunstigt havvand (FASW) med CO 2. Nogle af hunnerne vil have svømmet fri fra deres mænd i løbet af natten, samle disse adskilte hunner og bedøver dem i FASW / CO 2. De resterende uparrede hanner kan fjernes fra den samvirkende par beholderen og returneres til den store kultur. Resterende parring par kan gemmes for embryonindsamlingsteam senerei dag eller den næste dag.
- Overfør en enkelt bedøvede kvindelige transporterer embryoner til et urglas i FASW / CO 2. Alle adskilte hunner vil sandsynligvis har deponeret æg, der vil være synlig med det blotte øje som bleg pink eller lilla spheroids gennem de gennemsigtige coxal plader af hunnerne (Figur 1A). At afgøre, om fostrene er i de tidlige stadier spaltningsprodukter og dermed egnet til blastomere ablation, vil forskeren nødt til at flytte embryoner fra yngel pose og undersøge dem under et mikroskop.
- Visning af procedure under et dissektionsmikroskop, gribe de coxal plader langs den ene side af kroppen med en pincet. Embryoner vil være synlig i den ventrale yngel posen mellem disse coxal plader (figur 1B).
- Sæt den tynde, krumme ledning værktøj (figur 3, trin 1.3) i den bageste ende af yngel posen og forsigtigt løfte tråden hen imod den forreste ende af yngel posen at adskille yngelpose belægninger (disse er ændret ventrale vedhæng kaldet oostegites 30), åbne posen og løsne embryoner. Fostre, der er inden for den første time eller så for at blive lagt alle indkapslet i en meget tynd, gennemsigtig membran, der vil nemt blive forstyrret af wiren redskab, denne membran forsvinder med ca 2-3 timer efter æglægning, og embryoner ikke er bundet til hinanden eller til den kvindelige på nogen måde fra dette punkt og fremefter hele embryogenese. Hvis forskerne finder det besværligt eller vanskeligt at manøvrere den bøjede tråd værktøj til at fjerne fostre fra yngel pose, et alternativt redskab kan anvendes, så længe bevægelserne er blide og ingen hårde tryk påføres embryonerne eller yngel pose. Andre værktøjer er egnede til at fjerne fostre fra yngel pose omfatter stumpe pincet eller et glas kapillar med en forseglet og glattede ende.
- Brug en uændret 15 cm Pasteur pipette til at skylle vand gennem den åbnede yngel pose, skubber ud than embryoner, som skal afregne til bunden af urglas. Overfør den kvindelige at rense FASW (uden CO 2) for at tillade genvinding før genindføre hende til de vigtigste kultur. Flere hunner kan placeres i samme opsving skålen, men tillade kvinder at komme sig helt før returnere dem til de vigtigste kultur, da de kan blive spist af andre dyr, hvis de stadig er delvist bedøvet.
- Brug en uændret 15 cm Pasteur pipette til at overføre embryoner til en petriskål med rent FASW, og se under mikroskop for at bestemme deres fosterstadiet. Separate embryoner, der er på den tredje spaltning (fase 4, 5), som er egnet til denne procedure. Det bør også være muligt at anvende denne protokol til ethvert spaltning stadie før kim disc dannelse (stages 07-08 Maj).
4.. Dag 2: ablating enkelte celler
- Fyld Sylgard-foret petriskål med en lavvandet lag FASW. Brug en uændret 15 cm Pasteur piPette at overføre en enkelt embryo på pladen.
- Ved stump pincet, blidt roll embryonet at identificere den celle, der skal poleres (figur 2A og 2B). Kønscellerne forløber g kan identificeres som den mindste micromere, der sidder på toppen af de mindste macromere Mav. Desuden vises g ikke direkte kontakte den celle en, som er micromere direkte på tværs fra det, som mesoderm precursor micromeres ml og mr deler en celle kant i midten af embryoet. Mr er blastomer til højre for g og ml er micromere til venstre for gram. Søster macromeres af mr, ml, og da er ectoderm forstadier ER, El og EP hhv.
- Med en pincet i left side, hvis forskeren er højrehåndet (eller i den højre hånd, hvis forskeren venstrehåndet), orientere foster med cellen af interesse til højre (eller til venstre, hvis forskeren venstrehåndet), og Klem forsigtigt embryo mellem pincet til at stabilisere den.
- Ved hjælp af en trukket glas nål (trin 1.5 ovenfor figur 4), forsigtigt punktere cellen af interesse. Indsæt ikke nålen for langt, så for ikke at presse nålen ind i cellerne nabolande eller under cellen af interesse. Nålen har kun at punktere chorion og underliggende cellemembranen, og behøver ikke at strække sig dybt ind i cellen, der skal poleres.
- Udskift nålen bruges til at punktere foster for glas slutningen af en mund pipette med en fin trukket Pasteur pipette spids (trin 1.4 ovenfor). Hold spidsen af pipetten tæt på hullet skabt i cellen af interesse, og anvende meget mild sugning.
- Meget forsigtigt klemme embryonet med pincet. Da indholdet af blastoMere er skubbet ud af chorion gennem hullet oprettet i trin 4.4, suge det ind i munden pipette til at tillade en uhindret udsigt af embryoet. Hvis hullet er stort nok, kan kernen af det punkterede celle ses at dukke op som godt. Det er en god kontrol for at sikre, at hele cellens indhold er blevet fjernet og kan ikke regenereres.
- Observere forsigtigt foster som blastomere af interesse er fjernet. Grænsen af det punkterede celle vil trække sig tilbage mod hullet i chorion, hvilket i krydsene med de underliggende celler synlige. Fortsæt med at anvende pres, indtil alle blastomere af interesse er blevet fjernet. Brug pincet til at rulle embryonet fra side til side og visuelt bekræfte, at alle de blastomere af interesse er væk.
- Ved hjælp af en uforandret 15 cm Pasteur pipette embryonet at rense FASW + (FASW + 1 mg / ml amphotericin B, 100 enheder / ml penicillin og 100 mg / ml streptomycin).
- Hæv blastomere-ablated embryoner i de enkelte brøndeaf en ren 48-brønds plade i FASW +, ændre 50% af antibiotika-suppleret FASW + dagligt. I vores hænder embryoner overleve og udvikle godt, selv efter ablation, ved en række temperaturer 18-28 ° C. Forskerne bør hæve deres fostre ved en temperatur, som de har en ren (men ikke nødvendigvis steril) overflade at hæve fostre med minimal forstyrrelse. At være i stand til at sammenligne timingen af udviklingsmæssige begivenheder i blastomere-ablated fostre med kontroller, vi henvise læseren til den detaljerede udviklingsmæssige iscenesættelse information, der er tilgængelig for embryoner rejst ved 18 º C 4, 25 º C 4 og 26 º C 5,6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter en vellykket ablation enkelt tredje spaltning P. hawaiensis micromeres som beskrevet i denne protokol, de resterende micromeres gradvist skifte deres holdninger lidt, således at delvis optager pladsen tidligere besat af ablateret blastomere. For eksempel, når g er fjernet, den nærliggende blastomeres hr. og ml forskydes en smule og kommer til at dele de laterale cellekanter, der tidligere var i direkte kontakt med g (sammenlign figur 2A og 2C). Efter en vellykket ablation kan de resterende blastomeres vise en lille forsinkelse (af mindre end en time) før ind fjerde spaltning, men de bør derefter genoptage de samme spaltningsprodukter mønstre og timing, at de ville have vist i umanipulerede embryoner i det mindste ved at gastrulation iscenesætter 23. . Efter fjernelse af en af de fire micromeres, efterkommere af den resterende blastomeres bør også udvise normal kavalergang timing og cellulære adfærd, herunder dannelsen af en karakteristisk cellulær arrangement betegnet som "roset", og indledningen af gastrulation bevægelser 23. Andelen af embryoner, der overlever ablationsproceduren og komplet embryogenese igennem til klækning kan i første omgang være i størrelsesordenen på omkring 10% for en forsker nye til den teknik, men med erfaring skal i gennemsnit omkring 50%, og kan være så høj som 75% med praksis og årvågen pleje af embryoner efter blastomere ablation. Tabel 1 viser eksempler på antallet af embryoner ablated og overlevelsesrater for en række successive ablation eksperimenter udført af samme forsker, der viste, at overlevelse satser er generelt mindst 80% for de første par dage efter ablation, og at overlevelsesraten igennem til klækningen stigning med stigende oplevelse af forskeren.
Ufuldstændig blastomere fjernelse vil væredokumenteret ved at se resterne af den blastomere der skulle have været ablated, der kan omfatte membran komponenter, cytoplasma eller æggeblomme granulat, stadig ligger inden chorion af embryoet. En forsinkelse i fjerde spaltning af mere end to timer, eller uregelmæssige spaltningsmønstrene eller cellulære adfærd af efterkommere af de resterende blastomeres, kunne også indikere mislykket ablation. Disse fænomener kan være resultatet af skader på andre blastomererne under ablationsproceduren. Hvis der er andre end den ene målrettet til ablation display morfologiske abnormiteter eller smuldre, så igen skader blastomeres sandsynligvis er blevet forvoldt på andre blastomererne under ablationsproceduren.
Hvis celle skæbne markører er til rådighed til at mærke de efterkommere af specifikke tredje spaltningsprodukter blastomeres hvis skæbner er ikke underlagt regulative erstatning, kan fås så yderligere bekræftelse af vellykkede ablation ved mærkning af genmanipulerede embryoner med disse markører Follofløj ablation. Markører for nogle mesodermale og ektodermal territorier er blevet beskrevet på midten til sene stadier af embryogenese 8,14,15. Men da begge disse kimlag kan undergå regulative erstatning ved tab af en af deres grundlægger blastomeres 25, disse markører kan ikke entydigt afgøre, om blastomere eller ikke ablation var vellykket. I tilfælde af kønsceller forløber g, er alle dens efterkommere præget af ekspression af vasa udskrift 12 og protein 4 hele embryogenese, og embryoner, hvor g er ablated mangel kønsceller mindst frem til begyndelsen af kim band iscenesætter 4.. Vellykket ablation g kan således bekræftes ved at undersøge vasa ekspression efter ablation i senere stadier af embryogenese (figur 5).
th = "5in" fo: src = "/ files/ftp_upload/51073/51073fig1highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/51073/51073fig1.jpg" />
Figur 1. Voksen Parhyale hawaiensis kvindelige og embryoner. (A) Lateral billede af en voksen kvinde P. hawaiensis, viser coxal plader (pile), thorax vedhæng (pilespidser) og embryoner synlige som lyserøde eller lilla spheroids gennem den transparente coxal plader (blå prikket omrids). Anterior er til venstre. (B) Ventrale billede af en voksen kvinde P. hawaiensis viser embryoner synlige i yngel pose (blå stiplet omrids). Anterior er til venstre. (C) Embryoner frigivet fra yngel pose udvikle sig normalt i FASW. En række af faser, der spænder fra S1 gennem klækning er vist, trinvis ifølge Browne et al 5 Scale bar = 1 mm (A) og (B). 500 um i (C).51073/51073fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Otte celle embryoer af P. hawaiensis. (A) Levende otte-celle (stadium S4 5) umanipulerede embryo, bestående af fire micromeres (mindre celler) og fire macromeres (større celler). (B) Skematisk af en otte-celle stadie embryo viser celle skæbne betegnelser for alle blastomeres i en vildtype foster som afsløret ved afstamning sporing baseret på fluorescerende 6 markører. (C) Levende S4 stadie foster, der har haft g blastomere fjernes ved hjælp af den nuværende protokol. Den kredsede region viser region tidligere besat af g blastomere; denresterende micromeres har flyttet position lidt som følge af ablation af g.. Skala bar = 250 um i (A) og (C). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Wire værktøj, der anvendes til fjernelse af embryoner fra yngel posen. Værktøjet vist her blev fremstillet ved indsætning af en wolframtråd i den smalle ende af en Pasteur-pipette og forsigtigt smelter glasset til at forsegle tråden på plads, så ved hjælp af pincet til at indføre en blød kurve i kablet. Andre værktøjer er egnede til at fjerne fostre fra yngel pose omfatter stumpe pincet eller et glas kapillar med en forseglet og glattede ende. Scale bar = 1 cm.
Figur 4.. Glas kanyle, der bruges til at punktere blastomererne under ablationsproceduren. Vist her nål blev trukket på en Sutter P97 nål aftrækker ved hjælp af et program med parametre 2 x (varme = 566, træk = 100,-hastighed = 20 tid = 250) + 1 x (varme = 566, træk = 100, hastighed = 100, tid = 250). Andre instrumenter eller programmer kan anvendes til at trække nåle egnede til ablation, så længe de er af den samme generelle form som vist her. Scale bar = 1 cm.
Figur 5. At vurdere resultaterne af blastomere enblation under embryogenese. (A) Gonade region i en vildtype scene S29 embryo kort før klækning, viser kønsceller mærket med anti-Vasa immunfarvning (pilespidser). Den anti-Vasa antistof bruges her er specifikke for P. hawaiensis Vasa (Linsler, Alwes og Extavour, upublicerede data). (B) Gonade region på en scene S29 foster, der havde g blastomere fjernes ved otte-celle stadiet, viser mangel på kønsceller, som afsløret ved fravær af specifikke anti-Vasa signal i gonade-regionen (pilespidser). Målestokken i (A) = 100 um og gælder også for (B). Klik her for at se en større version af dette tal.
| Fjernelse runde | # Ablaterede | # (%) Overlevettil 50% udvikling | # (%) Overlevet til 90-100% udvikling |
| 1 | 49 | 41 (83,7) | 6 (12.2) |
| 2 | 48 | 46 (95,8) | 17 (35,4) |
| 3 | 31 | 25 (80,6) | 22 (71,0) |
| 4. | 97 | 72 (74,2) | 56 (57,7) |
| 5. | 108 | 100 (92,6) | 65 (60,2) |
| 6 | 50 | 36 (72,0) | 37 (74,0) |
| TOTAL | 383 | 320 (83,6) | 203 (53,0) |
Tabel 1. Repræsentant ablation overlevelsestatistik. Efter micromere ablation blev overlevelse scorede både inden for de første 50% af udvikling (5-6 dage ved 25 º C) og derefter på 90-100% udvikling (10-12 dage ved 25 º C). Fjernelse runder 1-6 er repræsentative eksempler på eksperimenter udført af en enkelt forsker (AR Nast) i kronologisk rækkefølge i løbet af en otte måneders periode. Forskerne bør finde, som vist her, overlevelsesrater til 90-100% stigning udvikling med erfaring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en protokol for manuel ablation og fuldstændig fysisk fjernelse af enlige blastomeres fra tidlige spaltningsprodukter stadier af amphipoden P. hawaiensis. Vi demonstrere brugen af denne protokol ved at fjerne enkelt kønsceller precursorcelle g fra en otte-celle stadie embryo, og vise, at ablation har været en succes ved at bekræfte fravær af G 's datter celler i senere embryogenese. Denne protokol kan anvendes til at fjerne nogen af micromeres fra embryonet på tidlige spaltningsprodukter faser. For at bruge denne protokol til at fjerne macromeres på dette tidspunkt, eller blastomeres på første eller anden spaltningsprodukter etaper, kan brugerne blot anvende de mindre ændringer for at skabe en lidt større hul i chorion ved trin 4.4 og anvende pres og sug i længere tid at fjerne større volumen af celleindhold i trin 4.6. Vi har fundet, at efter brug af denne protokol, udvikling af de resterende blastomeres efter ablation er unpåvirket med hensyn til spaltning og celle bevægelsesmønstre mindst igennem til tidspunktet for gastrulation 23.
Denne protokol kan være nyttige for en fortsat efterforskning af udviklingspotentiale tidlige spaltnings blastomeres i denne amphipoden. Mange spørgsmål mangler at blive besvaret på dette område, herunder hvorfor nogle celler, men ikke andre kan ændre skæbner til at erstatte dem af ablated blastomererne, og den præcise timing og mekanismer af disse regulerende ændringer. Protokollen kan også modificeres til at rumme fjernelse af mere end én celle, ved simpelthen at gentage trin 4,2-4,7 successivt på blastomererne af interesse.
Det er vigtigt at bruge en høj kvalitet stereomikroskop med egnet belysning for at kunne se og korrekt kan identificere de tidlige spaltningsprodukter blastomeres. Vi finder, at lateral indfaldende hvidt lys fra en fiberoptisk kold lyskilde er den mest nyttige til dette formål. Indfaldende lys direkte over specimDA skaber refleksioner, der kan skjule det cellulære morfologi og grænser, mens transmitteret lys ikke trænge igennem den tætte blommen af embryoner og blastomeres er derfor svære at skelne. Det er mest nyttigt for uret glas eller petriskål indeholdende embryoner, der skal placeres på en sort overflade snarere end en hvid eller transparent glas overflade, da dette giver den bedste kontrast til de blege embryoner.
En begrænsning af denne protokol er, at blastomere af interesse skal være korrekt og entydigt kan identificeres, før du begynder proceduren. Fotoablatio teknikker ville være mere nyttigt for forskere nye til systemet, da embryonerne kan overlades til at udvikle nogle få spaltningsprodukter cyklusser efter injektion af det fluorescerende farvestof 28, og identiteten af den injicerede blastomere bekræftet efter injektion, men før fotoablatio, ved at analysere mønstrene for de cellulære efterkommere, som er blevet godt beskrevet i tidligere celleliniealder analyser 6,23. Når forskerne er bekendt med P. hawaiensis foster og kan identificere alle blastomeres med tillid, kan den manuelle ablation beskrevet her anvendes til applikationer, hvor fuldstændig fysisk fjernelse af en blastomere, snarere end at dræbe cellen uden at fjerne de døde celler kroppen fra embryonet, er ønskelig.
Denne procedure kan i princippet anvendes til at fjerne enkelte blastomeres fra spaltning fase embryoner af andre holoblastically kløvning krebsdyr eller andre marine eller ferskvandsinvertebrater hvis chorions eller befrugtning membraner ikke let kan fjernes. Ændringer kan omfatte hjælp inkubationsmedierne med passende saltholdighed egenskaber og ændre formen af nålen til at rumme mere sarte membraner (længere, tyndere nåle) eller mere robuste embryonale belægninger (kortere, hurtigt tilspidsede nåle).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Rayhan Arif og Hassaan Shahawy til kamera arbejde, Tripti Gupta og Frederike Alwes for assistance raffinering cellen ablation teknik, og Extavour lab medlemmer for feedback på de data, video og manuskript. Dette arbejde blev delvist støttet af Harvard Stem Cell Institute (Seed Grant nummer SG-0057-10-00) Ellison Medical Foundation (New Scholar Award nummer AG-NS-07.010-10) til CGE, og Harvard College Research Program awards til ARN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 cm Pasteur pipette | Wheaton | 53499-630 VWR | For transferring intact and blastomere-ablated embryos from dish to dish. |
| 22 cm Pasteur pipette | Wheaton | 53499-632 VWR | For making mouth pipette tips. |
| 3 cm Petri dishes | Thermo Scientific | 25382-334 VWR | Use some unaltered to collect and store embryos; coat some with a layer of Sylgard (see below) to create a working surface for blastomere ablations. |
| 48-well Plates | Greiner Bio-One | 82051-004 VWR | For culturing embryos following ablation. |
| Bottle top filters 0.2 µm | Nalge Nunc International | 28199-296 VWR | For creating FASW (See below). |
| Bunsen burner | VWR | 89038-530 VWR | For creating tungsten wire tool and fine tip of mouth pipette. |
| Diamond scribe | Musco Sports Lighting | 52865-005 VWR | For creating wide-mouthed Pasteur pipettes for collecting couples. |
| Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 Fine Science Tools | For holding anaesthetized females during removal of embryos from brood pouch. These do not have to be fine-tipped Dumont forceps - the tips can be at least as blunt as those of the forceps for which the catalogue number is listed here. |
| Fungizone-Amphotericin B | Sigma | A2942 Sigma Aldrich | Add to FASW to a final concentration of 1 mg/ml, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. |
| Glass capillaries 4 in long, 1/0.58 OD/ID (mm) | World Precision Instruments | 1B100-4 World Precision Instruments | For making needles for puncturing the blastomere to be ablated. |
| Glass watchglass 300 mm diameter | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 Electron Microscopy Sciences | For use in removing embryos from the brood pouch of anesthetized females. |
| Instant Ocean Artificial Sea Water (ASW) | Instant Ocean | IS160 Aquatic EcoSystems | Make ASW by dissolving salt in deionized water to a salinity of 1.022-1.024. |
| Instant Ocean Filtered Artificial Sea Water (FASW) | Instant Ocean | IS160 Aquatic EcoSystems | Use 0.2 µm filters to sterilize ASW. Make up in small amounts (< 250 ml) as needed. |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 21905-026 VWR | For safely breaking off the fine end of Pasteur pipettes modified for collecting couples. |
| Mouth pipette adaptor | Drummond Labware | A5177-5EA Sigma Aldrich | Insert the fine pulled Pasteur pipette tip into this end, to be used for removing extruded cell contents during the ablation procedure. |
| Mouth pipette tubing | Aldrich | Z280356 Sigma Aldrich | Cut this to be long enough to comfortably hang around your neck during the ablation procedure. |
| Needle Puller | Sutter Instrument Company | P97 Sutter Instrument Company | For making needles from glass capillaries for puncturing the blastomere to be ablated. |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Mediatech | 45000-650 VWR | Add to FASW to a final concentration of 100 units/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. |
| Rubber bulb | Electron Microscopy Sciences | 100488-418 VWR | For using Pasteur pipettes to transfer embryos from dish to dish. |
| Sylgard 184 | K. R. Anderson, Inc. | NC9659604 Fisher Scientific | Make up according to manufacturer's instructions. Pour a layer 2-5 mm thick into a 3cm petri dish to create a working surface for blastomere ablations. |
| Tungsten wire 0.004 inches diameter | A-M Systems | 719000 A-M Systems | Use this to make a tool for removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. |
References
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H.
- Sander, K. Pattern formation in insect embryogenesis: the evolution of concepts and mechanisms. Int. J.Insect Morphol. Embryol. 25, 349-367 (1997).
- Regier, J. C., et al. Arthropod relationships revealed by phylogenomic analysis of nuclear protein-coding sequences. Nature. 463, 1079-1083 (2010).
- Extavour, C. G. The fate of isolated blastomeres with respect to germ cell formation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis. Dev. Biol. 277, 387-402 (2005).
- Browne, W. E., Price, A. L., Gerberding, M., Patel, N. H. Stages of embryonic development in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis. Genesis. 42, 124-149 (2005).
- Gerberding, M., Browne, W. E., Patel, N. H. Cell lineage analysis of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis reveals an early restriction of cell fates. Development. 129, 5789-5801 (2002).
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. Fixation and dissection of Parhyale hawaiensis embryos. Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).
- Price, A. L., Patel, N. H. Investigating divergent mechanisms of mesoderm development in arthropods: the expression of Ph-twist and Ph-mef2 in Parhyale hawaiensis. J. Exp. B. Dev. Evol. 310, 24-40 (2008).
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. In situ hybridization of labeled RNA probes to fixed Parhyale hawaiensis embryos. Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).
- Browne, W. W., Schmid, B. G. M., Wimmer, E. A., Martindale, M. Q. Expression of otd orthologs in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis. Dev. Genes Evol. 216, 581-595 (2006).
- Prpic, N. M., Telford, M. J. Expression of homothorax and extradenticle mRNA in the legs of the crustacean Parhyale hawaiensis: evidence for a reversal of gene expression regulation in the pancrustacean lineage. Dev. Genes Evol. 218, 333-339 (2008).
- Kizil, G., Havemann, J., Gerberding, M. Germ cells in the crustacean Parhyale hawaiensis depend on Vasa protein for their maintenance but not for their formation. Dev. Biol. 327, 320-239 (2009).
- Liubicich, D. M., et al. Knockdown of Parhyale Ultrabithorax recapitulates evolutionary changes in crustacean appendage morphology. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13892-13896 (2009).
- Pavlopoulos, A., et al. Probing the evolution of appendage specialization by Hox gene misexpression in an emerging model crustacean. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13897-13902 (2009).
- Vargas-Vila, M. A., Hannibal, R. L., Parchem, R. J., Liu, P. Z., Patel, N. H. A prominent requirement for single-minded and the ventral midline in patterning the dorsoventral axis of the crustacean Parhyale hawaiensis. Development. 137, 3469-3476 (2010).
- Simanton, W., et al. Conservation of arthropod midline netrin accumulation revealed with a cross-reactive antibody provides evidence for midline cell homology. Evol. Dev. 11, 260-268 (2009).
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. Antibody staining of Parhyale hawaiensis embryos. Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).
- Pavlopoulos, A., Averof, M. Establishing genetic transformation for comparative developmental studies in the crustacean Parhyale hawaiensis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 7888-7893 (2005).
- Kontarakis, Z., et al. A versatile strategy for gene trapping and trap conversion in emerging model organisms. Development. 138, 2625-2630 (2011).
- Zeng, V., et al. De novo assembly and characterization of a maternal and developmental transcriptome for the emerging model crustacean Parhyale hawaiensis. BMC Genom. 12, 581 (2011).
- Zeng, V., Extavour, C. G. ASGARD: an open-access database of annotated transcriptomes for emerging model arthropod species. Database. , (2012).
- Nestorov, P., Battke, F., Levesque, M. P., Gerberding, M. The Maternal Transcriptome of the Crustacean Parhyale hawaiensis Is Inherited Asymmetrically to Invariant Cell Lineages of the Ectoderm and Mesoderm. PLoS ONE. 8, (2013).
- Alwes, F., Hinchen, B., Extavour, C. G. Patterns of cell lineage, movement, and migration from germ layer specification to gastrulation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis. Dev. Biol. 139, 110-123 (2011).
- Ewen-Campen, B., Schwager, E. E., Extavour, C. G. The molecular machinery of germ line specification. Mol. Reprod. Dev. 77, 3-18 (2010).
- Price, A. L., Modrell, M. S., Hannibal, R. L., Patel, N. H. Mesoderm and ectoderm lineages in the crustacean Parhyale hawaiensis display intra-germ layer compensation. Dev. Biol. 341, 256-266 (2010).
- Fraser, S. E., Harland, R. M. The molecular metamorphosis of experimental embryology. Cell. 100, 41-55 (2000).
- Olsson, L. A clash of traditions: the history of comparative and experimental embryology in Sweden as exemplified by the research of Gösta Jägersten and Sven Hörstadius. Theory Biosci. 126, 117-129 (2007).
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. Injection of Parhyale hawaiensis blastomeres with fluorescently labeled tracers. Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).
- Chaw, R., Patel, N. H. Independent migration of cell populations in the early gastrulation of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis. Dev. Biol. 371, 94-109 (2012).
- Schmitz, E. H. Crustacea Microscopic Anatomy of Invertebrates. Microscopic Anatomy of Invertebrates. Harrison, F. W. 9, Wiley-Liss, Inc.. 443-528 (1992).
