Summary
Der Floh Parhyale hawaiensis ist eine vielversprechende Modellorganismus für die Untersuchung der Krustentier Embryologie und vergleichende Arthropoden Entwicklung und Evolution. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für die manuelle Entfernung der einzelnen Blastomeren aus frühen Embryonen im Teilungsstadium von Parhyale.
Abstract
Der Floh Parhyale hawaiensis ist ein kleines Krustentier in Gezeiten marine Lebensräume weltweit gefunden. In den vergangenen zehn Jahren hat sich Parhyale als eine vielversprechende Modellorganismus für Laboruntersuchungen von Entwicklung entstanden, ein nützliches Fremdgruppe Vergleich zur bekannten Gliederfüßer Modellorganismus Drosophila melanogaster. Im Gegensatz zu den Syncytial-Spaltungen von Drosophila, sind die frühen Spaltungen von Parhyale holoblastisch. Fate Mapping mit Tracer-Farbstoffe in frühen Blastomeren injiziert haben gezeigt, dass alle drei Keimblätter und der Keimbahn werden von der Acht-Zell-Stadium etabliert. Zu diesem Zeitpunkt werden drei Blastomeren beschieden, die zu dem Ektoderm geben, drei sind dazu bestimmt, um die zu dem Mesoderm zu geben, und die verbleibenden zwei Blastomeren sind die Vorstufen von Endoderm und Keimbahn sind. Allerdings haben Blastomere Ablation Experimente gezeigt, dass Embryonen Parhyale signifikanten regulatorischen capabiliti besitzen auches ist, so dass die Schicksale der Blastomeren im Acht-Zell-Stadium abgetragen kann über von den Nachkommen der einige der verbleibenden Blastomeren entnommen werden. Injektion und die anschließende Aktivierung von phototoxischen Farbstoffe oder manuelle Abtragen: Blastomere Ablation wurde zuvor von einem von zwei Verfahren beschrieben worden. , Tötet jedoch photoablation Blastomeren jedoch nicht die toten Zellkörper aus dem Embryo zu entfernen. Vollständige physische Entfernung spezifischer Blastomeren kann daher ein bevorzugtes Verfahren zur Ablation für einige Anwendungen. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die manuelle Entfernung von einzelnen Blastomeren aus dem Acht-Zell-Stadium des Embryos Parhyale, veranschaulicht, die Instrumente und manuellen Verfahren, die für die vollständige Entfernung der Zellkörper, während die übrigen Blastomeren lebendig und intakt. Das Protokoll kann auf jeden Parhyale Zelle im Achtzellstadium oder Blastomeren von anderen frühen Teilungsstadien angewendet werden. Darüber hinaus grundsätzlich Dieses Protokoll könnte für frühe Clea seinvage Embryonen anderer holoblastically Spaltung wirbellose Meerestiere.
Introduction
Der Flohkrebstier Parhyale hawaiensis hat sich in den letzten zehn Jahren als vielversprechende Modellorganismus mit großem Potenzial für den Einsatz in der evolutionären Entwicklungsbiologie Forschungs 1 entstanden. Unter den Arthropoden, die meisten Modellsysteme sind Insekten, und die meisten von ihnen ausgiebig studiert ist die Taufliege Drosophila melanogaster. D. melanogaster ist ein Mitglied der Insektenordnung Diptera, und als solche zeigt viele embryologische Funktionen, die mit Bezug auf diejenigen der basal Verzweigungs 2 Insekten abgeleitet sind. Darüber hinaus werden Insekten in der Unterabteilung Pancrustacea 3 verschachtelt, was bedeutet, dass Insekten haben ihre nächsten Verwandten in der langjährigen "natürliche" Gruppe namens pancrustaceans, und dass diese Gruppe paraphyletic. Dies deutet darauf hin, dass zusätzlich zu basal abzweigInsekten Modelle werden Studien von anderen Krebstieren erforderlich, um eine umfassendere Sicht der Evolutionsgeschichte der Entwicklungsmerkmale gewinnen einnd molekularen Mechanismen, die so gut in D. untersucht worden sind melanogaster. Aber nur sehr wenige Krebstiere sind gut für experimentelle Laboranalyse der Entwicklung etabliert. Der Floh P. hawaiensis ist ein sehr gefügig Labor Modellsystem zugänglich zu einer Reihe von experimentellen Techniken. Amphipoden zeigen viele einzigartige Features in ihre Mutter Peracarida Überordnung (Strand Trichter, Scud-Raketen, und auch Garnelen) und werden daher vermutlich relativ innerhalb dieser Gruppe von Krebstieren abgeleitet werden. Dennoch ist die relative Leichtigkeit der embryologischen und funktionellen genetischen Manipulation von Parhyale angeboten machen dieses Floh eine wertvolle Ergänzung zu den aktuellen Bestand von Modellorganismen.
Als Labortier, P. hawaiensis bietet viele Vorteile. Tiere sind tolerant zu einem breiten Spektrum von Temperaturen und Salzgehalte und gut überleben in großen Kulturen von künstlichem Meerwasser ein. Es ist leicht zu unterscheiden zw.een Männer und Frauen, die auf klaren morphologischen Unterschiede, vor allem, die großen, gehakt, Vorderrumpf Anhänge, die zu verwenden, um die Weibchen während der Paarung zu erfassen Männchen. Für embryologische und Entwicklungsarbeit, P. hawaiensis hat mehrere sehr ansprechende Features. Embryogenese dauert etwa 10 Tage und die Zeit bis zur Geschlechtsreife ist etwa sechs Wochen bei 28 º C (aber beachten Sie, dass Parhyale überlebt auch bei Temperaturen von ca. 20-30 ° C, und eine ausführliche Entwicklungs Inszenierung Informationen für Embryonen bei 18 º C 4 angehoben verfügbar , 25 ° C 4 und 26 º C 5,6). Erwachsene passen das ganze Jahr über im Labor, so dass Embryonen sind zu jeder Zeit des Jahres zur Verfügung. Die Weibchen legen 2-20 (je nach dem Alter der Frau) befruchteten Eier in eine Bruttasche ventralen zwischen der ersten mehrere Paar Beine (1A und 1B) gelegen, und es ist möglich, diese zu sammeln Embryos sehr früh in der Entwicklung, ohne die weibliche Töten oder Beschädigung der Embryonen (Abbildung 1C). Die Embryonen überleben in künstlichem Meerwasser gefiltert bis zum Schlüpfen können für nachfolgende Genexpression oder histologische Analyse 7 festgelegt werden, und eine detaillierte Testtabelle ermöglicht eine genaue Identifikation der Fortschritt durch Entwicklung 5. Robust Protokolle wurden zur Genexpressionsanalyse durch in situ Hybridisierung 8-15 oder Immunfärbung 4,16,17 durchzuführen, funktionelle Knockdown durch RNA-Interferenz oder 13,15 morpholinos 12, und stabile Keimbahntransgenese 18. Verwendung der Transgenese System induzierbaren Expressionsverstärker 14 und 19 abzufangen Methoden können auch verwendet werden, um die Genfunktion in P. untersuchen hawaiensis. Während ein öffentlich verfügbaren Genomsequenz ist derzeit nicht verfügbar ist, enthält eine Transkriptom-Transkripte während der Oogenese und Embryogenese hergestellte Bienenn de novo und kommentierte 20 und in einer durchsuchbaren Datenbank hinterlegt 21, die Erleichterung Gen Entdeckung. Insgesamt P. hawaiensis ist ein sehr gefügig Modellorganismus geeignet für mehrere experimentelle und genetische Ansätze zum Verständnis der Entwicklung.
Im Gegensatz zu den frühen Syncytial-Spaltungen von D. melanogaster, P. hawaiensis Embryonen spalten holoblastically nach der Befruchtung (Abbildung 2A). Lineage Tracing Analyse hat gezeigt, dass durch die dritte Schnittstelle, wobei jede der dritten Spaltungs Blastomeren ist speziell dazu bestimmt, um die zu einem der drei Keimblätter oder die Keimbahn 6 (Fig. 2B) erhalten wurde. Diese Daten, zusammen mit Microarray-Daten 22, Zelllinie analysiert 6,23 und 4 Blastomere Isolationsexperimente haben vorgeschlagen, dass Entwicklungspotentiale sind getrennt, zumindest einigen Dritt Spaltung Blastomeren durch asymmetrische Vererbung von cell Schicksal Determinanten. Dementsprechend wird in Blastomere Ablation Experimenten, bei denen die Keimbahn-Vorstufe (im Parhyale Zelllinie 6 Nomenklatur als "g") wurde bei der acht Zellen-Stadium entfernt fehlte Embryonen Keimzellen in späteren Entwicklungsstadien 4, wie durch die Abwesenheit von Zellen angegeben Expression des Proteins Vasa, die eine Keimbahnmarkierung in den meisten Metazoen 24 ist. Im Gegensatz dazu zeigten die somatische Blastomere Ablation Experimente, dass P. hawaiensis Embryonen besitzen auch erhebliche regulatorische Fähigkeiten, so dass die Schicksale der Mesoderm oder Ektoderm Vorläufer Blastomeren im Acht-Zell-Stadium abgetragen kann über von den Nachkommen der einige der verbleibenden 25 Blastomeren entnommen werden. Wie regulative Zellschicksal Austausch stattfinden kann, und das Ausmaß der autonomen Zellschicksal Annahme durch somatischen Blastomeren, bleibt unbekannt. Experimentelle embryologische Techniken wie Blastomere Ablation in under nützlich seinding die relative Autonomie und Unselbständigkeit des Zellschicksals 26,27 Entscheidungen und sind daher von Interesse, die in der Studie von P. hawaiensis Embryogenese.
In den Experimenten, die regulative Ersatz von ektodermalen und mesodermalen Linien gezeigt wurde Blastomere Ablation durch Injektion 28 und nachfolgende Anregung der Farbstoffe phototoxische 25 durchgeführt. Während diese Technik effektiv bei der Abtötung der eingespritzten Blastomere (n) ist, ist es nicht völlig den toten Zellkörper aus dem Embryo zu entfernen. Außerdem wurden Unterschiede zwischen Zelllinie Daten bis zur Gastrulation Stufen der Embryogenese durch Injizieren Blastomeren mit fluoreszierenden Tracer Linie 28,29 gesammelt, und Daten, die durch folgende ungestörten Blastomeren durch Entwicklung derselben Embryonalstadien 23 gesammelt beobachtet. Vollständige physische Entfernung spezifischer Blastomeren kann daher ein bevorzugtes Verfahren zur Ablation für einige Anwendungen.
Wir haben vorher veröffentlicht die Ergebnisse der Zelllinie Analysen von Embryonen, in denen einzelne Zellen wurden manuell abgetragen 23. Doch die zarten Operationen erforderlich, um einzelne Blastomeren vom frühen Embryonen im Teilungsstadium zu entfernen noch nicht vollständig beschrieben. Hier ein Protokoll für die Sammlung von P. präsentieren wir hawaiensis Embryonen und manuelle Ablation eines einzelnen Blastomeren aus einem Acht-Zell-Stadium Embryo. Das Ziel dieser Methode ist, um die vollständige Entfernung des Zellkörpers aus dem Embryo zu erreichen, so dass die Beobachtung der Zellverhalten und Zellschicksal Kompetenzen von den übrigen Zellen in der Embryogenese und post Embryonalentwicklung. Unser Protokoll zeigt die Entfernung von der Keimbahn-Vorläufer g (2C), aber kann auf jede beliebige Zelle in der Acht-Zellen-Stadium aufgebracht werden, oder Blastomeren früheren Teilungsstadien. Im Prinzip könnte dieses Protokoll angewandt, um einzelne Zellen aus frühen Embryonen im Teilungsstadium von othe entfernenr holoblastically Spaltung wirbellose Meerestiere.
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Protocol
Kommentare, die hilfreich bei der Ausführung bestimmter Schritte sein können, sind in Kursivschrift angegeben.
1. Tag 1: Herstellung von Materialien
- Bereiten Sie die folgenden Materialien (siehe Tabelle der Materialien und Geräte):
- 15 cm und 22 cm Pasteur Pipetten
- Diamant-Schreiber
- gefiltert künstlichem Meerwasser (Salzgehalt zwischen 0,0018 bis 0,0020), die 1 mg / ml Amphotericin B (1:100 einer 100 mg / ml Stammlösung), 100 Einheiten / ml Penicillin und 100 mg / ml Streptomycin (1:50 einer Stammlösung enthaltend 5.000 Einheiten / ml Penicillin und 5000 mg / ml Streptomycin)
- gefiltert künstlichem Meerwasser (Salzgehalt zwischen 0,0018 bis 0,0020) ohne Zusatzstoffe
- eine große Kunststoffbehälter zur Aufnahme Paare (mindestens 15 cm x 15 cm x 5 cm)
- klein (3 cm oder 5 cm) Petrischalen mit Sylgard gesäumten
- klein (3 cm oder 5 cm) Petrischalen
- ein Uhrglas oder Glas Multi-Well-Platte
- Pinzette (wir verwenden stumpfen Pinzette abgeleitet herm alt Dumont Nr. 5 Zange, die versehentlich in anderen Laborverfahren, die wir unter Verwendung einer Pinzette Schleifstein, um sicherzustellen, daß die Enden der Zange sind glatt, dass beide Zinken haben die gleiche Länge, und daß sie nicht mehr umfunktioniert beschädigt scharfen Spitzen. Extrem feine Pinzetten, wie neue Dumont Nr. 5 Zangen, sind unerwünscht, da diese Embryonen und / oder Frauen zu verletzen.)
- eine Pasteur-Pipette mit dem Ende verbreitert (siehe Schritt 1.2 unten)
- ein Embryo Retrieval-Tool, bestehend aus einer dünnen, gebogenen Wolframdraht in das dünne Ende einer Pasteur-Pipette eingebettet (könnte durch eine Alternative ersetzt implementieren werden, siehe 1.3 unten)
- ein Mund Pipette mit einer kleinen Öffnung (siehe Schritt 1.4 unten)
- ein Glas Nadel aus einer gezogenen Glaskapillare (siehe Schritt 1.5 unten)
- Um die erweiterten Pasteur-Pipette, um einen ersten Punktzahl 15 cm Pasteur-Pipette an der Stelle, wo die Pipette beginnt mit einer Diamant-Schreiber einzugrenzen, wickeln Sie das erzielte Region der Pipette in einer Kimwipe oder Papiertuch, um die Finger zu schützen, und dann sorgfältig machen brechen Sie die Spitze an der Markierungslinie. Halten Sie die gebrochen Ende der Pipette über einem Bunsenbrenner-Flamme für einige Sekunden, um die Kanten zu glätten. Die Öffnung ist etwas schmaler als die maximale Breite der Pipette sein.
- Um die Wolframdraht Dissektionswerkzeug machen, legen Sie eine Wolframdraht in das Ende eines 15-cm-Glaspasteurpipette und kurz halten, über der Flamme eines Bunsenbrenners, um das Glas zu schmelzen, Befestigungs den Draht. Verwenden einer Pinzette vorsichtig Kurve das Ende des Drahtes in eine Hakenform. Abbildung 3 zeigt ein Beispiel für eine geeignete Form für dieses Werkzeug.
- Um eine kleine Öffnung für den Mund Pipette zu machen, ziehen Sie das dünne Ende einer 22 cm Pasteur-Pipette in zwei Teile over eine Flamme, und brechen Sie die Spitze des kleinen Endes. Legen Sie in das Ende des Mundpipettenhalter.
- Machen Sie das Glas Nadel, die verwendet werden, um die Blastomeren der Zinsen während der Ablation mit einer Nadel durchstechen Abzieher wird. A geeignet geformten Nadel ist in Abbildung 4 dargestellt. Diese Nadel wurde auf einem Sutter P97 Nadelzieher mit einem Programm mit Parametern 2x gezogen (Wärme = 566, ziehen = 100, Geschwindigkeit = 20, Zeit = 250) + 1X (Wärme = 566, ziehen = 100, Geschwindigkeit = 100, Zeit = 250). Das spezifische Programm und Instrument benutzt, um die Nadel machen kann variieren, aber die Nadel eine feine Spitze haben, aber auch stabil genug, um nicht zu brechen, wenn sie gegen das Chorion des Embryos geschoben werden.
2. Tag 1: Sammeln Parhyale Gegen Paare
- Verwenden Sie die erweiterten Pasteur-Pipette (Schritt 1.2) zu sammeln Paarung P. hawaiensis Paare von der großen Kultur-Container, und übertragen Sie sie auf einem separaten Behälter, clehnen künstliche Meerwasser. Es ist nicht notwendig, dass diese Meerwasser gefiltert werden. Es ist am besten passenden Paare in den späteren Nachmittag zu sammeln und lassen Sie die Paare bei Raumtemperatur (20-23 ° C) über Nacht, so dass am nächsten Morgen, die meisten Embryonen vor kurzem befruchtet haben und abgeschieden wird, und somit am frühen Teilungsstadien geeignet für Ablation. Sammeln Sie mindestens 20 Gegenpaare, um sicherzustellen, dass einige Weibchen frühen Embryonen im Teilungsstadium tragen bis zum nächsten Morgen.
3. Tag 2: Sammeln Parhyale Embryonen
- Am nächsten Morgen ziehen gefiltert künstlichem Meerwasser (FASW) mit CO 2. Einige der Frauen werden von ihren Männern in der Nacht frei geschwommen haben, sammeln diese getrennt Weibchen und betäuben sie in FASW / CO 2. Die verbleibenden ungepaarten Männchen aus der Paarung Paar Behälter entfernt werden und zu dem großen Kultur. Verbleibende Gegenpaare können für Embryo-Entnahme später gespeichert werdenam Tag oder am nächsten Tag.
- Übertragen einer einzigen weiblichen narkotisierten Durchführung Embryonen zu einem Uhrglas in FASW / CO 2. Alle Weibchen getrennt werden wahrscheinlich haben Eier gelegt, die sichtbar mit dem Auge so blass rosa oder lila Kügelchen durch die transparenten Platten coxal der Weibchen (Abbildung 1A) sein wird. Um festzustellen, ob die Embryonen in frühen Teilungsstadien und damit für Blastomere Ablation erforderlich, wird die Forscher haben, um die Embryonen aus der Bruttasche zu entfernen und untersuchen sie unter dem Mikroskop.
- Anzeigen des Verfahrens unter einem Binokular, erfassen die coxal Platten entlang einer Seite des Körpers mit einer Pinzette. Die Embryonen werden in der ventralen Bruttasche zwischen diesen coxal Platten (1B) sichtbar sein.
- Legen Sie die dünnen, gebogenen Drahtwerkzeug (3; Schritt 1.3) in das hintere Ende der Bruttasche, und heben Sie den Draht zum vorderen Ende der Bruttasche, um die Brut zu trennenBeutel Beläge (diese modifizierten ventralen Anhänge oostegites 30 genannt), das Öffnen der Tasche und Lösen der Embryonen. Die Embryonen, die in der ersten Stunde oder so von der Verlegung sind alle in einem sehr dünnen, transparenten Membran, die leicht durch den Drahtwerkzeug gestört werden wird eingeschlossen sind, verschwindet diese Membran um etwa 2-3 Stunden nach der Eiablage, und Embryonen sind nicht gebunden einander oder mit dem weiblichen in irgendeiner Weise von diesem Punkt an während der Embryogenese. Wenn Forscher finden es unbequem oder schwierig, die gebogenen Drahtwerkzeug manövrieren Embryonen aus der Bruttasche zu entfernen, eine alternative Implementierung verwendet werden, solange die Bewegungen sind sanft und keine harten Druck auf die Embryonen oder der Bruttasche angewendet. Andere Tools zum Entfernen von Embryonen aus der Bruttasche geeignet sind, schließen abgestumpft Zange oder ein Glas-Kapillare mit einem verschlossenen Ende und geglättet.
- Verwenden Sie eine unveränderte 15 cm Pasteur-Pipette, um Wasser durch das geöffnete Bruttasche zu leeren, Ausschieben ter Embryonen, die an der Unterseite des Uhrenglases absetzen sollte. Übertragen Sie die weiblichen zu reinigen FASW (ohne CO 2), um die Wiedereinführung Erholung, bevor sie in die Hauptkultur zu ermöglichen. Mehrere Weibchen können in die gleiche Erholung Schale gelegt werden, aber erlauben Frauen voll, bevor sie dann wieder in die Hauptkultur zu erholen, als sie von anderen Tieren gefressen, wenn sie teilweise noch betäubt werden.
- Verwenden Sie eine unveränderte 15 cm Pasteur-Pipette, um die Embryonen in eine Petrischale mit sauberem FASW übertragen, und zeigen unter dem Mikroskop auf ihre embryonalen Stadium zu bestimmen. Separate Embryonen, die am dritten Spaltung (Stufe 4 5), die für dieses Verfahren geeignet sind. Es sollte auch möglich sein, dieses Protokoll zu jeder Spaltung Stufe vor Keimscheibe Bildung gelten (Stufen 7-8 Mai).
4. Tag 2: Abtragen Einzelzellen
- Füllen Sylgard gesäumten Petrischale mit einer flachen Schicht FASW. Verwenden Sie eine unveränderte 15 cm Pasteur piPette einen einzigen Embryo auf die Platte übertragen.
- Mit stumpfen Pinzette vorsichtig rollen den Embryo in die Zelle, die abgetragen werden (2A und 2B) zu identifizieren. Die Keimbahn g Vorstufe kann als der kleinste micromere, die auf der Oberseite des kleinsten macromere Mav sitzt identifiziert werden. Darüber hinaus wird g nicht direkt an den Zell en, die die von micromere es ist direkt gegenüber, wie die Mesoderm-Vorläufer Mikromeren ml und mr Aktie eine Zelle Grenze in der Mitte des Embryos. Mr ist die Blastomere nach rechts von g, und ml ist die micromere links g. Die Schwester Makromeren der herr, ml, und en sind die Vorläufer Ektoderm Er, El und Ep sind.
- Mit einer Pinzette in der left Seits, wenn sich der Forscher Rechtshänder (oder der rechten Hand, wenn der Forscher Linkshänder), Ausrichten der Embryo mit der interessierenden Zelle nach rechts (oder nach links, wenn sich der Forscher Linkshänder), und leicht zu begreifen, den Embryo zwischen der Zange, um es zu stabilisieren.
- Mit einem Glas Nadel gezogen (Schritt 1.5 oben, Abbildung 4), sanft Punktion der Zelle von Interesse. Sie die Nadel nicht zu weit stecken, damit sie nicht, um die Nadel in die Zellen oder unterhalb der benachbarten Zelle von Interesse zu schieben. Die Nadel muss nur die Chorion und darunterliegenden Zellmembran durchstechen, und muss nicht tief in die Zelle abzutragenden erstrecken.
- Tauschen Sie die Nadel verwendet werden, um den Embryo für die Glas Ende einer Pipette Mund mit einer feinen Punktion gezogen Pasteur-Pipettenspitze (Schritt 1.4). Halten Sie die Spitze der Pipette in der Nähe des Loch in der Zelle von Interesse erstellt und gelten sehr sanfte Saugwirkung.
- Sehr sanft drücken den Embryo mit der Zange. Da der Inhalt des blastonur aus dem Chorion durch das Loch im Schritt 4.4 erstellt geschoben, saugen sie in den Mund Pipette auf einen freien Blick auf den Embryo zu ermöglichen. Wenn das Loch groß genug ist, kann der Kern des punktierten Zelle gesehen werden, als auch auftauchen. Dies ist eine gute Kontrolle sicherstellen, dass die gesamte Zelle Inhalte wurden entfernt und können nicht regeneriert werden.
- Beachten Sie sorgfältig den Embryo als die Blastomere von Interesse wird entfernt. Der Rand der Zelle durchstochen wird auf das Loch in dem Chorion zurücktreten, so dass die Schnittpunkte der darunterliegenden Zellen sichtbar. Anwenden von Druck weiter, bis alle Blastomere von Interesse wurde entfernt. Verwenden einer Pinzette, um den Embryo von Seite zu Seite und rollen visuell zu bestätigen, dass alle von der Blastomere von Interesse ist weg.
- Mit einer unveränderten 15 cm Pasteur Pipette den Embryo zu reinigen FASW + (FASW + 1 mg / ml Amphotericin B, 100 Einheiten / ml Penicillin und 100 mg / ml Streptomycin).
- Raise-Blastomere abgetragen Embryonen in einzelnen Wellseiner sauberen 48-Lochplatte in FASW +, 50% Veränderung der Antibiotika ergänztem FASW + täglich. In unseren Händen Embryonen überleben und gut zu entwickeln, auch nach Ablation, in einem Temperaturbereich von 18 bis 28 º C. Forscher sollten ihre Embryonen bei einer Temperatur, für die sie eine saubere (aber nicht unbedingt steril) Oberfläche, auf der die Embryonen mit minimaler Störung erhöhen haben zu erhöhen. Um den Zeitpunkt der Entwicklungs Ereignisse in Blastomere-abgetragen Embryonen mit Kontrollen vergleichen zu können, verweisen wir auf die ausführliche Entwicklungs Inszenierung Informationen, die für Embryonen bei 18 º C 4, 25 º C 4 angehoben verfügbar ist, und 26 º C 5,6.
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Representative Results
Nach der erfolgreichen Ablation von Einzel dritte Spaltung P. hawaiensis Mikromeren wie in diesem Protokoll beschrieben, nach und nach die restlichen Mikromeren ihre Positionen leicht verschieben, um so den Raum früher von der abgetragenen Blastomere besetzt teilweise zu besetzen. Zum Beispiel, wenn g wird entfernt, der benachbarten Blastomeren mr ml und leicht verschoben und kommen, um die seitlichen Zellgrenzen, die früher in direktem Kontakt mit g (vgl. Abbildung 2A und 2C) waren zu teilen. Nach der erfolgreichen Ablation, können die übrigen Blastomeren eine leichte Verzögerung (von weniger als einer Stunde) vor dem Eintritt vierten Spaltung angezeigt, aber sie sollten dann wieder die gleichen Spaltmuster und Timing, dass sie in nicht manipulierten Embryonen zumindest bis zur Gastrulation angezeigt haben Stufen 23 . Nach Abtragung von jeder der vier Mikromeren Nachfahren des verbleibenden blastomeres sollte auch zeigen, normale Spaltung Timing und zelluläre Verhalten, einschließlich Bildung eines charakteristischen Zell Anordnung als der "Rosette" und die Einleitung Gastrulationsbewegungen 23. Der Anteil an Embryos, die die Ablation abgeschlossen und der Embryogenese bis zum Schlüpfen überleben kann anfänglich in der Größenordnung von etwa 10% für einen Forscher neu in der Technik, aber mit Erfahrung sollte etwa 50% im Durchschnitt, und kann so hoch wie 75% mit der Praxis und wachsam Pflege von Embryonen nach Blastomere Ablation. Tabelle 1 zeigt Beispiele von Zahlen von Embryonen abgetragen und Überlebensraten für eine Reihe von aufeinanderfolgenden Experimenten Ablation von demselben Forscher durchgeführt wird, zeigt, dass die Überlebensraten sind in der Regel mindestens 80% für die ersten Tage nach der Ablation, und dass die Überlebensraten bis zur Brut Anstieg mit zunehmender Erfahrung der Forscher.
Unvollständige Blastomere Entfernung wäredurch Sehen Reste der Blastomere, die abgetragen werden müssen, die Membrankomponenten, Zytoplasma oder Dotterkörnchen, noch innerhalb der Chorion des Embryos liegt gehören könnte belegt. Eine Verzögerung bei der vierten Spaltung von mehr als zwei Stunden, oder unregelmäßige Spaltmuster oder zelluläre Verhalten von Nachkommen der übrigen Blastomeren, könnte darauf hinweisen, erfolglosen Ablation. Diese Phänomene können die Folge von Schäden an anderen Blastomeren während der Ablation verursacht. Wenn andere als die für die Ablation Anzeige morphologischen Anomalien gezielt oder zerfallen, dann wieder beschädigen Blastomeren ist wahrscheinlich andere Blastomeren während der Ablation verursacht.
Wenn das Schicksal der Zelle Marker zur Verfügung, um die Nachfahren von bestimmten Dritt Spaltung Blastomeren deren Schicksale unterliegen nicht regulative Ersatz beschriften, können dann weitere Bestätigung für die erfolgreiche Ablation durch Markierung manipulierten Embryonen mit diesen Markern fol erhalten werdenFlügel der Ablation. Marker einiger mesodermalen und ektodermalen Gebiete wurden auf Mitte bis Ende der Stadien der Embryogenese 8,14,15 beschrieben. Da jedoch diese beiden Keimblätter können regulative Ersatz bei Verlust eines ihrer Gründer Blastomeren 25 zu unterziehen, diese Marker nicht eindeutig festzustellen, ob Blastomere oder nicht Ablation erfolgreich war. Im Fall der Keimbahn-Vorläufer g, sind alle seine Nachkommen durch die Expression von Vasa Transkript 12 und Protein während der Embryogenese 4 markiert und Embryonen, in denen g wurde zumindest bis Anfang Keim Band abgetragen Mangel Keimzellen Stufen 4. Erfolgreiche Ablation von g kann somit durch die Untersuchung vasa-Expression nach der Ablation in späteren Stadien der Embryogenese (Fig. 5) bestätigt werden.
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Fig. 1 ist. Erwachsene Parhyale hawaiensis weiblichen und Embryonen. (A) Seitenansicht einer erwachsenen Frau P. hawaiensis, zeigt coxal Platten (Pfeile), Brust-Anhängsel (Pfeilspitzen) und Embryonen als rosa oder lila Kügelchen durch die transparenten Platten coxal (blau gestrichelten Linien) sichtbar. Vorder ist nach links. (B) Ventrale Ansicht einer erwachsenen Frau P. hawaiensis zeigt Embryonen in der Bruttasche (blau gestrichelten Linien) sichtbar. Vorder ist nach links. (C) Die Embryonen aus Bruttasche freigegeben normal entwickeln in FASW. Eine Vielzahl von Stufen von S1 durch Schraffur gezeigt sind, statt nach Browne et al 5 Maßstabsbalken = 1 mm (A) und (B). 500 um (C).51073/51073fig1highres.jpg "target =" _blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
2. Acht-Zell-Stadium Embryonen von P. hawaiensis. (A) Live-Acht-Zell-Stadium (Stadium S4 5) unmanipulierten Embryo mit vier Mikromeren (kleinere Zellen) und vier Makromeren (größere Zellen). (B) Schematische Darstellung eines Acht-Zell-Stadium Embryo zeigt das Schicksal der Zelle Bezeichnungen aller Blastomeren in einem Wildtyp-Embryo als durch Abstammung Verfolgung ergab, basierend auf Fluoreszenzmarker 6. (C) Live S4 Bühne, die den Embryo g Blastomere unter Verwendung der vorliegenden Protokoll entfernt wurde. Die eingekreisten Bereich zeigt den Bereich, die früher von der g Blastomere besetzt, dieRest Mikromeren haben Position geringfügig infolge der Abtragung g verschoben. Maßstabsbalken = 250 um (A) und (C). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
3. Draht-Werkzeug zum Entfernen von Embryonen aus der Bruttasche verwendet. Die hier gezeigte Tool wurde durch Einfügen eines Wolframdrahtes in den schmalen Ende einer Pasteur-Pipette und sanft Schmelzen des Glases, um den Draht zu versiegeln, dann mit einer Pinzette, um eine leichte Kurve einzuführen gemacht in den Draht. Andere Tools zum Entfernen von Embryonen aus der Bruttasche geeignet sind, schließen abgestumpft Zange oder ein Glas-Kapillare mit einem verschlossenen Ende und geglättet. ScAle-Bar = 1 cm.
4. Glas Nadel zum Punktieren Blastomeren während der Ablation eingesetzt. Die hier gezeigte Nadel wurde auf einem Sutter P97 Nadel Abzieher mit einem Programm mit Parametern 2 x gezogen (Wärme = 566, ziehen = 100, Geschwindigkeit = 20, Zeit = 250) + 1 x (Wärme = 566, ziehen = 100, Geschwindigkeit = 100, Zeit = 250). Anderen Instrumenten oder Programmen verwendet werden, um Nadeln für die Ablation, solange sie die gleiche allgemeine Form wie das hier gezeigt sind ziehen, werden. Maßstabsbalken = 1 cm.
5. Bewertung der Ergebnisse der Blastomere einblation während der Embryogenese. (A) Gonad Region eines Wildtyp-Bühne S29 Embryo kurz vor dem Schlüpfen, Keimzellen, die durch Anti-Vasa-Immunfärbung (Pfeilspitzen) markiert. Das hier verwendete anti-Vasa Antikörper spezifisch an P. hawaiensis Vasa (Linsler, Alwes und Extavour, unveröffentlichte Daten). (B) Gonad Bereich einer Stufe S29 Embryo, der die g Blastomere im Acht-Zell-Stadium entfernt hatte, zeigt Abwesenheit von Keimzellen, wie durch die Abwesenheit von spezifischen Anti-Vasa-Signal in der Region Gonaden (Pfeilspitzen) offenbart. Balken in (A) = 100 um und gilt auch für (B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Ablation Runde | # Der abgetragene | # (%) Überlebtezu 50% Entwicklung | # (%) Überlebte, um 90-100% Entwicklung |
| 1 | 49 | 41 (83,7) | 6 (12.2) |
| 2 | 48 | 46 (95,8) | 17 (35.4) |
| 3 | 31 | 25 (80,6) | 22 (71,0) |
| 4 | 97 | 72 (74,2) | 56 (57,7) |
| 5 | 108 | 100 (92.6) | 65 (60,2) |
| 6 | 50 | 36 (72,0) | 37 (74,0) |
| TOTAL | 383 | 320 (83.6) | 203 (53.0) |
Tabelle 1. Repräsentative Ablation ÜberlebenStatistik. Nach micromere Ablation, wurde das Überleben sowohl innerhalb der ersten 50% der Entwicklungs (5-6 Tage bei 25 º C) und dann bei 90-100% Entwicklung (10-12 Tage bei 25 º C) erzielt. Ablation rundet 1-6 sind repräsentative Beispiele von Experimenten, die von einem einzigen Forscher (AR Nast) in chronologischer Reihenfolge über den Verlauf eines Acht-Monats-Zeitraum durchgeführt. Forscher sollten finden, dass, wie hier, um 90-100% Steigerung Entwicklung mit Erfahrung gezeigt, die Überlebensraten.
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Discussion
Wir beschreiben ein Protokoll für Hand Ablation und vollständige physische Entfernung der einzelnen Blastomeren vom frühen Teilungsstadien des Floh P. hawaiensis. Wir zeigen Verwendung dieses Protokolls durch Entfernen der einzelnen Keimbahn-Vorläuferzelle g aus einem Acht-Zell-Stadium Embryo, und zeigen, dass die Ablation wurde durch die Bestätigung Abwesenheit von g 's Tochter-Zellen in der Embryogenese später erfolgreich. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um eine der Mikromeren aus dem Embryo in frühen Teilungsstadien entfernen. Um dieses Protokoll verwenden, um Makromeren in diesem Stadium oder Blastomere auf den ersten oder zweiten Spaltungsstufen zu entfernen, kann der Anwender einfach die leichten Änderungen der Schaffung eines etwas größeren Loch in der Chorion im Schritt 4.4, und Aufbringen von Druck und Sog über einen längeren Zeitraum angewendet , um das größere Volumen der Zellinhalt bei Schritt 4.6 zu entfernen. Wir haben festgestellt, dass nach der Anwendung dieses Protokolls ist die Entwicklung der restlichen Blastomeren nach Ablation unin Bezug auf die Spaltung und Zellbewegungsmuster wenigstens bis zum Zeitpunkt der Gastrulation 23 beeinflusst.
Dieses Protokoll hilfreich für die weitere Untersuchung des Entwicklungspotenzials der frühen Spaltung Blastomeren in diesem Flohkrebs sein. Viele Fragen bleiben in diesem Bereich beantwortet werden, einschließlich, warum manche Zellen, nicht aber andere können Schicksale ändern zu denen abgetragen Blastomeren zu ersetzen, und der genaue Zeitpunkt und regulative Mechanismen dieser Veränderungen. Das Protokoll kann auch modifiziert werden, um eine Ablation von mehr als einer Zelle unterzubringen, durch einfaches Wiederholen der Schritte 4,2-4,7 nacheinander auf die Blastomeren von Interesse.
Es ist wichtig, eine hochwertige Stereomikroskop mit geeigneter Beleuchtung, um zu sehen und richtig zu identifizieren die frühen Spaltung Blastomeren zu verwenden. Wir finden, dass seitliche einfallende weiße Licht, das von einer Kaltlichtquelle ist die für diesen Zweck nützlich. Einfallendes Licht direkt über dem Specimen erzeugt Reflexionen, die die Zellmorphologie und die Grenzen hinwegtäuschen können, während Durchlicht nicht die dichte Dotter der Embryonen und Blastomeren durchdringen sind daher schwer zu unterscheiden. Es ist sehr hilfreich für die Uhrenglas oder Petrischale mit Embryonen auf eine schwarze Fläche eher als ein weißer oder transparenter Glasfläche gelegt werden, da dies am besten Kontrast für den blassen Embryonen.
Eine Einschränkung dieses Protokoll ist, dass die Blastomere von Interesse müssen korrekt und eindeutig sein, bevor das Verfahren identifiziert. Photoablation Techniken wäre nützlicher für die Forscher neu in das System, da die Embryonen können belassen werden, um für ein paar Zyklen Spaltung nach der Injektion des Fluoreszenzfarbstoffes 28 zu entwickeln, und die Identität des injizierten Blastomere bestätigt nach der Injektion, aber bevor photoablation, durch Analyse der Muster der zellulären Nachkommen, die auch in früheren Zelllinie beschrieben wordenAlter analysiert 6,23. Wenn Forscher mit der P. vertraut sind hawaiensis Embryo und kann alle Blastomeren mit Zuversicht zu identifizieren, könnte die hier beschriebene manuelle Ablation für Anwendungen, bei denen vollständige physische Entfernung einer Blastomere, statt die Zelle zu töten, ohne den toten Zellkörper aus dem Embryo, ist wünschenswert, verwendet werden.
Dieses Verfahren könnte im Prinzip angewendet werden, um einzelne Blastomeren aus Embryonen im Teilungsstadium von anderen holoblastically Spaltung Krebstiere oder andere wirbellose Meeres-oder Süßwasser deren Chorion Befruchtung oder Membranen können nicht einfach entfernt werden zu entfernen. Änderungen könnte den Einsatz von Medien Inkubation mit entsprechenden Salzgehalt Eigenschaften und Änderung der Form der Nadel auf zarter Membranen (längere, dünnere Nadeln) oder robuster embryonalen Beläge (kürzer, schnell verjüngende Nadeln) unterzubringen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir danken Rayhan Arif und Hassaan Shahawy für Kameraführung, Tripti Gupta und Frederike Alwes für Unterstützung Verfeinerung der Zell Ablation Technik und Labor Extavour Mitglieder für Rückmeldungen über die Daten-, Video-und Manuskript. Diese Arbeit wurde teilweise von der Harvard Stem Cell Institute unterstützt (Seed Förderkennzeichen SG-0057-10-00) die Ellison Medical Foundation (New Scholar Awards Nummer AG-NS-07010-10) mit CGE und Harvard College Research Program Auszeichnungen an ARN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 cm Pasteur pipette | Wheaton | 53499-630 VWR | For transferring intact and blastomere-ablated embryos from dish to dish. |
| 22 cm Pasteur pipette | Wheaton | 53499-632 VWR | For making mouth pipette tips. |
| 3 cm Petri dishes | Thermo Scientific | 25382-334 VWR | Use some unaltered to collect and store embryos; coat some with a layer of Sylgard (see below) to create a working surface for blastomere ablations. |
| 48-well Plates | Greiner Bio-One | 82051-004 VWR | For culturing embryos following ablation. |
| Bottle top filters 0.2 µm | Nalge Nunc International | 28199-296 VWR | For creating FASW (See below). |
| Bunsen burner | VWR | 89038-530 VWR | For creating tungsten wire tool and fine tip of mouth pipette. |
| Diamond scribe | Musco Sports Lighting | 52865-005 VWR | For creating wide-mouthed Pasteur pipettes for collecting couples. |
| Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 Fine Science Tools | For holding anaesthetized females during removal of embryos from brood pouch. These do not have to be fine-tipped Dumont forceps - the tips can be at least as blunt as those of the forceps for which the catalogue number is listed here. |
| Fungizone-Amphotericin B | Sigma | A2942 Sigma Aldrich | Add to FASW to a final concentration of 1 mg/ml, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. |
| Glass capillaries 4 in long, 1/0.58 OD/ID (mm) | World Precision Instruments | 1B100-4 World Precision Instruments | For making needles for puncturing the blastomere to be ablated. |
| Glass watchglass 300 mm diameter | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 Electron Microscopy Sciences | For use in removing embryos from the brood pouch of anesthetized females. |
| Instant Ocean Artificial Sea Water (ASW) | Instant Ocean | IS160 Aquatic EcoSystems | Make ASW by dissolving salt in deionized water to a salinity of 1.022-1.024. |
| Instant Ocean Filtered Artificial Sea Water (FASW) | Instant Ocean | IS160 Aquatic EcoSystems | Use 0.2 µm filters to sterilize ASW. Make up in small amounts (< 250 ml) as needed. |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 21905-026 VWR | For safely breaking off the fine end of Pasteur pipettes modified for collecting couples. |
| Mouth pipette adaptor | Drummond Labware | A5177-5EA Sigma Aldrich | Insert the fine pulled Pasteur pipette tip into this end, to be used for removing extruded cell contents during the ablation procedure. |
| Mouth pipette tubing | Aldrich | Z280356 Sigma Aldrich | Cut this to be long enough to comfortably hang around your neck during the ablation procedure. |
| Needle Puller | Sutter Instrument Company | P97 Sutter Instrument Company | For making needles from glass capillaries for puncturing the blastomere to be ablated. |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Mediatech | 45000-650 VWR | Add to FASW to a final concentration of 100 units/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. |
| Rubber bulb | Electron Microscopy Sciences | 100488-418 VWR | For using Pasteur pipettes to transfer embryos from dish to dish. |
| Sylgard 184 | K. R. Anderson, Inc. | NC9659604 Fisher Scientific | Make up according to manufacturer's instructions. Pour a layer 2-5 mm thick into a 3cm petri dish to create a working surface for blastomere ablations. |
| Tungsten wire 0.004 inches diameter | A-M Systems | 719000 A-M Systems | Use this to make a tool for removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. |
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