Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Ablation av en enda cell från åtta-cell Embryon av märlkräftan Kräftdjur Published: March 16, 2014 doi: 10.3791/51073
Automatic Translation
1, 1
1Department of Organismic and Evolutionary Biology, Harvard University

Summary

Märlkräftan Parhyale hawaiensis är en lovande modellorganism för studier av kräftdjur embryologi och jämförande leddjur utveckling och evolution. Detta protokoll beskriver en metod för manuell borttagning av enstaka blastomerer från klyvning stegsembryon tidiga av Parhyale.

Abstract

Märlkräftan Parhyale hawaiensis är ett litet kräftdjur som finns i tidvatten marina livsmiljöer i hela världen. Under det senaste decenniet har Parhyale vuxit fram som en lovande modellorganism för laboratoriestudier av utvecklingen, vilket ger en utgrupp jämförelse användbar för den väl studerade leddjur modellorganismen Drosophila melanogaster. I motsats till de syncytiala klyvningar av Drosophila, de tidiga klyvningar av Parhyale är holoblastic. Ödet kartläggning med hjälp av spår färgämnen injiceras i tidiga blastomeres har visat att alla tre groddblad och könsceller fastställs av åttacellstadiet. Vid detta steg är tre blastomerer förutbestämt att ge upphov till ektoderm, är tre förutbestämt att ge upphov till mesoderm, och de återstående två blastomerer är de förstadier i endoderm och könsceller respektive. Dock har blastomere ablation experiment visat att Parhyale embryon har också betydande reglerande capabilities, så att öden blastomerer borttagen vid åttacellstadiet kan tas över av ättlingar till några av de återstående blastomeres. Blastomere ablation har tidigare beskrivits av en av två metoder: injektion och efterföljande aktivering av fototoxiska färgämnen eller manuell ablation. Men fotoablation dödar blastomeres men tar inte bort den döda cellkroppen från embryot. Komplett avlägsnas fysiskt specifika blastomeres kan därför vara en föredragen metod för ablation för vissa tillämpningar. Här presenterar vi ett protokoll för manuell borttagning av enstaka blastomeres från åttacellstadiet av Parhyale embryon, illustrerar instrument och manuella förfaranden som krävs för fullständigt avlägsnande av cellkroppen samtidigt som de kvarvarande blastomeres levande och intakt. Detta protokoll kan tillämpas på alla Parhyale cell vid åttacellstadiet, eller till blastomerer av andra tidiga klyvningssteg. Dessutom, i princip detta protokoll kan tillämpas på tidig CleaVåge scen embryon av andra holoblastically klyva marina ryggradslösa djur.

Introduction

Märlkräftan kräftdjur Parhyale hawaiensis har vuxit fram under det senaste decenniet som en lovande modellorganism med stor potential för användning i evolutionär utvecklingsbiologi forskning 1. Bland leddjur, de flesta modellsystem är insekter, och den mest omfattande av dessa är bananflugan Drosophila melanogaster. D. melanogaster är medlem i insektsordningen Diptera, och som sådan visar många embryologiska funktioner som härrör med hänsyn till de av basalt förgrenings insekter 2. Dessutom är insekter kapslade i subphylum Pancrustacea 3, vilket innebär att insekter har sina närmaste släktingar i den långvariga "naturlig" grupp som kallas pancrustaceans, och att denna grupp är paraphyletic. Detta tyder på att förutom basalt förgrening insektsmodeller, är studier av andra kräftdjur krävs för att få en bredare syn på evolutionen av de utvecklingsdrag ennd molekylära mekanismer som är så väl studerade i D. melanogaster. Men mycket få kräftdjur varit väl etablerad i experimentell laboratorieanalys av utvecklingen. Märlkräftan P. hawaiensis är en mycket lätthanterlig laboratoriemodellsystem, kan bli föremål för en rad olika experimentella tekniker. Märlkräftor visar många unika egenskaper i sin överordnade superorder Peracarida (strandloppor, Scuds och väl räkor), och därför tros vara relativt härledas inom denna grupp av kräftdjur. Trots det relativt lätt att embryologisk och funktionell genetisk manipulation som erbjuds av Parhyale göra detta märlkräfta ett värdefullt tillskott till nuvarande inventering av modellorganismer.

Som försöksdjur, P. hawaiensis erbjuder många fördelar. Djur är toleranta mot ett brett intervall av temperaturer och salthalter, och överlever bra i stora kulturer av artificiellt havsvatten 1. Det är lätt att skilja mellaEen män och kvinnor som bygger på tydliga morfologiska skillnader, främst, de stora, krokiga, främre bålen bihang att män använder för att gripa honorna under parning. För embryologisk och utvecklingsarbete, P. hawaiensis har flera mycket tilltalande drag. Embryogenes varar cirka 10 dagar och tiden för könsmognad är cirka sex veckor vid 28 º C (men observera att Parhyale lever väl vid temperaturer mellan ca 20-30 º C, och den detaljerade utvecklings iscensättning information finns tillgänglig för embryon som tas upp vid 18 º C 4 , 25 º C 4, och 26 º C 5,6). Vuxna parar sig året runt i laboratoriet, så att embryon är tillgängliga när som helst på året. Honorna lägger 2-20 (beroende på kvinnans ålder) befruktade ägg i en ventral kull påse som ligger mellan de första par ben (figur 1a och 1b), och det är möjligt att samla dessa embryoväldigt tidigt i utvecklingen utan att döda den kvinnliga eller skada embryon (Figur 1C). De embryon överlever i filtrerat artificiellt havsvatten genom att kläckning, kan fastställas för efterföljande genuttryck eller histologisk analys 7, samt en detaljerad iscensättning tabell möjliggör korrekt identifiering av de framsteg genom utveckling 5. Robusta protokoll har använts för att utföra genuttrycksanalys med in situ hybridisering 8-15 eller immunfärgning 4,16,17, funktionell knockdown genom RNA-interferens 13,15 eller morpholinos 12, och stabil germinallinje genmodifiering 18. Med hjälp av genmodifiering systemet, inducerbart uttryck 14 och förstärkare fälla 19 metoder kan också användas för att undersöka geners funktion i P. hawaiensis. Medan en offentligt tillgänglig arvsmassa finns för närvarande inte, en transkriptom innehåller avskrifter produceras under oogenes och embryogenes har been de novo monteras och kommenterad 20, och deponeras i en sökbar databas 21, underlättar gen upptäckt. Sammanfattningsvis P. hawaiensis är en mycket lätthanterlig modellorganism passar flera experimentella och genetiska metoder för att förstå utvecklingen.

Till skillnad från de tidiga syncytial klyvningar av D. melanogaster, P. hawaiensis embryon klyva holoblastically efter fertilisering (Figur 2A). Lineage tracing analys har visat att genom tredje klyvning, var och en av de tredje klyvnings blastomerer specifikt förutbestämt att ge upphov till en av de tre germinallager eller bakterielinjen 6 (figur 2B). Dessa uppgifter, tillsammans med microarraydata 22, analyserar cell härstamning 6,23, och blastomere isoleringsexperiment 4 har föreslagit att utvecklingspotentialen är segregerade till åtminstone vissa tredje klyvnings blastomeres genom asymmetrisk arv av cell öde bestämningsfaktorer. Följaktligen, blastomere ablation experiment där könscellerna prekursorn (benämnd "g" i Parhyale cellinje nomenklatur 6) avlägsnades vid åtta cellstadiet, embryon saknade könsceller vid senare utvecklingsstadier 4, såsom indikeras genom frånvaro av celler uttrycker proteinet Vasa, som är en bakterielinjen markör i de flesta metazoans 24. Däremot somatiska blastomere ablation experiment visade att P. hawaiensis embryon har också betydande tillsynskapacitet, så att öden mesoderm och ektoderm prekursor blastomeres borttagen vid åttacellstadiet kan tas över av ättlingar till några av de återstående blastomeres 25. Hur reglerande cell öde ersättare kan inträffa, och omfattningen av autonoma cellöde antar somatiska blastomeres, är okänd. Experimentella embryologiska tekniker såsom blastomere ablation kan vara användbara i förståelseding relativa autonomi och nonautonomy av cell öde beslut 26,27 och är därför av intresse att studera P. hawaiensis embryogenes.

I de experiment som visade reglerande ersättning av ektodermala och mesodermala härstamningar, var blastomere ablation utförs av injektion 28 och efterföljande excitation av fototoxiska färgämnen 25. Även om denna teknik är effektivt på att döda den injicerade blastomere (s), är det inte helt ta bort den döda cellkroppen från embryot. Dessutom har skillnader observerats mellan cell härstamning data som samlats in genom att gastrulation stadier av embryogenes genom att injicera blastomeres med fluorescerande härstamning spårämnen 28,29, och data som samlats in genom att följa ostörda blastomeres genom utveckling av samma embryonala stadierna 23. Komplett avlägsnas fysiskt specifika blastomeres kan därför vara en föredragen metod för ablation för vissa tillämpningar.

Vi har tidigare publicerat resultaten av cell härstamning analyser av embryon där enskilda celler manuellt borttagen 23. Men den känsliga åtgärder som behövs för att ta bort enstaka blastomeres från klyvning skede embryon tidigt har ännu inte beskrivits fullständigt. Här presenterar vi ett protokoll för insamling av P. hawaiensis embryon och manuell ablation av en enda blastomere från en åttacellstadiet embryo. Målet med denna metod är att uppnå fullständigt avlägsnande av cellkroppen från embryot, så att observation av de cellulära beteenden och cellöde behörigheten för de återstående celler under embryogenes och post-embryonal utveckling. Vår protokoll visar borttagande av könsceller gångaren g (figur 2C), men kan tillämpas på varje cell vid åttacellstadiet, eller till blastomerer av tidigare spaltningssteg. I princip skulle detta protokoll tillämpas på avlägsna enstaka celler från klyvning skede embryon början av Other holoblastically klyva marina ryggradslösa djur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Kommentarer som kan vara till hjälp för att utföra vissa steg anges i kursiv stil.

1. Dag 1: Beredning av material

  1. Förbered följande material (se tabell av material och utrustning):
    • 15 cm och 22 cm Pasteur-pipetter
    • Diamond rits
    • filtrerades artificiellt havsvatten (salthalt mellan 0,0018-0,0020) innehållande 1 mg / ml amfotericin B (1:100 av en 100 mg / ml stamlösning), 100 enheter / ml penicillin och 100 mg / ml streptomycin (1:50 av en stamlösning innehållande 5000 enheter / ml penicillin och 5000 mg / ml av streptomycin)
    • filtrerat artificiellt havsvatten (salthalt mellan 0,0018 till 0,0020) utan tillsatser
    • en stor plastbehållare för bostads par (minst 15 cm x 15 cm x 5 cm)
    • små (3 cm eller 5 cm) Petriskålar kantas Sylgard
    • små (3 cm eller 5 cm) petriskålar
    • ett klockglas eller glas platta med flera brunnar
    • pincett (vi använder trubbiga pincett härrör tillbakam gamla Dumont # 5 pincett som oavsiktligt skadats i andra laboratorieförfaranden, som vi har repurposed med hjälp av en pincett Slipsten för att se till att ändarna av tången är släta, att båda pinnarna är lika långa, och att de inte längre har vassa spetsar. Extremt fin pincett, till exempel nya Dumont # 5 pincett, är oönskade eftersom de kan skada embryon och / eller kvinnor.)
    • en pasteurpipett med slutet vidgas (se steg 1.2 nedan)
    • ett embryo hämtning verktyg bestående av en tunn, krökt volframtråd inbäddad i den tunna änden av en Pasteur-pipett (skulle kunna ersättas av en alternativ anordning, se 1.3)
    • en mun pipett med en liten öppning (se steg 1.4 nedan)
    • ett glas nål tillverkad av en drog glaskapillär (se steg 1.5 nedan)
    Inga material giftiga för människor används i detta protokoll. Dock bör forskarna se till att de bär handskar eller annan skyddande klädsel som krävs av riskhanterings guidelines av deras institution.
  2. För att göra den breddade pasteurpipett, första poäng runt en 15 cm pasteurpipett vid den punkt där pipetten börjar att avgränsa med en diamant rits, linda in den skårade regionen av pipetten i en Kimwipe eller pappershandduk för att skydda fingrarna, och sedan försiktigt bryta av spetsen vid skåran. Håll den trasiga änden av pipetten över en bunsenbrännarens låga under flera sekunder för att jämna ut kanterna. Öppningen bör vara något smalare än den maximala bredden för pipetten.
  3. För att göra volfram tråd dissekera verktyg, sätt in en volframtråd i slutet av en 15 cm glas Pasteur pipett, och håll över en bunsenbrännare låga för att smälta glaset, fastställande av kabeln på plats. Använd pincett för att försiktigt kurvan i slutet av kabeln i en krokform. Se Figur 3 för ett exempel på en lämplig form för detta verktyg.
  4. För att göra en liten öppning för munnen pipett, dra den tunna änden av en 22 cm pasteurpipett i två delar over en flamma, och bryts av spetsen av den lilla änden. Sätt in i slutet av munnen pipetten hållaren.
  5. Gör glaset nålen som kommer att användas för att punktera blastomerer av intresse under ablation förfarande med användning av en nål avdragare. En lämpligt formad nål visas i figur 4. Denna nål drogs på en Sutter P97 nål avdragare med hjälp av ett program med parametrar 2x (värme = 566, pull = 100, hastighet = 20 tid = 250) + 1X (värme = 566, pull = 100, hastighet = 100, tid = 250). Det särskilda programmet och instrument som används för att göra nålen kan variera, men nålen måste ha en fin spets, men också robust nog att inte bryta när man trycker mot chorion av embryot.

2. Dag 1: Samling Parhyale parning Par

  1. Använd den vidgade pasteurpipett (steg 1.2 ovan) för att samla parning P. hawaiensis par från den stora kulturbehållaren, och överföra dem till en separat behållare som innehåller cluta artificiellt havsvatten. Det är inte nödvändigt att detta havsvatten skall filtreras. Det är bäst att samla parning par i den senare eftermiddagen och lämna par i rumstemperatur (20-23 º C) över natten, så att nästa morgon, de flesta embryon kommer att ha nyligen befruktade och deponeras, och därmed vid tidig klyvning stadier passar för ablation. Samla minst 20 parning par för att se till att en del kvinnor kommer att bära klyvning skede embryon tidigt med följande morgon.

3. Dag 2: Gathe Parhyale Embryon

  • Nästa morgon, ingjuta filtrerat artificiellt havsvatten (FASW) med CO2. Några av kvinnorna kommer att ha simmat fritt från sina män under natten, samla dessa separerade kvinnor och söva dem i FASW / CO2. De kvarvarande oparade hanar kan tas bort från den hoppassande par behållare och återfördes till den stora kulturen. Återstående parning par kan sparas för embryosamlings senarepå dagen eller nästa dag.
  • Överför enstaka bedövad kvinna bär embryon till ett urglas i FASW / CO2. Alla separerade kvinnor kommer sannolikt har deponerat ägg, som kommer att vara synlig för ögat som ljusrosa eller lila spheroids genom de transparenta coxal plattor av honorna (Figur 1A). För att avgöra om embryona vid tidiga klyvningssteg och därmed lämplig för blastomere ablation, kommer forskaren måste ta bort embryon från yngelpåsen och undersöka dem i mikroskop.
  • Kollar proceduren under en dissekera mikroskop, ta tag i coxal plattorna längs ena sidan av kroppen med pincett. Embryon kommer att vara synlig i den ventrala kull påse mellan dessa coxal plattor (Figur 1B).
  • Sätt in den tunna, böjda tråden verktyg (figur 3; steg 1,3 ovan) in i den bakre änden av yngel påse, och försiktigt lyfta tråden mot den främre änden av yngel påse för att separera yngelpåse beläggningar (dessa är modifierade ventrala bihang kallas oostegites 30), öppna påsen och lossa embryona. Embryon som är inom den första timmen eller så för att sägas är alla inneslutna i ett mycket tunt, genomskinligt membran som lätt kommer att störas av tråd verktyg, detta membran försvinner med ca 2-3 timmar efter äggläggning, och embryon inte är bundna till varandra eller till den kvinnliga på något sätt från och med nu och framåt hela embryogenes. Om forskare finner det besvärligt eller svårt att manövrera den böjda tråden för att ta bort embryon från yngel påse, ett alternativ implementera kan användas, så länge som rörelserna är mild och inga starka tryck appliceras på embryona eller kull påse. Andra verktyg som är lämpliga för att ta bort embryon från yngelpåsen inkluderar trubbiga pincett eller ett glas kapillär med en förseglad och jämnas slut.
  • Använd ett oförändrat 15 cm pasteurpipett att spola vatten genom den öppnade grubbla påsen, trycka ut than embryon, vilket bör sedimentera till botten av urglas. Överför honan att rengöra FASW (utan CO2) för att tillåta återhämtning innan återinföra henne till huvudkulturen. Flera honor kan placeras in i samma återvinnings skålen, men tillåter kvinnor att återhämta sig helt innan han återvände dem till huvudkulturen, eftersom de kan bli uppätna av andra djur, om de fortfarande är delvis sövd.
  • Använd ett oförändrat 15 cm pasteurpipett att överföra embryon till en petriskål med rent FASW och betrakta under mikroskop för att bestämma deras embryostadium. Separata embryon som är på tredje klyvning (etapp 4 5), som är lämpliga för detta förfarande. Det bör också vara möjligt att tillämpa detta protokoll för varje klyvning skede före groddar skivbildning (etapp 07 till 08 maj).

4. Dag 2: ablating enstaka celler

  1. Fyll Sylgard-fodrade petriskål med ett grunt skikt av FASW. Använd ett oförändrat 15 cm Pasteur piPette att överföra ett enda embryo till plattan.
  2. Använda trubbig pincett, försiktigt rulla embryot för att identifiera den cell som skall avlägsnas (fig. 2A och 2B). Bakterielinjen prekursor g kan identifieras som den minsta micromere, som sitter på toppen av den minsta macromere Mav. Dessutom betyder g inte direkt kontakta cellen en, som är den micromere direkt över från det, eftersom de mesoderm förstadiepartiklama micromeres ml och mr dela en cell kant i mitten av embryot. Mr är blastomere till höger om g och ml är den micromere till vänster om g. Syster macromeres av mr, ml, och en är ektoderm prekursorer Er, El, och Ep respektive.
  3. Med pincett i LEFt handen om forskaren är högerhänt (eller i höger hand om forskaren är vänsterhänt), orientera embryot med cellen av intresse till höger (eller vänster om forskaren är vänsterhänt), och försiktigt tag embryot mellan pincett för att stabilisera den.
  4. Med användning av en drog glasnål (steg 1.5 ovan, fig. 4), försiktigt punktera cellen av intresse. För inte in nålen för långt, för att inte trycker in nålen i cellerna grann eller under cellen av intresse. Nålen har endast att punktera chorion och underliggande cellmembranet, och behöver inte sträcka sig djupt in i cellen som skall avlägsnas.
  5. Byt nålen som används för att punktera embryot för glas slutet av en mun pipett med en fin drog Pasteur pipettspetsen (steg 1.4 ovan). Håll pipettspetsen nära hålet som skapas i cellen av intresse, och tillämpa mycket mild sugning.
  6. Mycket försiktigt pressa embryot med pincett. Eftersom innehållet i det blastobara skjuts ut från chorion genom hålet som skapades i steg 4.4, suga in den i munnen pipetten för att möjliggöra en fri sikt av embryot. Om hålet är stort nog, kan kärnan i den punkterade cellen ses växa fram också. Detta är en bra kontroll för att se till att hela cellinnehåll har tagits bort och kan inte återskapas.
  7. Uppmärksamma noggrant embryot som blastomere intressanta avlägsnas. Gränsen för den punkterade cellen faller tillbaka mot hålet i chorion, vilket gör skärningspunkterna mellan de underliggande cellerna synliga. Fortsätt att sätta press tills all blastomere av intresse har tagits bort. Använd pincett för att rulla embryot från sida till sida och kontrollera visuellt att alla blastomere av intresse är borta.
  8. Med användning av ett oförändrat 15 cm pasteurpipett, överföra embryot till rent FASW + (FASW + 1 mg / ml amfotericin B, 100 enheter / ml penicillin och 100 mg / ml streptomycin).
  9. Höj blastomere-ablation embryon i enskilda brunnarav en ren 48-brunnsplatta i FASW +, ändra 50% av antibiotikum-kompletterat FASW + dagligen. I våra händer embryon överlever och utvecklas väl, även efter ablation, vid olika temperaturer från 18 till 28 º C. Forskare bör höja sina embryon vid en temperatur som de har en ren (men inte nödvändigtvis sterila) yta att höja embryon med minimal störning. För att kunna jämföra tidpunkten för utvecklings händelser i blastomere-ablation embryon med kontroller, vi hänvisar läsaren till den detaljerade utvecklings iscensättning information som är tillgänglig för embryon som tas upp vid 18 º C 4, 25 º C 4, och 26 º C 5,6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter framgångsrik ablation av enstaka tredje klyvning P. hawaiensis micromeres som beskrivs i detta protokoll, resterande micromeres gradvis flytta sina positioner en aning, för att delvis upptar det utrymme som tidigare ockuperats av den ablationsbehandlade blastomere. Till exempel, när g avlägsnas den angränsande blastomerer mr och ML förskjutas något och kommer att dela de laterala gränserna cell som tidigare var i direkt kontakt med g (jämför fig. 2A och 2C). Efter framgångsrik ablation, kan de återstående blastomeres visa en liten fördröjning (mindre än en timme) innan fjärde klyvning, men de bör då återuppta samma klyvningsmönster och timing att de skulle ha visas i unmanipulated embryon åtminstone fram till gastrulation steg 23 . Efter ablation av någon av de fyra micromeres, ättlingar till de återstående Blastotjärnar bör också visa normal klyvning timing och cellulära beteenden, bland annat bildandet av en karakteristisk cellulär arrangemang kallas "rosett" och inledandet av gastrulation rörelser 23. Andelen embryon som överlever ablationsproceduren och fullständig embryo fram till kläckning kan inledningsvis vara i storleksordningen ca 10% för en forskare nytt för tekniken, men med erfarenhet bör i genomsnitt ca 50%, och kan vara så hög som 75% med praktik och vaksamma vård av embryon efter blastomere ablation. Tabell 1 visar exempel på antalet embryon borttagen och överlevnad för en serie successiva ablation experiment utförda av samma forskare, som visar att överlevnaden är i allmänhet minst 80% för de första dagar efter ablation, och att överlevnaden genom att kläcka stiger med ökande erfarenhet av forskaren.

Ofullständig blastomere borttagning skulle varabevisas av att se resterna av den blastomere som borde ha borttagen, som kan omfatta membrankomponenter, cytoplasma eller äggula granulat, fortfarande befinner sig inom chorion av embryot. En försening i fjärde klyvning av mer än två timmar, eller oregelbundna klyvningsmönster eller cellulära beteenden av ättlingar till de återstående blastomeres, också skulle kunna tyda på misslyckad ablation. Dessa fenomen kan vara resultatet av skador på andra blastomeres under ablation förfarandet. Om andra än den riktade för ablation display morfologiska abnormiteter eller upplösas, sedan återigen skada blastomeres har sannolikt orsakats av andra blastomeres under ablation förfarandet.

Om cell öde markörer finns att märka ättlingar till specifika tredje klyvnings blastomeres vars öden är inte föremål för regulativa ersättning, kan då ytterligare bekräftelse på framgångsrik ablation erhållas genom märkning av manipulerade embryon med dessa markörer Follovinge ablationen. Markörer av vissa mesodermala och ektodermala territorier har beskrivits på mitten till sena stadier av embryogenes 8,14,15. Men eftersom båda dessa germinallager kan genomgå reglerande ersättning vid förlust av en av sina grundare blastomeres 25, dessa markörer kan inte entydigt avgöra om blastomere eller inte ablation lyckades. När det gäller könsceller gångaren g, alla dess ättlingar markeras av uttrycket av vasa avskrift 12 och protein 4 hela embryogenes, och embryon där g är borttagen brist könsceller åtminstone fram till början av groddar bandet steg 4. Lyckad ablation av g kan därför bekräftas genom att undersöka vasa uttryck efter ablation i senare skeden av embryogenes (Figur 5).

Figur 1 th = "5in" fo: src = "/ files/ftp_upload/51073/51073fig1highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/51073/51073fig1.jpg" />
Figur 1. Vuxen Parhyale hawaiensis hona och embryon. (A) sidovy av en vuxen hona P. hawaiensis, visar coxal plattor (pilar), bröstkorg bihang (pilspetsar) och embryon synliga som rosa eller lila spheroids genom de transparenta coxal plattor (blå streckad kontur). Främre är till vänster. (B) Ventral vy av en vuxen hona P. hawaiensis visar embryon synliga i yngelpåsen (blå streckad kontur). Främre är till vänster. (C) Embryon som frigörs från kull påse utvecklas normalt i FASW. En mängd olika stadier som sträcker sig från S1 till kläckning är visade, arrangerade enligt Browne et al 5 Skalstreck = 1 mm i (A) och (B),. 500 um i (C).51073/51073fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2. Åtta cell stadium embryon av P. hawaiensis. (A) Live åttacellstadiet (stadium S4 5) unmanipulated embryo, som består av fyra micromeres (mindre celler) och fyra macromeres (större celler). (B) Schematisk bild av en åttacellstadiet embryo visar cell öde beteckningar alla blastomeres i en vild typ embryo som avslöjades av härstamning spårning baserat på fluorescerande markörer 6. (C) Live S4 skede embryo som har haft g blastomere bort med det nuvarande protokollet. Det inringade området visar området som tidigare upptogs av g blastomere; denåterstående micromeres har skiftat läge något som en följd av ablationen av g.. Skala bar = 250 nm i (A) och (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Wire verktyg som används för att avlägsna embryona från yngel påse. Verktyget visas här gjordes genom insättning av en volframtråd in i den smala änden av en pasteurpipett och försiktigt smältning av glas för att täta kabeln på plats, sedan med pincett för att införa en mjuk kurva i viran. Andra verktyg som är lämpliga för att ta bort embryon från yngelpåsen inkluderar trubbiga pincett eller ett glas kapillär med en förseglad och jämnas slut. Scale bar = 1 cm.

Figur 4
Figur 4. Glas nål som används för att punktera blastomeres under ablationsproceduren. Nålen visas här drogs på en Sutter P97 nål avdragare med hjälp av ett program med parametrarna 2 x (värme = 566, pull = 100, hastighet = 20 tid = 250) + 1 x (värme = 566, pull = 100, hastighet = 100, tid = 250). Andra instrument eller program kan användas för att dra nålar lämpliga för ablation, så länge de är av samma allmänna form som den som visas här. Skala bar = 1 cm.

Figur 5
Figur 5. Utvärdera resultaten av blastomere ablation under fosterutvecklingen. (A) Gonad region i en vild typ stadium S29 embryo strax före kläckning, visar könsceller märkta med anti-Vasa immunfärgning (pilspetsar). Den anti-Vasa antikropp som används här är specifik för P. hawaiensis Vasa (Linsler, Alwes och Extavour, opublicerade data). (B) Gonad region i ett skede S29 embryo som hade g blastomere avlägsnas vid åttacellstadiet, visar avsaknaden av könsceller vilket framgår av avsaknad av specifika anti-Vasa signal i gonad regionen (pilspetsar). Skala bar i (A) = 100 nm och gäller även (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Ablation runda # Ablationsbehandlad # (%) Överlevdetill 50% utveckling # (%) Överlevde till 90-100% utveckling
1 49 41 (83,7) 6 (12,2)
2 48 46 (95,8) 17 (35,4)
3 31 25 (80,6) 22 (71,0)
4 97 72 (74,2) 56 (57,7)
5 108 100 (92,6) 65 (60,2)
6 50 36 (72,0) 37 (74,0)
TOTAL 383 320 (83,6) 203 (53,0)

Tabell 1. Representative ablation överlevnadstatistik. Efter micromere ablation, har överlevnaden gjorde både inom de första 50% av utvecklings (5-6 dagar vid 25 ° C) och sedan på 90-100% utveckling (10-12 dagar vid 25 º C). Ablation rundor 1-6 är representativa exempel på experiment som utförs av en enskild forskare (AR Nast) i kronologisk ordning under loppet av åtta månader. Forskare bör finna att, som visas här, överlevnaden till 90-100% utveckling ökning med erfarenhet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi beskriver ett protokoll för manuell ablation och fullständigt fysiskt avlägsnande av enskilda blastomeres från tidiga klyvningsstadier märlkräftan P. hawaiensis. Vi demonstrerar användning av detta protokoll genom att ta bort den enda könsceller prekursorcell g från en åttacellstadiet embryo, och visa att ablation har varit framgångsrikt genom att bekräfta frånvaro av g: s dotterceller senare i embryogenes. Detta protokoll kan användas för att ta bort någon av de micromeres från embryot vid tidiga klyvningssteg. För att använda detta protokoll för att ta bort macromeres i detta skede, eller blastomeres vid första eller andra klyvningssteg, kan användarna helt enkelt tillämpa de smärre ändringar för att skapa en något större hål i chorion i steg 4.4, och applicera tryck och sug under en längre tid för att ta bort den större volymen av cellinnehåll vid steg 4,6. Vi har funnit att efter användning av detta protokoll, är un utveckling av de återstående blastomeres efter ablationpåverkas med avseende på klyvnings och cellrörelsemönster åtminstone fram till tidpunkten för gastrulation 23.

Detta protokoll kan vara användbart för fortsatt utredning av utvecklingspotentialen i tidiga klyvnings blastomeres i denna märlkräfta. Många frågor återstår att besvaras i detta område, bland annat varför vissa celler men inte andra kan ändra öden för att ersätta dem med borttagen blastomeres, och den exakta tidpunkten och mekanismer av dessa reglerande förändringar. Protokollet kan också modifieras för att rymma ablation av mer än en cell, genom att helt enkelt upprepa steg 4,2-4,7 omväxlande till blastomerer av intresse.

Det är viktigt att använda en högkvalitativ stereomikroskop med lämplig belysning för att visa och korrekt identifiera de tidiga klyvnings blastomeres. Vi finner att i sidled infallande vitt ljus från en fiberoptisk kall ljuskälla är den mest användbara för detta ändamål. Infallande ljus direkt ovanför specimsv skapar reflektioner som kan skymma de cellulära morfologier och gränser, medan transmitterade ljuset inte penetrera den täta gulan av embryona och blastomerer är därför svåra att särskilja. Det är mest användbart för urglas eller petriskål med embryon som skall placeras på en svart yta snarare än en vit eller genomskinlig glasytan, eftersom det ger bäst kontrast till de bleka embryon.

En begränsning till detta protokoll är att blastomere av intresse måste vara korrekt och entydigt identifieras innan du börjar. Fotoablation tekniker skulle vara mer användbart för forskare nytt till systemet, eftersom embryona kan lämnas att utvecklas under några spaltningscykler efter injektion av fluorescerande färg 28, och identiteten av den injicerade blastomere bekräftade efter injektion, men före fotoablation, genom att analysera mönster av de cellulära ättlingar, som har väl beskrivits i tidigare cellinjeokänd analyserar 6,23. När forskarna känner till P. hawaiensis embryo och kan identifiera alla blastomeres med tillförsikt, kan den manuella ablation som beskrivs här användas för tillämpningar där fullständig fysisk borttagning av en blastomere, snarare än att döda cellen utan att ta bort döda cellkroppen från embryot, är önskvärt.

Detta förfarande kan i princip användas för att ta bort enstaka blastomeres från embryon klyvning skede av andra holoblastically spjälka kräftdjur eller andra marina organismer eller sötvattensdjur vars chorions eller gödslings membran kan inte enkelt tas bort. Modifikationer kan innefatta användning av inkubation medium med lämpliga salthalts egenskaper och att modifiera formen på nålen för att rymma mer ömtåliga membran (längre, tunnare nålar) eller mer robusta embryonala Beläggningar (kortare, snabbt avsmalnande nålar).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Vi tackar Rayhan Arif och Hassan Shahawy för kameraarbete, Tripti Gupta och Frederike Alwes för hjälp förfina cell ablation tekniken, och Extavour lab medlemmar för återkoppling på data, video och manuskript. Detta arbete har delvis stöd av Harvard Stem Cell Institute (Seed Grant nummer SG-0057-10-00) i Ellison Medical Foundation (New Scholar Award nummer AG-NS-07.010-10) till CGE, och Harvard College Research Program utmärkelser till ARN.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 cm Pasteur pipette Wheaton 53499-630 VWR For transferring intact and blastomere-ablated embryos from dish to dish.
22 cm Pasteur pipette Wheaton 53499-632 VWR For making mouth pipette tips.
3 cm Petri dishes Thermo Scientific 25382-334 VWR Use some unaltered to collect and store embryos; coat some with a layer of Sylgard (see below) to create a working surface for blastomere ablations.
48-well Plates Greiner Bio-One 82051-004 VWR For culturing embryos following ablation.
Bottle top filters 0.2 µm Nalge Nunc International 28199-296 VWR For creating FASW (See below).
Bunsen burner VWR 89038-530 VWR For creating tungsten wire tool and fine tip of mouth pipette.
Diamond scribe Musco Sports Lighting 52865-005 VWR For creating wide-mouthed Pasteur pipettes for collecting couples.
Forceps Fine Science Tools 11050-10 Fine Science Tools For holding anaesthetized females during removal of embryos from brood pouch. These do not have to be fine-tipped Dumont forceps - the tips can be at least as blunt as those of the forceps for which the catalogue number is listed here.
Fungizone-Amphotericin B Sigma A2942 Sigma Aldrich Add to FASW to a final concentration of 1 mg/ml, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos.
Glass capillaries 4 in long, 1/0.58 OD/ID (mm) World Precision Instruments 1B100-4 World Precision Instruments For making needles for puncturing the blastomere to be ablated.
Glass watchglass 300 mm diameter Electron Microscopy Sciences 70543-30 Electron Microscopy Sciences For use in removing embryos from the brood pouch of anesthetized females.
Instant Ocean Artificial Sea Water (ASW) Instant Ocean IS160 Aquatic EcoSystems Make ASW by dissolving salt in deionized water to a salinity of 1.022-1.024.
Instant Ocean Filtered Artificial Sea Water (FASW) Instant Ocean IS160 Aquatic EcoSystems Use 0.2 µm filters to sterilize ASW. Make up in small amounts (< 250 ml) as needed.
Kimwipes Kimberly-Clark 21905-026 VWR For safely breaking off the fine end of Pasteur pipettes modified for collecting couples.
Mouth pipette adaptor Drummond Labware A5177-5EA Sigma Aldrich Insert the fine pulled Pasteur pipette tip into this end, to be used for removing extruded cell contents during the ablation procedure.
Mouth pipette tubing Aldrich Z280356 Sigma Aldrich Cut this to be long enough to comfortably hang around your neck during the ablation procedure.
Needle Puller Sutter Instrument Company P97 Sutter Instrument Company For making needles from glass capillaries for puncturing the blastomere to be ablated.
Penicillin-Streptomycin Solution Mediatech 45000-650 VWR Add to FASW to a final concentration of 100 units/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos.
Rubber bulb Electron Microscopy Sciences 100488-418 VWR For using Pasteur pipettes to transfer embryos from dish to dish.
Sylgard 184 K. R. Anderson, Inc. NC9659604 Fisher Scientific Make up according to manufacturer's instructions. Pour a layer 2-5 mm thick into a 3cm petri dish to create a working surface for blastomere ablations.
Tungsten wire 0.004 inches diameter A-M Systems 719000 A-M Systems Use this to make a tool for removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. Chapter 3. Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual Volume. , CSHL Press. 373-404 Forthcoming.
  2. Sander, K. Pattern formation in insect embryogenesis: the evolution of concepts and mechanisms. Int. J.Insect Morphol. Embryol. 25, 349-367 (1997).
  3. Regier, J. C., et al. Arthropod relationships revealed by phylogenomic analysis of nuclear protein-coding sequences. Nature. 463, 1079-1083 (2010).
  4. Extavour, C. G. The fate of isolated blastomeres with respect to germ cell formation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis. Dev. Biol. 277, 387-402 (2005).
  5. Browne, W. E., Price, A. L., Gerberding, M., Patel, N. H. Stages of embryonic development in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis. Genesis. 42, 124-149 (2005).
  6. Gerberding, M., Browne, W. E., Patel, N. H. Cell lineage analysis of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis reveals an early restriction of cell fates. Development. 129, 5789-5801 (2002).
  7. Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. Fixation and dissection of Parhyale hawaiensis embryos. Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).
  8. Price, A. L., Patel, N. H. Investigating divergent mechanisms of mesoderm development in arthropods: the expression of Ph-twist and Ph-mef2 in Parhyale hawaiensis. J. Exp. B. Dev. Evol. 310, 24-40 (2008).
  9. Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. In situ hybridization of labeled RNA probes to fixed Parhyale hawaiensis embryos. Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).
  10. Browne, W. W., Schmid, B. G. M., Wimmer, E. A., Martindale, M. Q. Expression of otd orthologs in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis. Dev. Genes Evol. 216, 581-595 (2006).
  11. Prpic, N. M., Telford, M. J. Expression of homothorax and extradenticle mRNA in the legs of the crustacean Parhyale hawaiensis: evidence for a reversal of gene expression regulation in the pancrustacean lineage. Dev. Genes Evol. 218, 333-339 (2008).
  12. Kizil, G., Havemann, J., Gerberding, M. Germ cells in the crustacean Parhyale hawaiensis depend on Vasa protein for their maintenance but not for their formation. Dev. Biol. 327, 320-239 (2009).
  13. Liubicich, D. M., et al. Knockdown of Parhyale Ultrabithorax recapitulates evolutionary changes in crustacean appendage morphology. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13892-13896 (2009).
  14. Pavlopoulos, A., et al. Probing the evolution of appendage specialization by Hox gene misexpression in an emerging model crustacean. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13897-13902 (2009).
  15. Vargas-Vila, M. A., Hannibal, R. L., Parchem, R. J., Liu, P. Z., Patel, N. H. A prominent requirement for single-minded and the ventral midline in patterning the dorsoventral axis of the crustacean Parhyale hawaiensis. Development. 137, 3469-3476 (2010).
  16. Simanton, W., et al. Conservation of arthropod midline netrin accumulation revealed with a cross-reactive antibody provides evidence for midline cell homology. Evol. Dev. 11, 260-268 (2009).
  17. Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. Antibody staining of Parhyale hawaiensis embryos. Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).
  18. Pavlopoulos, A., Averof, M. Establishing genetic transformation for comparative developmental studies in the crustacean Parhyale hawaiensis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 7888-7893 (2005).
  19. Kontarakis, Z., et al. A versatile strategy for gene trapping and trap conversion in emerging model organisms. Development. 138, 2625-2630 (2011).
  20. Zeng, V., et al. De novo assembly and characterization of a maternal and developmental transcriptome for the emerging model crustacean Parhyale hawaiensis. BMC Genom. 12, 581 (2011).
  21. Zeng, V., Extavour, C. G. ASGARD: an open-access database of annotated transcriptomes for emerging model arthropod species. Database. , (2012).
  22. Nestorov, P., Battke, F., Levesque, M. P., Gerberding, M. The Maternal Transcriptome of the Crustacean Parhyale hawaiensis Is Inherited Asymmetrically to Invariant Cell Lineages of the Ectoderm and Mesoderm. PLoS ONE. 8, (2013).
  23. Alwes, F., Hinchen, B., Extavour, C. G. Patterns of cell lineage, movement, and migration from germ layer specification to gastrulation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis. Dev. Biol. 139, 110-123 (2011).
  24. Ewen-Campen, B., Schwager, E. E., Extavour, C. G. The molecular machinery of germ line specification. Mol. Reprod. Dev. 77, 3-18 (2010).
  25. Price, A. L., Modrell, M. S., Hannibal, R. L., Patel, N. H. Mesoderm and ectoderm lineages in the crustacean Parhyale hawaiensis display intra-germ layer compensation. Dev. Biol. 341, 256-266 (2010).
  26. Fraser, S. E., Harland, R. M. The molecular metamorphosis of experimental embryology. Cell. 100, 41-55 (2000).
  27. Olsson, L. A clash of traditions: the history of comparative and experimental embryology in Sweden as exemplified by the research of Gösta Jägersten and Sven Hörstadius. Theory Biosci. 126, 117-129 (2007).
  28. Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. Injection of Parhyale hawaiensis blastomeres with fluorescently labeled tracers. Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).
  29. Chaw, R., Patel, N. H. Independent migration of cell populations in the early gastrulation of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis. Dev. Biol. 371, 94-109 (2012).
  30. Schmitz, E. H. Crustacea Microscopic Anatomy of Invertebrates. Microscopic Anatomy of Invertebrates. Harrison, F. W. 9, Wiley-Liss, Inc.. 443-528 (1992).

Tags

Utvecklingsbiologi Amphipod experimentell embryologi micromere könsceller ablation utvecklingspotential,
Ablation av en enda cell från åtta-cell Embryon av märlkräftan Kräftdjur<em&gt; Parhyale hawaiensis</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nast, A. R., Extavour, C. G.… More

Nast, A. R., Extavour, C. G. Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis. J. Vis. Exp. (85), e51073, doi:10.3791/51073 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter